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문제 정의
- oxidase로서 처음 두 단계의 反應을 촉매하는 tyrosinase의 作用에 의해 시작된다. 따라서 본 硏究에서 tyrosinase 酵素의 活性에 미치는 EFV의 影響을 調査하기 위하여, EFV 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 3일 후 tyrosinase 活性을 測定하였다. 對照群(100 ± 3.
- 따라서 본 연구에서 EFV가 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 기본 배지만을 사용한 것을 대조군으로 하고, EFV를 처리하였을 때 tyrosinase 활성을 분석한 결과 200 ㎍/㎖농도에서 약간 억제하였으나 유의성은 없었다(Fig.
- 버섯 tyrosinase를 이용하여 EFV가 tyrosinase 酵素에 직접 작용하여 효소 활성에 영양을 줄 수 있는 지 조사하였다. 實驗 結果, EFV 12.
- 이에 저자는 韓醫學的으로 皮毛는 肺臟과 心臟의 연관성이 있고, 浙貝母 또한 肺ㆍ心 二經에 作用하는 藥物이므로 浙貝母의 皮膚 美白 效果에 관련된 效能을 알아보고자 B16F10 黑色腫細胞를 이용하여 tyrosinase 活性과 멜라닌 生成에 미치는 影響을 觀察하고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 發現變化를 觀察하여 분석하였다.
제안 방법
- 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 2×104 개씩 분주하고 24시간 培養 후 浙貝母에탄올추출물을 여러 濃度로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 serum starvation으로 24시간 培養하였다.
- 6-well 배양용기에 B16F10 細胞를 8×104 개씩 분주하여 24시간 培養한 후, 浙貝母에탄올추출물을 100 ㎍/㎖, 200㎍/㎖로 處理하고 1시간 후 α-MSH(100 nM)를 處理하였다. 3일간 培養 후 PBS로 2회 세척하고, 5 mM EDTA가 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer(SPB, pH 6.8) 1 ㎖에 1%(V/V) triton X-100과 0.1%(V/V) 0.1 M PMSF를 混合한 lysis buffer를 200 ㎕ 씩 분주하고 細胞를 수거하여 얼음에서 30분간 溶解시킨 다음 4℃, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 活性 測定에 사용하였다. 단백질 定量은 Bradford 試藥으로 595 nm에서 吸光度를 測定하여 동량의 단백질 양을 計算하였으며, 계산된 단백질과 0.
- 6-well 배양용기에 B16F10 細胞를 8×104 개씩 분주하여 24시간 培養한 후, 浙貝母에탄올추출물을 100 ㎍/㎖, 200㎍/㎖로 處理하고 1시간 후 α-MSH(100 nM)를 處理하였다.
- B16F10 細胞를 10 cm 배양용기에 3×105 개씩 細胞를 부착시키고 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖씩 浙貝母에탄올추출물을 處理하고 1시간 후 α-MSH(100 nM)를 處理하여 3일 동안 培養하였다.
- B16F10 細胞를 6 ㎝ 배양용기에 1×105 개씩 분주하여 細胞를 부착시키고 浙貝母에탄올추출물을 處理하여 2일간 培養한 후 B16F10 세포를 위상차도립현미경(inverted phasecontrast microscope)를 이용하여 觀察하였다.
- B16F10 細胞를 chamber slide에 7×103 개씩 분주한 후 24시간 培養하고, 浙貝母에탄올추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖씩 處理한 다음 1시간 뒤 α-MSH(100 nM)를 처리하였다.
- 5% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. Nitrocellulose membrane로 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, tyrosinase, actin, TRP-1, TRP-2의 antibody를 1:500으로 희석 하여 각각 室溫에서 1시간 30분 동안 反應시켰다. TBST로 3회 세척한 후, tyrosinase, actin, TRP-1 및 TRP-2는 anti-Goat polyclonal IGg HRP conjugate 2차 antibody를 1:1000으로 희석 하여 실온에서 1시간 동안 反應시켰다.
- 1% L-DOPA와 室溫에서 4시간 反應시켰다. PBS로 2회 세척하고 10% formalin 용액으로 30분간 固定한 후 PBS로 2회 세척 하고 에탄올로 脫水시킨 다음 封入하여 광학현미경으로 觀察하였다.
- Nitrocellulose membrane로 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, tyrosinase, actin, TRP-1, TRP-2의 antibody를 1:500으로 희석 하여 각각 室溫에서 1시간 30분 동안 反應시켰다. TBST로 3회 세척한 후, tyrosinase, actin, TRP-1 및 TRP-2는 anti-Goat polyclonal IGg HRP conjugate 2차 antibody를 1:1000으로 희석 하여 실온에서 1시간 동안 反應시켰다. TBST로 세척한 후 ECL 용액으로 發色 후 ChemiDoc을 이용하여 band의 사진을 撮影하였다.
