[논문]배추에서 항암물질 phenylethylisothiocyanate의 다량 합성을 위한 myrosinase와 glutathione S-transferase 유전자 분리 및 이를 이용한 형질전환체 육성

박지현; 이수진; 김보령; 우은택; 이지선; 한은향; 이윤형; 박영두

배추에서 항암물질 phenylethylisothiocyanate의 다량 합성을 위한 myrosinase와 glutathione S-transferase 유전자 분리 및 이를 이용한 형질전환체 육성
Isolation of Myrosinase and Glutathione S-transferase Genes and Transformation of These Genes to Develop Phenylethylisothiocyanate Enriching Chinese Cabbage 원문보기

원예과학기술지 = Korean journal of horticultural science & technology, v.29 no.6, 2011년, pp.623 - 632

박지현 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 이수진 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 김보령 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 우은택 (캐로톱씨드 육종연구소) , 이지선 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 한은향 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 이윤형 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 박영두 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과)

초록
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본 연구는 배추에서 항암물질 PEITC의 함량을 높이기 위하여 PEITC 대사과정에서 관련 유전자인 myrosinase (MYR)와 Glutathione S-transferase(GST) 유전자를 분리하고 Agrobacterium tumefacien 형질전환 방법을 통하여 유전자 발현을 조절하였다. 분리된 MYR과 GST의 cDNA는 각각 1647bp와 624bp임을 확인하였고 pET system으로 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환을 위해서 MYR-과발현 벡터와 GST-발현억제 벡터를 제작하였으며 이를 이용하여 배추에 형질전환한 후 PCR 검정을 통해 MYR-과발현 벡터로 형질전환된 개체(IMS) 13개체를 GST-발현억제 벡터로 형질전환된 개체(IGA) 5개체를 선발하였다. 선발된 $T_0$ 개체는 $T_1$ 세대로 진전시켰으며 $T_1$ 형질전환 계통의 서던분석 결과 배추 genome내로 1-4 copy의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다. 유전자 발현양을 real-time RT PCR로 조사한 결과 IMS는 발현량이 1.03-4.25배 증가하였고 IGA는 26.42-42.22배 감소하였다. IMS와 IGA의 각 계통에서 PEITC의 농도를 GC-MS 방법을 이용하여 확인한 결과 IMS는 PEITC 함량이 형질전환이 되지 않은 대조군에 비해 최대 4.86배까지 증가한 계통을 확인하였고 IGA는 최대 3.89배까지 증가된 계통을 확인하였다. 최종적으로 본 연구를 통하여 항암물질 PEITC량의 증가를 보인 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

To increase the anti-carcinogens phenylethylisothiocyanate (PEITC), myrosinase (MYR), and glutathione S-transferase (GST), genes related to PEITC pathway were isolated and the gene expressions were regulated by Agrobacterium transformation. Isolated cDNAs, MYR, and GST genes were 1,647 bp and 624 bp, respectively, and the protein expression was confirmed through pET system. Thereafter, we constructed a sense-oriented over-expressing myrosinase (pBMY) and RNAi down-regulated GST (pJJGST) binary vectors for the Chinese cabbage transformation. After the transformation, thirteen over-expressing transgenic Chinese cabbage plants (IMS) with pBMY and five down-regulated ones (IGA) with pJJGST were selected by PCR analysis. Selected $T_0$ transgenic plants were generated to $T_1$ plants by self-pollination. Based on the Southern blot analysis on these $T_1$ transgenic plants, 1-4 copies of T-DNA were transferred to Chinese cabbage genome. Thereafter, RNA expression level of myrosinase gene or GST gene was analyzed through real-time RT PCR of IMS, IGA, and non-transgenic inbred lines. In case of IMS lines, myrosinase gene was increased 1.03-4.25 fold and, in IGA lines, GST gene was decreased by 26.42-42.22 fold compared to non-transgenic ones, respectively. Analysis of PEITC concentrations using GC-MS it showed that some IMS lines and some IGA lines increased concentrations of PEITC up to 4.86 fold and up to 3.89 fold respectively compared to wild type. Finally in this study IMS 1, 3, 5, 12, and 15 and IGA 1, 2, and 4 were selected as developed transgenic lines with increasing quantities of anti-carcinogen PEITC.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 배추에서 항암물질 PEITC의 함량을 높이기 위하여 PEITC 대사과정에서 관련 유전자인 myrosinase(MYR)와 Glutathione S-transferase(GST) 유전자를 분리하고 Agrobacterium tumefacien 형질전환 방법을 통하여 유전자 발현을 조절하였다. 분리된 MYR과 GST의 cDNA는 각각 1647bp와 624bp임을 확인하였고 pET system으로 단백질의 발현을 확인하였다.

