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문제 정의
- 담배식물체에 일시적 형질전환하여 ChyB 전사체 발현 정도를 RT-PCR을 이용해 비교 분석하였으며, 항산화실험을 통해 최종산물인 oxy-carotenoids의 발현량을 예측할 수 있었다. 이런 결과를 토대로 원예작물에 외래 유용 유전자를 도입하여 항산화 효과가 우수한 zeaxanthin 및 astaxanthin 등의 함유량을 증진시킨 새로운 기능성 토마토 및 다양한 원예작물의 신품종 개발의 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 100mM MES, 200μM acetosyringone/DMSO를 넣어 OD값(600nm)이 0.5가 되면 주사기를 이용하여 잎의 뒷면에 Agro-infiltration 하였다.
- cDNA 2μL(1/10 volume)을 template로 하여 ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 25 cycles(94℃, 2분 denaturation; 55℃, 1분 annealing; 72℃, 1분 extension)의 PCR을 하였다. Actin 전사체를 internal control로 이용하여 ChyB transcript 발현 정도를 비교 분석하였다.
- Agro-infiltration 하기 전의 담배 잎을 0DAI로, 감염 후 1, 2, 3일째 잎을 채취하여 액체질소로 곱게 마쇄 한 후 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, German)을 이용하여 total RNA를 추출 하고 UV spectrophotometer로 정량 하였다. RT-PCR 용 cDNA 합성은 SuperScriptTMIII first strand synthesis system(Invitrogen, USA)을 이용하여 총 반응용액 20μL(1μg total RNA, 2.
- 2, and 4A). PCR 후 A-tailing된 ChyB 유전자 단편을 pGEMT Easy vector에 클로닝한 후 NotI 제한효소로 자른 후 pBluescript SK+ vector에 sub-cloning하였다. pBlue-ChyB와 pIG121Hm을 XbaI과 SacI 두 가지 제한효소로 GUS 유전자를 제거한 나머지 pIG121Hm에 ligation 하였다.
- 5 Kbp ChyB유전자 단편을 획득하였다. QIAquick Gel Extraction kit(QIAgen, German)를 이용하여 아가로즈 젤에서 분리하고 pGEM-T Easy vector system1(Promega, USA)에 클로닝하고 pT-ChyB로 명명하였다. Binary vector에 클로닝하기 위하여 먼저 pBlusescript SK+에 서브클로닝하고 pBlue-ChyB로 명명하였다.
- RT-PCR 용 cDNA 합성은 SuperScriptTMIII first strand synthesis system(Invitrogen, USA)을 이용하여 총 반응용액 20μL(1μg total RNA, 2.5μM oligo dT-프라이머, 0.5mM dNTP mix, 1X RT buffer, 5μM DTT, 40units RNaseOUT, 200units SuperScriptIII reverse transcriptase)를 가지고 역전사 반응을 수행하였다.
- cDNA 2μL(1/10 volume)을 template로 하여 ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 25 cycles(94℃, 2분 denaturation; 55℃, 1분 annealing; 72℃, 1분 extension)의 PCR을 하였다.
- 5mM dNTP mix, 1X RT buffer, 5μM DTT, 40units RNaseOUT, 200units SuperScriptIII reverse transcriptase)를 가지고 역전사 반응을 수행하였다. cDNA 합성을 위한 PCR 반응조건은 65℃, 5분; 4℃, 2분; 25℃, 5분; 50℃, 50분; 70℃, 15분 후 4℃에서 holding 순으로 실행하였다. cDNA 2μL(1/10 volume)을 template로 하여 ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 25 cycles(94℃, 2분 denaturation; 55℃, 1분 annealing; 72℃, 1분 extension)의 PCR을 하였다.
- PCR 후 A-tailing된 ChyB 유전자 단편을 pGEMT Easy vector에 클로닝한 후 NotI 제한효소로 자른 후 pBluescript SK+ vector에 sub-cloning하였다. pBlue-ChyB와 pIG121Hm을 XbaI과 SacI 두 가지 제한효소로 GUS 유전자를 제거한 나머지 pIG121Hm에 ligation 하였다. 모든 콜로니는 PCR로 확인하였다.
- 3g에 70% methanol 5mL을 첨가하여 60℃, 200rpm에서 3시간 동안 교반하여 추출한 다음, 이 추출액을 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리 한 후 상등액을 petri-dish에 옮겨 clean bench에서 휘발·농축 시켰다. 건조된 추출액에 멸균수 5mL를 첨가하여 일정한 농도의 현탁액을 만들었으며, 희석한 현탁액 1mL에 0.2mM의 DPPH용액 0.5mL를 첨가하여 혼합하고 30분 뒤에 UV spectrophotometer를 사용해서 517nm에서 흡광도를 측정하여 다음의 공식에 의해 DPPH 라디칼 소거능을 환산하였다.
- ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 결과, 주형이 cDNA이므로 intron 부분은 제외되고 exon 부분만 포함되어 있어 프라이머를 고안할 때 기대 되었던 637bp에서 유전자 특이적 밴드를 확인할 수 있었다. 그리고 actin 전사체를 internal control로 하여 도입 유전자의 전사체량을 비교하였다(Fig. 4B). 무처리구(0DAI) 담배 잎에서는 β-carotene hydroxylase 전사체 발현이 확인되지 않았지만, 일시적 형질전환 후 1DAI부터 증가하여 2DAI 최대 전사량을 보이고 3DAI부터 그 발현량이 감소하는 경향을 확인하였다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 재배종 토마토에서 β-carotene hydroxylase 유전자 ChyB를 분리하고, polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 증폭한 후 형질발현 vector를 구축하였다. 담배식물체에 일시적 형질전환하여 ChyB 전사체 발현 정도를 RT-PCR을 이용해 비교 분석하였으며, 항산화실험을 통해 최종산물인 oxy-carotenoids의 발현량을 예측할 수 있었다. 이런 결과를 토대로 원예작물에 외래 유용 유전자를 도입하여 항산화 효과가 우수한 zeaxanthin 및 astaxanthin 등의 함유량을 증진시킨 새로운 기능성 토마토 및 다양한 원예작물의 신품종 개발의 가능성을 제시하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 재배종 토마토에서 β-carotene hydroxylase 유전자 ChyB를 분리하고, polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 증폭한 후 형질발현 vector를 구축하였다.
- Sub-cloning 확인을 마친 토마토 ChyB 유전자를 binary vector인 35S 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터를 가진 pIG121Hm에 클로닝하고 pIG121-ChyB-tom로 명명하고 Agrobacterium tumefacience LBA4404에 열충격법으로 형질전환하여 transient assay에 이용하였다. 모든 재조합 vector들은 콜로니 PCR 확인 및 DNA sequencing하여 확인하였다.
- pBlue-ChyB와 pIG121Hm을 XbaI과 SacI 두 가지 제한효소로 GUS 유전자를 제거한 나머지 pIG121Hm에 ligation 하였다. 모든 콜로니는 PCR로 확인하였다. 형질발현 vector 구축을 위한 모식도를 Fig.
- 담배 잎은 수분공급을 충분히 하여 기공이 열린 상태에서 준비된 Agrobacterium cell을 100mM MES와 200μM acetosyringone/DMSO과 섞어서 잎 뒷면에 주사기를 이용하여 infiltration 하였다. 실험 후, 3일 동안 잎을 샘플링하여 액체질소로 급동결 후 -80℃에 보관 하고, total RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 pIG12-ChyB-tom vector를 도입 후 과발현으로 인한 토마토 ChyB 전사체 형질발현 정도를 확인하였다. ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 결과, 주형이 cDNA이므로 intron 부분은 제외되고 exon 부분만 포함되어 있어 프라이머를 고안할 때 기대 되었던 637bp에서 유전자 특이적 밴드를 확인할 수 있었다.
- 5가 되면 주사기를 이용하여 잎의 뒷면에 Agro-infiltration 하였다. 실험직전 잎을 채취하여 대조구로 0 days after infiltration(DAI), 감염 후 1, 2, 3 DAI로 각각 샘플링 한 후 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.
- 토마토 식물체의 어린 잎을 액체질소로 곱게 마쇄하여 공급자 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, USA) 매뉴얼에 따라 gDNA를 추출하고, Wizard Plus SV Miniprep kit(Promega, USA)를 사용하여 pIG121-ChyB-tom pDNA를 분리하였다. 분리한 plasmid DNA는 UV spectrophotometer(S-3100, Scinco, Korea)로 정량 후 -20℃에서 보관하였다.
- 항산화 효과가 우수한 lycopene 성분이 많이 포함되어 있고 식미가 우수한 완숙토마토 재배종 ‘Momotaro’에서 1.5Kbp β-carotene hydroxylase 유전자 ChyB를 PCR을 이용해 분리하였다.
