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문제 정의
- pylori 균의 감염과 관련된 연구는 매우 부족하다. 이에 본 연구에서는 구강 내 H. pylori 발현 상태가 구강작열감증후군과 관련성이 있는지를 알아보고자 21명의 구강작열감증후군 환자와 21명의 대조군의 협점막, 혀의 배면 그리고 타액에서 표본을 채취한 후 nested PCR을 시행 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 구강 내 H. pylori 발현상태가 구강작열감증후군과 관련성이 있는지를 알아보고자 구강작열감증후군을 가진 환자의 타액과 구강 내 협 점막, 혀의 배면에서 표본을 채취하여 nested PCR을 시행한 결과 다소의 지견을 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Ethidium bromide(0.5 ㎍/㎖)가 포함된 1.5% agarose gel 상에 5㎕의 중합효소연쇄반응 산물을 전기영동 한 후 UV Transilluminator를 이용하여 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 분석하였다. Marker로는 100bp DNA Ladder(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다(Fig.
- H. pylori genomic DNA의 첫 번째 PCR을 위해 10 mM Tris-HCl(pH9.0), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 250 ㎛의 dNTP, 그리고 1U의 Tag DNA Polymerase가 포함된 AccuPower PCR Premix(Bioneer, Daejeon, Korea)에 5 ㎕의 주형 DNA와 각각 Primer (20 pmole/㎕) 1 ㎕씩을 넣고 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 8-mop를 넣었다. 모든 PCR은 첫 온도순환에 앞서 94℃에서 5분간 가열한 다음 94℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 60초로 이루어진 총 33회의 온도 순환 후 72℃에서 5분간 반응시켰다.
- 5 mM MgCl2, 250㎛의 dNTP, 그리고 1U의 Tag DNA Polymerase가 포함된 AccuPower PCR Premix (Bioneer, Daejeon, Korea)에 2 ㎕의 첫 번째 PCR 산물과 각각 프라이머(20 pmole/㎕) 1 ㎕씩을 넣고 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 8-mop를 넣었다. PCR 온도 조건은 첫 온도순환에 앞서 94℃에서 5분간 가열한 다음 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 60초로 이루어진 총 33회의 온도순환 후 72℃에서 5분간 반응시켰다.
- 5 mM MgCl2, 250 ㎛의 dNTP, 그리고 1U의 Tag DNA Polymerase가 포함된 AccuPower PCR Premix(Bioneer, Daejeon, Korea)에 5 ㎕의 주형 DNA와 각각 Primer (20 pmole/㎕) 1 ㎕씩을 넣고 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 8-mop를 넣었다. 모든 PCR은 첫 온도순환에 앞서 94℃에서 5분간 가열한 다음 94℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 60초로 이루어진 총 33회의 온도 순환 후 72℃에서 5분간 반응시켰다.
- 연구대상자의 협점막, 혀의 배면에서 구강점막세포를 채취하고 혀 밑에서 타액을 멸균된 면봉으로 채취 후 각각 1.5 ㎖ microcentrifuge tube에 넣어 DNA 추출 전까지 냉동 보관하였다.
- 채취된 샘플로부터 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 다음과 같이 DNA를 추출하였다.
- 한편, 모든 PCR 증폭 시에 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)도 매번 동시에 증폭하여 오염여부와 위양성의 가능성을 배제하였다. 프라이머 및 양성 대조군은 HEPY primer set (Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하였으며, 모든 PCR 과정은 MiniCyclerTM(MJ Research, Massachusetts, U.S.A)에서 수행하였다.
대상 데이터
- 2009년 3월부터 2011년 1월까지 조선대학교 치과병원 구강내과에 내원하여 구강작열감증후군으로 진단을 받은 환자군 21명 [남자 2명, 여자 19명(평균연령 66세)]과 구강 내 이상 증상이 없는 대조군 21명 [남자 2명, 여자 19명(평균연령 70세)]을 대상으로 하였다.
- 5% agarose gel 상에 5㎕의 중합효소연쇄반응 산물을 전기영동 한 후 UV Transilluminator를 이용하여 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 분석하였다. Marker로는 100bp DNA Ladder(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다(Fig. 1).
데이터처리
- Nested PCR 분석결과에 따른 구강작열감증후군 환자군과 대조군의 H. pylori 발현율의 차이는 Z-test for comparing two binomial proportions 를 이용하여 검정하였다. 샘플 채취 부위에 따른 H.
- pylori 발현율의 차이는 Z-test for comparing two binomial proportions 를 이용하여 검정하였다. 샘플 채취 부위에 따른 H. pylori 발현율의 환자군과 대조군의 비교는 Z-test for comparing two binomial proportion를 이용하여 검정하였으며, 환자군과 대조군에서 샘플 채취 부위별 차이는 Cochran 검정을 실시하였다.