제안 방법

21 ± 2℃, 암조건에서 3일 동안 공동배양한 절편체는 cefotaxime 200mg･L-1이 포함된 MS 기본액체배지에서 3회 반복하여 Agrobacterium을 제거해 주고 pJJGST는 hygromycin 5mg･L-1가 그리고pBMY는 phosphinotricin 20mg･L-1가 첨가된 선발배지(MS 기본배지, 3% sucrose, NAA 1mg･L-1, BA 4mg･L-1, AgNO3 4mg･L-1, acetosyringone 10mg･L-1, cefotaxime 200mg･L-1,0.8% bacto-agar, pH 5.8)에 치상하였다.
5’RACE 방법을 이용한 MYR 유전자의 완전장 cDNA 분리는 GeneRacerTM Kit(invitrogen, USA)을 사용하였다.
, 2009) 등에서 conserved된 유전자 지역을 blocking하여 유전자군(gene family)전체를 조절하여 목적 대사 경로를 조절하였다. GST RNAi 벡터 역시 효과적인 down regulation을 위해 GST의 conserved domain 분석을 하여 GST의 주요 기능인 GSH와 결합하는 위치와 substrate binding pocket을 목적으로 하는 부분이 포함되도록 GST유전자의 단편 570bp를 RNAi 벡터인 JJ374에 정방향과 역방향으로 삽입하였다. GST 단편을 정방향으로 삽입하기 위해 AscI과 AvrII의 제한효소 site를 결합시켰으며 역방향인 유전자 단편에는 SpeI과 SacI을 결합시켜 GST RNAi 벡터인 JJGST를 작성하였다(Fig.
GST RNAi 벡터 역시 효과적인 down regulation을 위해 GST의 conserved domain 분석을 하여 GST의 주요 기능인 GSH와 결합하는 위치와 substrate binding pocket을 목적으로 하는 부분이 포함되도록 GST유전자의 단편 570bp를 RNAi 벡터인 JJ374에 정방향과 역방향으로 삽입하였다. GST 단편을 정방향으로 삽입하기 위해 AscI과 AvrII의 제한효소 site를 결합시켰으며 역방향인 유전자 단편에는 SpeI과 SacI을 결합시켜 GST RNAi 벡터인 JJGST를 작성하였다(Fig. 3B).
2B and 2C). GST 유전자는 발현여부 확인 시 어려움은 없었으나 MYR의 경우 단백질이 불용해성으로 발현되어 변성 조건에서 Ni-NTA affinity 결합 검정을 진행하였다.
IMS와 IGA에서의 PEITC 함량을 wild type의 배추에 대비하여 측정하기 위해 GC-MS 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 시료는 줄기 기부로부터 3cm를 제거하고 그로부터 5cm 상단까지 채취하였다.
MYR 유전자 5’개시코돈 앞쪽에 NcoI을 결합하고 3’종결코돈 뒤쪽에 BamHI 제한효소 site를 결합하여 pCAMBIA3301(CAMBIA, Australia)에 삽입하여 과발현 벡터인 pBMY를작성하였다(Fig. 3A).
RT-PCR 방법은 one-step RT-PCR kit(ABgene, UK)를 이용하였으며 각각의 유전자마다 specific primer를 작성하여 1μg의 RNA를 49℃에서 30분 동안 cDNA를 합성한 후 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 90초를 1cycle로 하여 30cycle을 반응시키고 마지막 단계에 서 72℃, 5분 처리를 하였다.
Real-time RT PCR을 이용해 배추에 형질전환된 벡터 pBMY와 pJJGST가 목적에 맞게 발현이 조절된 것을 확인하였으며 IMS와 IGA에서의 발현량 증가와 감소가 실제로PEITC 생성에 영향을 주었는지 확인하기 위하여 GC-MS방법으로 PEITC 물질량 분석을 하였다. 형질전환된 배추에서 물질양을 조사하기 위해 시료를 준비하기 전 성숙모본에서의 각각의 형질전환체는 표현형으로 나타나는 원예적 형질[식물체(키), 바깥잎(크기, 모양, 잎면의 요철 등) 등]에 차이를 보이지 않았다.
T-DNA의 삽입이 확인된 T₁형질전환계통 IMS와 IGA에서 각각의 유전자가 발현된 수준을 정량적으로 확인하기 위하여 real-time RT PCR을 실시하였다. 실험은 총 3반복으로 실시하였으며, 각 실험의 결과는 delta-delta C_T values 법을 이용하여 유전자 발현량을 도출해 내었으며, melting analysis 법을 이용하여 증폭된 산물 결과의 신뢰성을 검증하였다(Livak and Schmittgen, 2001).
pBMY와 pJJGST vector를 Agrobacterium tumefaciens매개로 inbred 배추 품종에 형질전환하였다(Fig. 3C). pBMY로 형질전환된 배추는 IMS라 명명하였고 pJJGST로 형질전환된 개체는 IGA라 명명하였다.
각 유전자를 특이적으로 인식하는 real-time RT PCR용 primer로는 IMS는 MYRF: 5'- GTT GCA TCT GCT TAC CA -3', MYRR: 5'- TGT AGC CAG TAG CAT TGA GT -3'과 IGA는 GSTF: 5'- GGC AGG TAT CAA AGT TTT CG- 3', GSTR: 5'- TTG ATT CGA AGA GCT TGA GG -3'와 같으며, 대조 유전자로는 housekeeping 유전자인 actin을 이용하여 비교 분석하였다.
그 후 합성된 cDNA 1μg에 MYR antisense primer, GeneRacer^TM 5'primer, Tag polymerase를 첨가하여 PCR을 실시하였고 프로그램은 96℃에서 2분, 96℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40cycle 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 각각의 primer들로 증폭된 유전자는 1.0%의 agarose gel에 전기영동으로 확인하였고, 염기서열 분석을 위해 pGEM-T easy vector(promega,USA)에 삽입하고 T7과 SP6 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분리된 유전자의 단백질 domain 분석은 NCBI에서 제공하는 conserved domains search 프로그램을 이용하였다.