대상 데이터
- National Center for Biotechnology Information(NCBI) 사이트에서 토마토 ChyB DNA sequence(Accession No. y14810)를 찾고 토마토 ChyB 유전자 특이적 프라이머 FChyB(5'-AAGAAAGCCGAGATTGGCGGTTTG-3')와 RChyB(5'-CCGAAAGTAAGGCACGTTGGCAAT-3')를 이용해 PCR한 후 1.5 Kbp ChyB유전자 단편을 획득하였다.
- 본 실험에서 식물재료로 일본 다까이 종묘의 완숙 토마토(Lycopersicon esculentum M. cv. ‘Momotaro’)를 이용하여 β-carotene hydroxylase 를 합성하는 ChyB 유전자를 분리하였고, 토마토 ChyB 유전자의 일시적 형질발현 실험을 위해 담배(Nicotiana benthamiana L.) 종자를 영남대학교 생명공학부 식물분자육종연구실에서 분양 받아 온실(주간 28℃, 야간 23℃)에서 재배하였다.
- (2005)의 방법에 따라 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 대한 담배 잎 추출물의 전자 공여능을 측정하였다. 항산화 효능을 위한 시료는 감염 0DAI, 2DAI, 3DAI의 각 잎을 채취하여 액체질소로 곱게 마쇄한 후 methanol로 추출하여 사용하였다. 즉, 시료 1.
데이터처리
- 또한 Agro-infiltration 하기 전의 담배 잎(0DAI)을 대조구로 하였으며, 대조구와 처리구의 유의성을 검증하기 위하여 Student’s T-test를 실시하였다.
이론/모형
- Agro-infiltration이 담배 잎의 항산화 효능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Chen et al.(2005)의 방법에 따라 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 대한 담배 잎 추출물의 전자 공여능을 측정하였다. 항산화 효능을 위한 시료는 감염 0DAI, 2DAI, 3DAI의 각 잎을 채취하여 액체질소로 곱게 마쇄한 후 methanol로 추출하여 사용하였다.
- 3에 나타냈다. Agrobacterium-mediated infiltration 방법으로 담배로 일시적 형질전환을 하였다. 담배 잎은 수분공급을 충분히 하여 기공이 열린 상태에서 준비된 Agrobacterium cell을 100mM MES와 200μM acetosyringone/DMSO과 섞어서 잎 뒷면에 주사기를 이용하여 infiltration 하였다.
- Agrobacterium-mediated infiltration 방법으로 담배로 일시적 형질전환을 했다(Eskelin et al., 2010; Moon and Hefferon, 2007). pIG121-ChyB-tom을 포함한 형질전환된 Agrobacterium을 kanamycin 50μg･mL-1이 포함된 LB액체배지 seed culture 후 50mL 액체배지에 옮긴 후 28℃, 24시간 배양하였다.
- Binary vector에 클로닝하기 위하여 먼저 pBlusescript SK+에 서브클로닝하고 pBlue-ChyB로 명명하였다. Sub-cloning 확인을 마친 토마토 ChyB 유전자를 binary vector인 35S 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터를 가진 pIG121Hm에 클로닝하고 pIG121-ChyB-tom로 명명하고 Agrobacterium tumefacience LBA4404에 열충격법으로 형질전환하여 transient assay에 이용하였다. 모든 재조합 vector들은 콜로니 PCR 확인 및 DNA sequencing하여 확인하였다.
- 따라서 β-carotene hydroxylase 유전자(ChyB)를 토마토 잎에서 분리하고 binary 벡터에 클로닝 한 후 pIG121-ChyB-tom으로 명명하였다. 토마토 ChyB 유전자를 Agrobacterium-mediated infiltration 방법을 이용하여 생육 8주 된 담배 잎에 일시적 형질전환을 하였다. 감염 0, 1, 2, 3일 후 RT-PCR 한 결과 담배에서는 거의 발현되지 않았던 β-carotene hydroxylase 전사체가 감염 1일 후 부터 증가하여 2일 후 최대 전사량을 보이고 3일 후부터 감소하는 경향을 나타내었다.
성능/효과
- 0DAI, 2DAI, 3DAI의 결과를 Student’s paired T-test한 결과 P value는 0.0001이었고 SED(standard error of difference)가 0.067로 통계학적으로 매우 유의한 것으로 판정되었다.
- 실험 후, 3일 동안 잎을 샘플링하여 액체질소로 급동결 후 -80℃에 보관 하고, total RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 pIG12-ChyB-tom vector를 도입 후 과발현으로 인한 토마토 ChyB 전사체 형질발현 정도를 확인하였다. ChyB 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 결과, 주형이 cDNA이므로 intron 부분은 제외되고 exon 부분만 포함되어 있어 프라이머를 고안할 때 기대 되었던 637bp에서 유전자 특이적 밴드를 확인할 수 있었다. 그리고 actin 전사체를 internal control로 하여 도입 유전자의 전사체량을 비교하였다(Fig.