- TBST로 3회 세척한 후, tyrosinase, actin, TRP-1 및 TRP-2는 anti-Goat polyclonal IGg HRP conjugate 2차 antibody를 1:1000으로 희석 하여 실온에서 1시간 동안 反應시켰다. TBST로 세척한 후 ECL 용액으로 發色 후 ChemiDoc을 이용하여 band의 사진을 撮影하였다.
- Effect of EFV on tyrosinase activity in B16F10 cells. The effect on tyrosinase activity was tested control, 100 and 200 ㎍/㎖ of EFV for 3 days. Results are expressed as percent of control.
- 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 2×104 개씩 분주하고 24시간 培養 후 浙貝母에탄올추출물을 여러 濃度로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 serum starvation으로 24시간 培養하였다. 培養 후 0.05%(W/V) MTT 용액을 넣어 3시간 培養한 다음 상층액을 除去하고, 형성된 formazen을 DMSO(1 ㎖)로 녹여서 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 吸光度를 測定하였다.
- 培養 후 각 군당 2×106 개씩 수거하여 lysis buffer(5 mM EDTA, 0.1 M SPB(pH 6.8), 0.1% triton X-100)로 細胞를 溶解하였다.
- 浙貝母 200 g에 100% 에탄올 2 ℓ를 가하여 6일 동안 실온에서 抽出하였다. 抽出物은 거즈로 濾過하고 減壓 濃縮한 다음 凍結乾燥 하여 3.
- 浙貝母에탄올추출물(ethanol extract of Fritillaria verticillata Willd., EFV)이 B16F10 細胞에 미치는 毒性을 조사하기 위하여 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 濃度로 처리하고 24일간 培養한 후 MTT 方法으로 細胞의 生存率을 測定하였다. 實驗 結果 EFV를 12.
- 1 M PMSF를 混合한 lysis buffer를 200 ㎕ 씩 분주하고 細胞를 수거하여 얼음에서 30분간 溶解시킨 다음 4℃, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 活性 測定에 사용하였다. 단백질 定量은 Bradford 試藥으로 595 nm에서 吸光度를 測定하여 동량의 단백질 양을 計算하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB(pH 6.8)의 總量이 150㎕가 되도록 분주 하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 反應시켰으며, 30분 간격으로 405 nm에서 吸光度의 變化를 測定하였다.
- 멜라닌 定量은 Hosei 등의 方法13)을 변형하여 使用하였다. 직경 10 ㎝ 배양용기에 3×105 개씩 분주하여 24시간 培養한 후, 浙貝母에탄올추출물 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖씩 처리하고 3일간 培養하였다.
- 3A). 멜라닌 生合成 抑制效果를 육안적으로 관찰하기 위하여 EFV를 100㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 濃度로 培養한 다음 細胞를 수거하여 pellet의 멜라닌 色素를 比較하였다. 實驗 結果 멜라닌 色素는 EFV의 處理時間과 濃度에 비례하여 減少하였으며, 특히 浙貝母에탄올추출물 200 ㎍/㎖를 處理한 群은 對照群에 비하여 멜라닌 색소가 顯著하게 抑制되는 것으로 觀察되었다(Fig.
- 멜라닌 生合成에 미치는 EFV의 효과를 조사하기 위하여 B16F10細胞에 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 3일 동안 培養한 다음 각 군당 2×106 개의 細胞를 수거하여 멜라닌색소를 測定하였다.
- 직경 10 ㎝ 배양용기에 3×105 개씩 분주하여 24시간 培養한 후, 浙貝母에탄올추출물 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖씩 처리하고 3일간 培養하였다.
- 한의학적으로 皮毛는 肺臟과 心臟의 二經과 연관성이 있고, 절패모 또한 肺ㆍ心 二經에 작용하는 약물인 점에 착안하여 절패모의 피부 미백 효과에 관련된 효능을 알아보고자 B16F10 흑색종세포를 이용하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 관찰하고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 實驗에 사용된 浙貝母(Fritillaria verticillata Willd. var. thunbergii Bak., 中國)는 (주)사이버경동시장에서 購入한 것을 使用하였다.
- 한국 세포주은행에서 分讓받은 B16F10 細胞를 5% FBS가 첨가된 DMEM을 使用하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 培養하였다.
데이터처리
- 實驗 結果는 student t-test를 이용하여 p-value를 구하여 有意性을 검증하였다.
이론/모형
- EFV가 멜라닌 生成에 관련된 主要 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 調節하는지 알아보기 위해 Western blot을 施行하였다. 實驗 結果 EFV 100㎍/㎖, 200 ㎍/㎖농도에서 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 減少시키지 않은 것으로 나타났다(Fig.
- 細胞內 tyrosinase 活性은 Martinez-Esparza 등의 方法14)으로 測定하였다. 6-well 배양용기에 B16F10 細胞를 8×104 개씩 분주하여 24시간 培養한 후, 浙貝母에탄올추출물을 100 ㎍/㎖, 200㎍/㎖로 處理하고 1시간 후 α-MSH(100 nM)를 處理하였다.
- 細胞生存率 측정은 Mosmann의 方法12)에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 2×104 개씩 분주하고 24시간 培養 후 浙貝母에탄올추출물을 여러 濃度로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 serum starvation으로 24시간 培養하였다.