pBMY로 형질전환된 배추는 IMS라 명명하였고 pJJGST로 형질전환된 개체는 IGA라 명명하였다. 각각의 벡터로 형질전환되어 순화된 개체들은 IMS가 15개체, IGA가 6개체이었으며 IMS의 경우 선발마커인 bar 유전자를 목표로 하여 ppt 프라이머로 490bp PCR 산물의 유무로 형질전환체 선발을 하였고 IGA는 hygromycin 저항성 유전자를 목표로 하여 hpt 프라이머로 1149bp PCR 산물의 유무로 형질전환체 선발을 하였다. PCR 검정을 통해 순화된 개체들 중 형질전환체로 판단된 개체는 IMS가 13개체, IGA가 4개체이었다.
coli 발현시스템인 pET 벡터를 이용하였는데 GST 유전자는 pET-15b를, MYR 유전자는 pET-17b를 이용하였다. 각각의 유전자를 발현벡터에 삽입하기 위해 coding region에 GST 유전자는 NdeI과 BamHI, MYR는 HindIII과 SpeI의 제한효소 site를 결합시켜주고 PCR로 증폭하였다. 최종적으로 PCR 산물과 pET 벡터를 동시에 각각의 제한효소로 처리하여 삽입하였고 E.
그 후 합성된 cDNA 1μg에 MYR antisense primer, GeneRacerTM 5'primer, Tag polymerase를 첨가하여 PCR을 실시하였고 프로그램은 96℃에서 2분, 96℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40cycle 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.
따라서 본 연구에서는 배추에서 항암효과가 있는 유용물질인 PEITC의 합성 과정에 관여하는 주요 유전자인 MYR과 GST를 코딩하는 유전자를 분리하였고 유전자의 특성을 분석한 후 pET system을 통하여 단백질 발현을 확인하였다. 분리된 유전자는 PEITC 물질을 다량으로 유도하기 위하여 MYR 유전자는 과발현(over-expression)을 유도하는 vector를 제작하였고 GST유전자는 발현 억제(down-regulation)를 유도할 수 있는 vector를 제작하였다.
(분자량 163)로 정량되었다. 물질분석은 각 계통마다 오차를 줄이기 위해 3 반복으로 실시하였으며 물질량은 평균치를 제시하였다(Table 3). 그 결과 IMS 13개 계통과 IGA 4개의 계통에서 wild type의 배추에 비해 1.
배추에서 PEITC의 다량 합성을 위하여 MYR와 GST 유전자의 형질전환용 식물발현 vector를 제작하였다. 발현 조절을 위하여 MYR 유전자는 과발현이 되도록 over-expression 벡터(pBMY)를 작성하였고 GST 유전자는 그 기능을 억제시키기 위하여 RNAi 벡터(pJJGST)를 작성하였다. 벡터 작성의 자세한 내용은 결과 및 고찰에서 제시하였다.
배추에서 PEITC 물질을 효과적으로 다량 유도하기 위하여각 유전자의 형질전환 벡터를 제작하였다. MYR 유전자는 glucosinolate의 분해를 촉진시키기 위하여 과발현되도록 작성하여 중간산물인 aglycone을 더 많이 생성할 수 있도록 하였다.
배추에서 PEITC의 다량 합성을 위하여 MYR와 GST 유전자의 형질전환용 식물발현 vector를 제작하였다. 발현 조절을 위하여 MYR 유전자는 과발현이 되도록 over-expression 벡터(pBMY)를 작성하였고 GST 유전자는 그 기능을 억제시키기 위하여 RNAi 벡터(pJJGST)를 작성하였다.
배추종자를 ethanol과 sodium hypochlorite(NaOCl)로 소독한 후, 파종하여 기내생장시킨 개체에서 하배축을 절단하여 형질전환에 이용하였다. 절단된 하배축은 pBMY와 pJJGSTvector를 운반하는 각각의 Agrobacterium LBA4404 strain 용액에 접종하고, 공동배양배지[Murashige & Skoog(MS)기본배지, 3% sucrose, 0.
본 연구를 통하여 PETIC 대사과정에 관련된 MYR 유전자와 GST 유전자의 조절을 통한 항암물질 PEITC량의 증가를 각각의 유전자가 조절된 형질전환개체에서 확인하였으며 증가량이 대조개체(비형질전환체)에 비해 2배 이상 증가한 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다. 선발된 형질전환계통은 PEITC대사과정에서 하나의 경로만 조절한 결과이지만 합성 경로에서 두 곳을 동시에 조절한다면 PEITC 물질양의 증가률이 더욱 높아질 것이라 기대되며 추후 MYR 유전자와 GST 유전자를 집적시키기 위해 IMS와 IGA의 교배를 실시할 예정이다.
따라서 본 연구에서는 배추에서 항암효과가 있는 유용물질인 PEITC의 합성 과정에 관여하는 주요 유전자인 MYR과 GST를 코딩하는 유전자를 분리하였고 유전자의 특성을 분석한 후 pET system을 통하여 단백질 발현을 확인하였다. 분리된 유전자는 PEITC 물질을 다량으로 유도하기 위하여 MYR 유전자는 과발현(over-expression)을 유도하는 vector를 제작하였고 GST유전자는 발현 억제(down-regulation)를 유도할 수 있는 vector를 제작하였다. 완성된 각각의 vector로 배추 형질전환을 실시하였고 형질전환체 선발 후 Southern 분석으로 T-DNA copy 수를 확인하였으며 선발된 형질전환체에서의 MYR 유전자와 GST 유전자의 발현량을 real-time RT PCR 방법으로 분석하였다.
0%의 agarose gel에 전기영동으로 확인하였고, 염기서열 분석을 위해 pGEM-T easy vector(promega,USA)에 삽입하고 T7과 SP6 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분리된 유전자의 단백질 domain 분석은 NCBI에서 제공하는 conserved domains search 프로그램을 이용하였다.
분리한 RNA에 GeneRacerTM RNA oligo를 oligo dT primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤 GeneRacerTMRNA oligo로부터 유래된GeneRacerTM 5'primer와 MYR유래의 antisense primer를(Table 1) 첨가하고 PCR을 실시하여 분리하였다.
pET system을 이용한 유전자의 단백질 발현확인과 단백질 domain 분석