- 감염 0, 1, 2, 3일 후 RT-PCR 한 결과 담배에서는 거의 발현되지 않았던 β-carotene hydroxylase 전사체가 감염 1일 후 부터 증가하여 2일 후 최대 전사량을 보이고 3일 후부터 감소하는 경향을 나타내었다.
- 5와 같다. 대조구(0DAI)의 경우 21%의 DPPH radical 소거활성을 나타내었으며, 감염 2일 후에는 27%의 DPPH의 radical 소거 활성을 보여 처리구에서 항산화 활성이 증가된 것을 확인하였다. 0DAI, 2DAI, 3DAI의 결과를 Student’s paired T-test한 결과 P value는 0.
- 무처리구(0DAI) 담배 잎에서는 β-carotene hydroxylase 전사체 발현이 확인되지 않았지만, 일시적 형질전환 후 1DAI부터 증가하여 2DAI 최대 전사량을 보이고 3DAI부터 그 발현량이 감소하는 경향을 확인하였다(Fig. 4A).
- , 2008)의 방법을 이용하고 있다. 본 연구에서는 토마토에서 분리된 oxy-caroteinods 유전자를 다른 숙주식물인 담배 잎에 형질전환 하여 과발현을 유도함으로써 carotenoids 함량을 증가시키고 이에 따라 항산화 효과가 증가됨을 확인하였다. 따라서 이러한 연구 결과는 외래유전자의 과발현을 통한 기능성 원예작물 및 곡류 생산에 적용 가능할 것으로 기대된다.
- 감염 0, 1, 2, 3일 후 RT-PCR 한 결과 담배에서는 거의 발현되지 않았던 β-carotene hydroxylase 전사체가 감염 1일 후 부터 증가하여 2일 후 최대 전사량을 보이고 3일 후부터 감소하는 경향을 나타내었다. 이 결과를 바탕으로 감염 후 0, 2, 3일째 담배 잎을 채취하여 항산화 효능을 측정한 결과, 감염 2일 후 1,1-diphenyl-pricryl hydrazyl(DPPH) radical 소거 활성이 대조구에 비해 약 30% 증가하는 것을 확인하였다. 이 연구결과를 통해 외래 유용 유전자를 원예작물에 형질전환하여 항산화 및 항암효과가 우수한 zeaxanthin 및 astaxanthin 등 oxy-carotenoids의 함유량을 증진시킨 새로운 기능성 토마토 및 다양한 원예작물의 신품종 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이 결과를 통해 β-carotene hydroxylase 발현이 매우 낮은 담배 잎에 외래 ChyB 유전자를 형질전환시켰을 때 담배 잎에서도 β-carotene hydroxylase 전사체 발현량이 급증하는 것을 확인하였다.
- , 2010). 이런 결과들을 통해 ChyB 유전자의 RNA 전사량이 2DAI에 최대치를 이루고 최종산물인 oxy-carotenoids 인zeaxanthin 및 astaxanthin 함량이 2DAI에 증가하여 2DAI DPPH radical 소거활성 값이 대조구에 비해 약 3배 증가한 것으로 예측할수 있다. 일반적으로 산화적 스트레스는 암과 노화를 비롯하여 인체 내 여러 가지 질병을 유발한다.
후속연구
- 본 연구에서는 토마토에서 분리된 oxy-caroteinods 유전자를 다른 숙주식물인 담배 잎에 형질전환 하여 과발현을 유도함으로써 carotenoids 함량을 증가시키고 이에 따라 항산화 효과가 증가됨을 확인하였다. 따라서 이러한 연구 결과는 외래유전자의 과발현을 통한 기능성 원예작물 및 곡류 생산에 적용 가능할 것으로 기대된다.
- 이 결과를 바탕으로 감염 후 0, 2, 3일째 담배 잎을 채취하여 항산화 효능을 측정한 결과, 감염 2일 후 1,1-diphenyl-pricryl hydrazyl(DPPH) radical 소거 활성이 대조구에 비해 약 30% 증가하는 것을 확인하였다. 이 연구결과를 통해 외래 유용 유전자를 원예작물에 형질전환하여 항산화 및 항암효과가 우수한 zeaxanthin 및 astaxanthin 등 oxy-carotenoids의 함유량을 증진시킨 새로운 기능성 토마토 및 다양한 원예작물의 신품종 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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