성능/효과
- 1. Nested PCR 분석을 시행한 후 표본채취 부위 중한 개 이상에서 양성으로 나타난 경우가 구강작열감증후군환자에서 6명(29%), 대조군에서 3명(14%) 이었다 (p>0.05).
- 2. 구강작열감증후군 환자의 협점막, 혀의 배면 그리고 타액에서 3명(14%), 2명(10%), 4명(19%)이 양성을 나타내었으며, 대조군에서는 혀의 배면과 타액에서만 2명(10%) 과 1명(5%)이 양성을 나타내었다(P>0.05).
- Nested PCR 분석을 시행한 후 전기영동 한 결과, 표본 채취 부위 중 한 개 이상에서 양성으로 나타난 경우가 구강작열감증후군환자에서 6명(29%), 대조군에서 3명(14%) 이 있으며 두 그룹간 발현율의 비교에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05) (Table 1).
- 구강 내 3개 부위에서 샘플을 채취하여 nested PCR을 시행한 결과 구강작열감증후군 환자의 협점막, 혀의 배면 그리고 타액에서 3명(14%), 2명(10%), 4명(19%)이 양성을 나타냈으며, 대조군에서는 혀의 배면과 타액에서 2명(10%)과 1명(5%)이 양성을 나타내었다. 샘플채취 부위 별 각 그룹간에 차이와 각 그룹에서 샘플 채취부위별 발현율의 비교에 있어서 유의한 차이는 없었다(P>0.
- pylori 감염과의 관련성에 대한 연구는 Gall-Troselj 등15)의 연구 외에는 찾아 볼 수 없었는데, 이 연구에서는 구강작열감증후군환자를 혀에서만 증상이 나타나는 그룹과 혀 이외에서 증상이 나타나는 그룹으로 나누어 두 그룹 모두 혀의 배면에서 채취한 샘픔을 가지고 nested PCR을 시행한 결과 각각 12%, 13%를 나타내었다고 보고하였다. 본 연구에서는 구강작열감증후군 환자군에서 29%가 nested PCR에 양성반응을 보였는데, 본 연구에서 양성반응은 협점막, 혀의 배면 그리고 타액에서 채취한 샘플 중 한 개 이상에서 양성으로 나온 경우를 결과치로 산정하여 계산하였기 때문에 구강작열감증후군환자에서 양성반응은 Gall-Troselj 등의 연구에서 보다 다소 높게 나온 것으로 생각된다. 그리고 본 연구에서 두 그룹간에 통계적인 차이성은 보이지 않았는데 환자 군의 임상적인 발현양태를 위에서 언급한 3가지 형태로 분류하여 연구하지 않아 H.
- 본 연구에서는 구강작열감증후군 환자에서 협점막, 혀의 배면 그리고 타액 표본에서 발현율은 각각 14%, 10%, 19%, 대조군에서는 혀의 배면과 타액에서만 10%와 5%의 발현율을 나타내 Gebara 등과 강 등의 연구 결과와 유사하였으며, 구강작열감증후군 환자에서 혀의 배면에서 발현율 만을 비교할 때도 Gall-Troselj 등의 연구 결과와 유사하였다.
- 샘플채취 부위 별 각 그룹간에 차이와 각 그룹에서 샘플 채취부위별 발현율의 비교에 있어서 유의한 차이는 없었다(P>0.05)(Table 2).
- 이상의 결과로 구강 내 H. pylori와 구강작열감증 후군과는 관련성이 없음을 추론할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구에서는 구강작열감증후군 환자군에서 29%가 nested PCR에 양성반응을 보였는데, 본 연구에서 양성반응은 협점막, 혀의 배면 그리고 타액에서 채취한 샘플 중 한 개 이상에서 양성으로 나온 경우를 결과치로 산정하여 계산하였기 때문에 구강작열감증후군환자에서 양성반응은 Gall-Troselj 등의 연구에서 보다 다소 높게 나온 것으로 생각된다. 그리고 본 연구에서 두 그룹간에 통계적인 차이성은 보이지 않았는데 환자 군의 임상적인 발현양태를 위에서 언급한 3가지 형태로 분류하여 연구하지 않아 H. pylori 가 구강작열감증후군과 관련되어 있음을 정확하게 입증하기가 어려웠다고 사료된다.
- 하지만, 향후 보다 정확한 분석을 위해서는 많은 구강작열감증후군 환자를 대상으로 환자를 임상적 3가지 발현 양상으로 분류하여 구강 내 증상을 나타내는 부위에 따라 샘플을 채취한 후 분석이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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