분리한 유전자들의 DNA 염기서열을 바탕으로 triplet codon에 의한 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 pET system을 이용한 발현실험을 수행하였다. 각 유전자는 6X histidine이 tagging된 벡터에 삽입되었으며 발현된 단백질의 크기는 GST 유전자는 pET-15b에서 약 29 KDa의 단백질을, MYR은 pET-17b 벡터로부터 약 65 KDa의 단백질을 확인할 수 있었다(Figs.
형질전환체로 선별된 T₀의 각 개체를 계통으로 하여 자가수분으로 T₁ 세대의 종자를 확보하였고 T₁ 세대 분석을 위해 획득한 종자를 파종을 하여 T₀ 세대와 같은 방법으로 계통별 1개체씩 형질전환체를 선발하였다. 선발된 T₁ 세대에서 배추 genome 내로 삽입된 T-DNA의 copy수를 Southern 분석으로 확인하였다. IMS 13계통과 IGA4라인을 각각 제한효소 HindIII를 처리하여 분석한 결과 1 copy로 밝혀진 계통은 IMS의 경우 6 계통, IGA의 경우 2 계통으로 밝혀졌고, 2 copy인 계통은 각각 4 계통, 1 계통이었으며 3 copy인 계통은 각각 2 계통, 1 계통으로 밝혀졌고 4 copy로 밝혀진 계통은 IMS에서 1계통이었다(Figs.
분리된 유전자는 PEITC 물질을 다량으로 유도하기 위하여 MYR 유전자는 과발현(over-expression)을 유도하는 vector를 제작하였고 GST유전자는 발현 억제(down-regulation)를 유도할 수 있는 vector를 제작하였다. 완성된 각각의 vector로 배추 형질전환을 실시하였고 형질전환체 선발 후 Southern 분석으로 T-DNA copy 수를 확인하였으며 선발된 형질전환체에서의 MYR 유전자와 GST 유전자의 발현량을 real-time RT PCR 방법으로 분석하였다. 최종적으로는 형질전환체에서 생성되는 PEITC 함량 분석을 실시하고 함량이 증가된 형질전환 계통을 선발･육성하였다.
절단된 하배축은 pBMY와 pJJGSTvector를 운반하는 각각의 Agrobacterium LBA4404 strain 용액에 접종하고, 공동배양배지[Murashige & Skoog(MS)기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, NAA 1mg･L-1, BA 4mg･L-1, AgNO3 4mg･L-1, acetosyringone 10mg･L-1, 0.8%plant agar, pH 5.8]에 치상하였다.
8)에 치상하였다. 절편체에서 발생된 callus를 동일한 조건의 선발배지에 옮겨 신초를 유도하였고, 유기된 신초는 발근배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, pH 5.8)에 옮겨 발근시켰다. pBMY가 삽입된 형질전환체는 IMS라 명명하였고 pJJGST가 삽입된 형질전환체를 IGA로 명명하였다.
실험에 사용된 시료는 줄기 기부로부터 3cm를 제거하고 그로부터 5cm 상단까지 채취하였다. 준비된 시료는 액체질소에서 마쇄한 후 1g을 측정하여 5mL의 물에서 30℃ 20분간 추출한 후 3mL의 용액을 2mL의 dichloromethane로 2번 분배한 다음 진공 농축한 후 GC-MS(VF-5MS, Varian, USA)로 분석하였다. 함량 정량은 PEITC 표준시료를 사용하여 검량곡선을 작성한 후 시료 내 PEITC 정량에 사용하였다.
완성된 각각의 vector로 배추 형질전환을 실시하였고 형질전환체 선발 후 Southern 분석으로 T-DNA copy 수를 확인하였으며 선발된 형질전환체에서의 MYR 유전자와 GST 유전자의 발현량을 real-time RT PCR 방법으로 분석하였다. 최종적으로는 형질전환체에서 생성되는 PEITC 함량 분석을 실시하고 함량이 증가된 형질전환 계통을 선발･육성하였다.
한편 작성된 RNAi 벡터가 small RNA가 제대로 형성되는지는 웹사이트 http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi를 통하여 RNAi vector 제작시 효과적으로 헤어핀 구조를 형성하는 것을 시뮬레이션하여 확인하였다(자료 미제시). 시뮬레이션은 RNAi 벡터에 삽입된 정방향의 GST 염기서열, 헤어핀을 이루는 rice waxy intron 1과 역방향으로 삽입된 GST 염기서열을 분석한 것으로 정방향과 역방향으로 삽입된 염기서열은 -1015.
형질전환된 배추의 선발을 위해 T₀세대에서 pBMY와pJJGST의 선발마커인 bar 유전자와 hygromycin저항성 유전자를 목표로 프라이머를 작성하고 이를 이용해 선발한 후 T1세대로 증식시켰다. 자가수분을 통하여 확보한 T₁세대의 형질전환체 역시 형질전환 여부를 확인하기 위해 PCR검정을 실시하였고 삽입된 T-DNA copy수를 확인하기 위해 Southern 분석을 실시하였다.
분리된 MYR과 GST의 cDNA는 각각 1647bp와 624bp임을 확인하였고 pET system으로 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환을 위해서 MYR-과발현 벡터와 GST-발현억제 벡터를 제작하였으며 이를 이용하여 배추에 형질전환한 후 PCR 검정을 통해 MYR-과발현 벡터로 형질전환된 개체(IMS) 13개체를 GST-발현억제 벡터로 형질전환된 개체(IGA) 5개체를 선발하였다. 선발된 T₀ 개체는 T₁세대로 진전시켰으며 T₁ 형질전환 계통의 서던분석 결과 배추 genome내로 1-4 copy의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다.
PCR 검정을 통해 순화된 개체들 중 형질전환체로 판단된 개체는 IMS가 13개체, IGA가 4개체이었다. 형질전환체로 선별된 T₀의 각 개체를 계통으로 하여 자가수분으로 T₁ 세대의 종자를 확보하였고 T₁ 세대 분석을 위해 획득한 종자를 파종을 하여 T₀ 세대와 같은 방법으로 계통별 1개체씩 형질전환체를 선발하였다. 선발된 T₁ 세대에서 배추 genome 내로 삽입된 T-DNA의 copy수를 Southern 분석으로 확인하였다.
형질전환체로 판명된 IMS와 IGA의 T1세대 개체에서 유전자의 발현 정도를 알아보기 위해 real-time RT PCR을 이용하여 정량적 분석을 하였다. Real-time RT PCR은 각각의 형질전환체에서 RNeasy^® Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 total RNA를 분리하였으며, SensiMix One-Step Kit(Quantace)에서 제공하는 방법에 따라 Rotor-Gene^TM 6000(Corbett, Australia)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