성능/효과
- EFV가 멜라닌 生成에 관련된 主要 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 調節하는지 알아보기 위해 Western blot을 施行하였다. 實驗 結果 EFV 100㎍/㎖, 200 ㎍/㎖농도에서 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 減少시키지 않은 것으로 나타났다(Fig. 7).
- 實驗 結果 EFV를 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 處理한 군에서 細胞生存率은 對照群(100 ± 3.11%)과 比較하여 각각 97.3 ± 4.5%, 95.1 ±6.6%, 93.2 ± 1.4%로 나타났다(Fig. 1).
- 멜라닌 生合成 抑制效果를 육안적으로 관찰하기 위하여 EFV를 100㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 濃度로 培養한 다음 細胞를 수거하여 pellet의 멜라닌 色素를 比較하였다. 實驗 結果 멜라닌 色素는 EFV의 處理時間과 濃度에 비례하여 減少하였으며, 특히 浙貝母에탄올추출물 200 ㎍/㎖를 處理한 群은 對照群에 비하여 멜라닌 색소가 顯著하게 抑制되는 것으로 觀察되었다(Fig. 3B)
- 버섯 tyrosinase를 이용하여 EFV가 tyrosinase 酵素에 직접 작용하여 효소 활성에 영양을 줄 수 있는 지 조사하였다. 實驗 結果, EFV 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 處理한 전 實驗群에서 tyrosinase 酵素의 活性은 抑制되지 않는 것으로 나타났다(Fig. 6).
- 對照群(100 ± 0.64%)의 멜라닌 量과 比較한 結果 EFV 100 ㎍/㎖ 농도에서 57.9 ± 0.7%, EFV 200 ㎍/㎖ 농도에서 35.1 ± 3.6%로 멜라닌색소가 현저히 減少하였다(Fig. 3A).
- 對照群(100 ± 3.48%)을 기준으로 EFV 100 ㎍/㎖에서 99 ± 2.98%, 200 ㎍/㎖에서 94 ± 1.67%로 tyrosinase 活性이 거의 減少되지 않았다(Fig. 4).
- 본 실험 결과에서 EFV는 멜라닌색소의 생성을 매우 효과적으로 억제하였으나 tyrosinase 활성도와 tyrosinase 단백질 발현에 영향을 주지 않은 것으로 나타났다. 따라서 EFV는 tyrosinase 활성이 아닌 다른 경로를 통하여 멜라닌의 생성을 억제할 것으로 사료된다.
- 최근 Matsuki 등(2008)은 glutathione이 tyrosinase와 L-DOPA의 결합을 억제함으로서 멜라닌의 합성을 저해한다고 보고하였다. 본 실험 결과 EVF는 tyrosinase의 활성을 억제하지 않았으나 멜라닌의 생성을 감소시켰다. 따라서 EVF는 tyrosinase와 L-DOPA의 결합을 저해하여 멜라닌의 생성을 억제하였을 가능성이 있다30).
- 본 실험 결과에서 EFV는 멜라닌색소의 생성을 매우 효과적으로 억제하였으나 tyrosinase 활성도와 tyrosinase 단백질 발현에 영향을 주지 않은 것으로 나타났다. 따라서 EFV는 tyrosinase 활성이 아닌 다른 경로를 통하여 멜라닌의 생성을 억제할 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 EFV가 버섯 tyrosinase 활성도에 미치는 영향을 조사한 결과 전혀 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다(Fig. 7). 멜라닌은 알카리 용해도 및 발색특성에 따라 흑갈색멜라닌(eumelanin)과 적색멜라닌(pheomelanin)으로 구분하며, 모두 tyrosine을 기질로 하여 합성된다.
- 본 연구는 EFV가 멜라닌의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 세포에서 멜라닌색소를 측정한 결과 EFV 100 ㎍/㎖에서 57.9%, 200 ㎍/㎖에서 35.1%로 현저하게 멜라닌색소의 生成을 감소시켰다(Fig. 3). 이는 EFV의 細胞 毒性이 없는 농도에서 멜라닌의 합성이 감소되었음을 의미하고(Fig.
- 이상의 결과 B16F10세포에서 EFV의 멜라닌 생성 억제효과는 tyrosinase 효소 억제 기전을 경유하지 않고 다른 경로를 통하여 이루어질 것으로 사료된다.
- 이상의 결과 EFV는 B16F10세포에서 멜라닌 생성을 매우 효과적으로 억제하였다. 그러나 일반적인 경로인 tyrosinase 효소 억제 기전을 경유하지 않는 또 다른 경로를 통하여 멜라닌 생성이 조절되고 있음을 시사해 주고 있다.
후속연구
- 그러나 일반적인 경로인 tyrosinase 효소 억제 기전을 경유하지 않는 또 다른 경로를 통하여 멜라닌 생성이 조절되고 있음을 시사해 주고 있다. 따라서 추후 멜라닌 생성의 과정에 관여하는 다른 기전에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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