대상 데이터

MYR와 GST 유전자의 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 E. coli 발현시스템인 pET 벡터를 이용하였는데 GST 유전자는 pET-15b를, MYR 유전자는 pET-17b를 이용하였다. 각각의 유전자를 발현벡터에 삽입하기 위해 coding region에 GST 유전자는 NdeI과 BamHI, MYR는 HindIII과 SpeI의 제한효소 site를 결합시켜주고 PCR로 증폭하였다.
실험에 사용된 배추는 inbred line인 CT001(Carrotop seed company, An-Sung)이며 이를 파종하여 한 달 후에 어린잎을 채취하여 RNA 추출에 사용하였다. RNA 추출은 RNeasy Kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고 방법은 제조회사에서 제공한 방법에 따라 수행하였다.
IMS와 IGA에서의 PEITC 함량을 wild type의 배추에 대비하여 측정하기 위해 GC-MS 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 시료는 줄기 기부로부터 3cm를 제거하고 그로부터 5cm 상단까지 채취하였다. 준비된 시료는 액체질소에서 마쇄한 후 1g을 측정하여 5mL의 물에서 30℃ 20분간 추출한 후 3mL의 용액을 2mL의 dichloromethane로 2번 분배한 다음 진공 농축한 후 GC-MS(VF-5MS, Varian, USA)로 분석하였다.
89배까지 증가된계통을 확인하였다. 최종적으로 본 연구를 통하여 항암물질PEITC량의 증가를 보인 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다.

데이터처리

형질전환계통 IMS와 IGA에서 각각의 유전자가 발현된 수준을 정량적으로 확인하기 위하여 real-time RT PCR을 실시하였다. 실험은 총 3반복으로 실시하였으며, 각 실험의 결과는 delta-delta C_T values 법을 이용하여 유전자 발현량을 도출해 내었으며, melting analysis 법을 이용하여 증폭된 산물 결과의 신뢰성을 검증하였다(Livak and Schmittgen, 2001). IMS 형질전환 계통에서의 MYR 유전자 발현 정도는 wild type에 비하여 1.
세대에서 pBMY와pJJGST의 선발마커인 bar 유전자와 hygromycin저항성 유전자를 목표로 프라이머를 작성하고 이를 이용해 선발한 후 T1세대로 증식시켰다. 자가수분을 통하여 확보한 T₁세대의 형질전환체 역시 형질전환 여부를 확인하기 위해 PCR검정을 실시하였고 삽입된 T-DNA copy수를 확인하기 위해 Southern 분석을 실시하였다. 실험을 위한 genomic DNA 분리는 Cho et al.

이론/모형

PCR 반응은 IMS 형질전환체 선발을 위한 ppt 프라이머(F: 5’-GGT CTG CAC CAT CGT CAA CC-3’, R: 5’-TCA AAT CTC GGT GAC GGG CA-3’)와 IGA 형질전환체 선발을 위한 hpt 프라이머(F: 5'-TTT CCA CTA TGC GCG AGT AC-3', R: 5'-TGT CGA GAA GTT TCT GAT CGA -3')를 사용하여 수행하였으며 Southern 분석은 IMS와 IGA에서 분리된 genomic DNA 10μg을 제한효소 HindIII를 처리하여 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 McCouch et al.(1988)의 방법에 따라 수행하였다.
실험을 위한 genomic DNA 분리는 Cho et al.(1994)의 방법에 따라 수행하였다. PCR 반응은 IMS 형질전환체 선발을 위한 ppt 프라이머(F: 5’-GGT CTG CAC CAT CGT CAA CC-3’, R: 5’-TCA AAT CTC GGT GAC GGG CA-3’)와 IGA 형질전환체 선발을 위한 hpt 프라이머(F: 5'-TTT CCA CTA TGC GCG AGT AC-3', R: 5'-TGT CGA GAA GTT TCT GAT CGA -3')를 사용하여 수행하였으며 Southern 분석은 IMS와 IGA에서 분리된 genomic DNA 10μg을 제한효소 HindIII를 처리하여 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 McCouch et al.
PEITC 대사과정에 관련된 유전자 GST는 reverse transcription(RT)-PCR 방법, MYR는 5’RACE 방법을 이용하여 완전장의 cDNA를 분리하였다.
(D) The quantified analysis of mRNA accumulation of IGA. Quantified analysis was conducted by real-time RT PCR using delta-delta CT values method. The vertical T-bars indicate standard deviation.
실험에 사용된 배추는 inbred line인 CT001(Carrotop seed company, An-Sung)이며 이를 파종하여 한 달 후에 어린잎을 채취하여 RNA 추출에 사용하였다. RNA 추출은 RNeasy Kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고 방법은 제조회사에서 제공한 방법에 따라 수행하였다.
Real-time RT PCR은 각각의 형질전환체에서 RNeasy® Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 total RNA를 분리하였으며, SensiMix One-Step Kit(Quantace)에서 제공하는 방법에 따라 Rotor-GeneTM 6000(Corbett, Australia)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
coli 균주로는 BL21을 사용하여 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현은 Western 분석으로 확인하였다.

성능/효과

선발된 T₁ 세대에서 배추 genome 내로 삽입된 T-DNA의 copy수를 Southern 분석으로 확인하였다. IMS 13계통과 IGA4라인을 각각 제한효소 HindIII를 처리하여 분석한 결과 1 copy로 밝혀진 계통은 IMS의 경우 6 계통, IGA의 경우 2 계통으로 밝혀졌고, 2 copy인 계통은 각각 4 계통, 1 계통이었으며 3 copy인 계통은 각각 2 계통, 1 계통으로 밝혀졌고 4 copy로 밝혀진 계통은 IMS에서 1계통이었다(Figs. 4A and 4B).
실험은 총 3반복으로 실시하였으며, 각 실험의 결과는 delta-delta C_T values 법을 이용하여 유전자 발현량을 도출해 내었으며, melting analysis 법을 이용하여 증폭된 산물 결과의 신뢰성을 검증하였다(Livak and Schmittgen, 2001). IMS 형질전환 계통에서의 MYR 유전자 발현 정도는 wild type에 비하여 1.03-4.25배 가량 증가하여 발현됨을 확인하였으며, IGA 형질전환 계통에서의 GST 유전자가 wild type에 비하여 26.42-42.22배가량 발현량이 감소된 것을 확인하였다(Figs. 4C and 4D).
22배 감소하였다. IMS와 IGA의 각 계통에서 PEITC의 농도를 GC-MS 방법을 이용하여 확인한 결과 IMS는 PEITC 함량이 형질전환이 되지 않은 대조군에 비해 최대 4.86배까지 증가한 계통을 확인하였고 IGA는 최대 3.89배까지 증가된계통을 확인하였다. 최종적으로 본 연구를 통하여 항암물질PEITC량의 증가를 보인 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다.
각각의 벡터로 형질전환되어 순화된 개체들은 IMS가 15개체, IGA가 6개체이었으며 IMS의 경우 선발마커인 bar 유전자를 목표로 하여 ppt 프라이머로 490bp PCR 산물의 유무로 형질전환체 선발을 하였고 IGA는 hygromycin 저항성 유전자를 목표로 하여 hpt 프라이머로 1149bp PCR 산물의 유무로 형질전환체 선발을 하였다. PCR 검정을 통해 순화된 개체들 중 형질전환체로 판단된 개체는 IMS가 13개체, IGA가 4개체이었다. 형질전환체로 선별된 T₀의 각 개체를 계통으로 하여 자가수분으로 T₁ 세대의 종자를 확보하였고 T₁ 세대 분석을 위해 획득한 종자를 파종을 하여 T₀ 세대와 같은 방법으로 계통별 1개체씩 형질전환체를 선발하였다.
PEITC 물질분석을 위하여 표준시료를 사용하여 검량곡선을 작성한 결과 PEITC는 표준시료로부터 retention time이 7.06min임을 알 수 있었으며 표준검량곡선을 이용한 결과 함량이 0.02μg･g-1 F.W.(분자량 163)로 정량되었다.
8)에 옮겨 발근시켰다. pBMY가 삽입된 형질전환체는 IMS라 명명하였고 pJJGST가 삽입된 형질전환체를 IGA로 명명하였다.
분리한 유전자들의 DNA 염기서열을 바탕으로 triplet codon에 의한 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 pET system을 이용한 발현실험을 수행하였다. 각 유전자는 6X histidine이 tagging된 벡터에 삽입되었으며 발현된 단백질의 크기는 GST 유전자는 pET-15b에서 약 29 KDa의 단백질을, MYR은 pET-17b 벡터로부터 약 65 KDa의 단백질을 확인할 수 있었다(Figs. 2B and 2C). GST 유전자는 발현여부 확인 시 어려움은 없었으나 MYR의 경우 단백질이 불용해성으로 발현되어 변성 조건에서 Ni-NTA affinity 결합 검정을 진행하였다.
AY567974)의 cDNA는 1647bp이었다. 각각의 유전자의 염기 서열을 NCBI BLAST search 프로그램을 이용하여 상동성을 비교한 결과 GST의 경우 Brassica juncea와 98%의 상동성을 보였으며 MYR는 Brassica napus와 98%의 상동성을 보였다. 또한 유전자들의 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 GST는 214개, MYR는 549개의 아미노산으로 구성되어 있으며 각 유전자의 아미노산 서열을 Figs.
물질분석은 각 계통마다 오차를 줄이기 위해 3 반복으로 실시하였으며 물질량은 평균치를 제시하였다(Table 3). 그 결과 IMS 13개 계통과 IGA 4개의 계통에서 wild type의 배추에 비해 1.24배에서 4.86배까지 대부분 PEITC물질의 증가를 확인할 수 있었다.
, 2000). 따라서 myrosinase 유전자가 존재하는 식물체는 외부의 충격이 가해졌을 때나 해충으로부터 피해를 입었을 때 glycosyl hydrolase 기능을 띄며 glucosinolate를 분해하는 화학적 반응이 진행되는 것으로 분석되었다.
배추로부터 분리된 각 유전자들의 domain을 NCBI에서 제공하는 conserved domains search 프로그램을 통하여 분석한 결과(Figs. 2D and 2F) GST유전자는 phi계통의 유전자로써 항해충성의 효과를 보이는 그룹에 속해 있었다. GST C family와 N family는 식물에만 특이적으로 존재하는 그룹인 phi 계열의 subfamily며 C family에는 GSH binding site가 존재하며 N family는 substrate binding site가 존재한다.
본 연구는 배추에서 항암물질 PEITC의 함량을 높이기 위하여 PEITC 대사과정에서 관련 유전자인 myrosinase(MYR)와 Glutathione S-transferase(GST) 유전자를 분리하고 Agrobacterium tumefacien 형질전환 방법을 통하여 유전자 발현을 조절하였다. 분리된 MYR과 GST의 cDNA는 각각 1647bp와 624bp임을 확인하였고 pET system으로 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환을 위해서 MYR-과발현 벡터와 GST-발현억제 벡터를 제작하였으며 이를 이용하여 배추에 형질전환한 후 PCR 검정을 통해 MYR-과발현 벡터로 형질전환된 개체(IMS) 13개체를 GST-발현억제 벡터로 형질전환된 개체(IGA) 5개체를 선발하였다.
2A에 제시하였다. 분리된 각 유전자의 개시코돈을 시작으로 종결코돈까지의 cDNA크기가 GST 유전자(특허등록번호; 제10-0744612호, GenBank accession No. AY567976)는 642bp이며 MYR 유전자(특허등록번호: 제054493호, GenBank accession No. AY567974)의 cDNA는 1647bp이었다. 각각의 유전자의 염기 서열을 NCBI BLAST search 프로그램을 이용하여 상동성을 비교한 결과 GST의 경우 Brassica juncea와 98%의 상동성을 보였으며 MYR는 Brassica napus와 98%의 상동성을 보였다.
형질전환을 위해서 MYR-과발현 벡터와 GST-발현억제 벡터를 제작하였으며 이를 이용하여 배추에 형질전환한 후 PCR 검정을 통해 MYR-과발현 벡터로 형질전환된 개체(IMS) 13개체를 GST-발현억제 벡터로 형질전환된 개체(IGA) 5개체를 선발하였다. 선발된 T₀ 개체는 T₁세대로 진전시켰으며 T₁ 형질전환 계통의 서던분석 결과 배추 genome내로 1-4 copy의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다. 유전자 발현양을 real-time RT PCR로 조사한 결과 IMS는 발현량이 1.
cgi를 통하여 RNAi vector 제작시 효과적으로 헤어핀 구조를 형성하는 것을 시뮬레이션하여 확인하였다(자료 미제시). 시뮬레이션은 RNAi 벡터에 삽입된 정방향의 GST 염기서열, 헤어핀을 이루는 rice waxy intron 1과 역방향으로 삽입된 GST 염기서열을 분석한 것으로 정방향과 역방향으로 삽입된 염기서열은 -1015.40kal･mol^-1의 매우 낮은 자유에너지를 갖는 것으로 보아 결합이 매우 잘 됨을 보여주었다. 또한 헤어핀을 구성하는 intron 부위 역시 자유에너지가 높아 그 결합이 이루어지지 않아 올바른 헤어핀 구조를 보이고 있다고 판단되었다.
선발된 T₀ 개체는 T₁세대로 진전시켰으며 T₁ 형질전환 계통의 서던분석 결과 배추 genome내로 1-4 copy의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다. 유전자 발현양을 real-time RT PCR로 조사한 결과 IMS는 발현량이 1.03-4.25배 증가하였고 IGA는 26.42-42.22배 감소하였다. IMS와 IGA의 각 계통에서 PEITC의 농도를 GC-MS 방법을 이용하여 확인한 결과 IMS는 PEITC 함량이 형질전환이 되지 않은 대조군에 비해 최대 4.

후속연구

Glucosinolate가 분해되는 과정에서 MYR는 유용물질인PEITC의 생성을 유도하는 매개자로써 중요한 역할을 한다. MYR 효소의 기능이 활발할수록 glucosinolate로부터 생성되는 PEITC의 양이 증가할 것으로 기대된다. 또한 생성된 PEITC는 mercapturic acid pathway로 유입되는데(Wu et al.
MYR 효소의 기능이 활발할수록 glucosinolate로부터 생성되는 PEITC의 양이 증가할 것으로 기대된다. 또한 생성된 PEITC는 mercapturic acid pathway로 유입되는데(Wu et al., 2009) 이를 조절하는 첫 번째 단계 효소인 GST를 억제시키면 분해되는 PEITC의 양이 상대적으로 적어 생체 내 존재하는 PEITC 양은 증가할 것으로 기대된다.
본 연구를 통하여 PETIC 대사과정에 관련된 MYR 유전자와 GST 유전자의 조절을 통한 항암물질 PEITC량의 증가를 각각의 유전자가 조절된 형질전환개체에서 확인하였으며 증가량이 대조개체(비형질전환체)에 비해 2배 이상 증가한 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다. 선발된 형질전환계통은 PEITC대사과정에서 하나의 경로만 조절한 결과이지만 합성 경로에서 두 곳을 동시에 조절한다면 PEITC 물질양의 증가률이 더욱 높아질 것이라 기대되며 추후 MYR 유전자와 GST 유전자를 집적시키기 위해 IMS와 IGA의 교배를 실시할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	PEITC의 효과는?	ITC는 배추에서 PEITC, benzyl-isothiocyanate 및 3-phenylpropyl-isothiocyanate등의 형태로 존재하며 그 중 PEITC는암의 발달을 억제하는 항암물질로써 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 폐암 및 식도암 등에 효과가 있음이 보고되었다(Doerr-O'Rourke et al., 1991; Lai et al.
	Glucosinolate가 분해되는 과정에서 유용물질인 PEITC의 생성을 유도하는 매개자는?	Glucosinolate가 분해되는 과정에서 MYR는 유용물질인PEITC의 생성을 유도하는 매개자로써 중요한 역할을 한다. MYR 효소의 기능이 활발할수록 glucosinolate로부터 생성되는 PEITC의 양이 증가할 것으로 기대된다.
	isothiocynate는 배추에서 어떠한 형태로 존재하는가?	ITC는 배추에서 PEITC, benzyl-isothiocyanate 및 3-phenylpropyl-isothiocyanate등의 형태로 존재하며 그 중 PEITC는암의 발달을 억제하는 항암물질로써 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 폐암 및 식도암 등에 효과가 있음이 보고되었다(Doerr-O'Rourke et al., 1991; Lai et al.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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