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문제 정의
- 이에 저자는 陽虛證치료에 임상에서 상용되는 肉蓯蓉을 이용하여 갑상선기능저하증에 어떠한 효능을 나타내는지와 안전성에 문제가 없는지를 알아보기 위해 PTU 투여로 갑상선기능저하증을 유발시킨 rat를 이용하여 갑상선호르몬 및 관련 혈액학적 지표들을 분석하였다.
- 또한 安全理中湯의 구성 약재인 附子, 乾薑, 吳茱萸 등의 단일 약물을 갑상선기능저하증에 활용한 현대적 실험연구들이 모두 양호한 효과를 나타내어34-36), 補陽의 효능을 가진 한약재가 寒證을 나타내는 갑상선기능저하증에 효과를 보일 수 있다는 실험적 근거가 되었다. 이에 저자는 補陽藥인 肉蓯蓉이 갑상선기능저하증에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 본 실험을 계획하였다.
제안 방법
- 총량 1,000 g의 肉蓯蓉(Cistanche Deserticola)을 1,500 ㎖의 80% 에탄올에 넣어 heating mantle로 2시간 동안 가열 추출한 후 여과한 여액을 applicator를 이용하여 500 ㎖ 플라스크에 넣고 filter로 걸러냈다. 걸러진 여과액을 Rotary evaporator(Model: NE-1, 東京理化學株式會社, Japan)로 건조시키고, 동결 건조된 약제 1차 추출물 1 g씩을 10 ㎖의 증류수로 용해시킨 후 95℃ 수조에서 2시간 동안 재차 가열 추출하였다. 이들 추출물을 원심분리용 시험관에 담아 14,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 上淸液을 수거하였다.
- 생후 2개월 된 200±20 g의 Sprague-Dawley系 male rat(중앙실험동물, Korea)를 구입하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하며 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며, 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다. 그 후 정상군을 제외한 모든 동물군에 6-Propyl, 2-thiouracil(water supplement(Ca# P3755, 10g, sigma), 이하 PTU) 400 ㎎을 H2O 40 ㎖에 녹여 rat 체중 100 g당 0.2 ㎖/day씩 4주간 경피주사하여 갑상선기능저하증을 유발시켰다.
- SD male rat 6마리씩을 한 군으로 하여 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 실험군으로서 肉蓯蓉 500 ㎎/㎏ 투여군(Cistanche group) 및 양성대조군으로서 levothyroxine 투여군(LT4 group)으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군들은 PTU를 총 4주간 경피주사하여 갑상선기능저하증을 유발시켰다.
- 정상군을 제외한 나머지 군들은 PTU를 총 4주간 경피주사하여 갑상선기능저하증을 유발시켰다. 肉蓯蓉 투여군은 경피주사 개시 2주 후부터 肉蓯蓉 추출액을 생리식염수에 현탁하여 500 ㎎/㎏의 용량으로 Zonde를 이용하여 1日 1回 2주간 경구로 투여하였다. 대조군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 실험군과 동량의 생리식염수를 경구로 투여하였다.
- 肉蓯蓉 투여군은 경피주사 개시 2주 후부터 肉蓯蓉 추출액을 생리식염수에 현탁하여 500 ㎎/㎏의 용량으로 Zonde를 이용하여 1日 1回 2주간 경구로 투여하였다. 대조군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 실험군과 동량의 생리식염수를 경구로 투여하였다. Levothyroxine 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 levothyroxine(CA# T2376, 1g, sigma)을 0.
- 대조군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 실험군과 동량의 생리식염수를 경구로 투여하였다. Levothyroxine 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 levothyroxine(CA# T2376, 1g, sigma)을 0.5N NaOH isotonic saline에 250 ㎎/500 ㎖의 농도로 희석하여 0.1 ㎖/100 g의 용량으로 1日 1回 2주간 복강내 주사하였다(Table 1, Fig. 1).
- 체중측정은 실험 개시일에 최초 측정을 하였고, 이후 매주 1회 및 실험 마지막 날 sampling전에 마지막으로 측정하였다. 체중측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.
- 체중측정은 실험 개시일에 최초 측정을 하였고, 이후 매주 1회 및 실험 마지막 날 sampling전에 마지막으로 측정하였다. 체중측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea)을 이용하여 시행하였으며, 측정시 rat의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 rat를 올려놓고, rat가 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
- 실험 시작 4주째 rat의 심장에서 10 cc 채혈을 시행하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 다음 上淸液을 얻어 -40℃에 보관한 후 AST(Aspartate Transaminase), ALT(Alanine Transaminase), ALP(Alkaline Phosphatase), BUN(Blood Urea Nitrogen), creatinine, glucose, albumin, protein, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride의 생화학 분석을 시행하였다.
- 혈청 중 T3, T4, TSH 측정은 각각 Rodent T3 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Rodent T4 ELISA, Rodent TSH ELISA test kit(모두 Endocrine technologies Inc. USA)를 사용하였다. 실험 마지막 날 채혈하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 上淸液을 얻어 -40℃에 보관하였다.
- T3의 측정은 T3-antibody로 코팅된 microtiter wells에 준비된 샘플 50 ㎕씩과 standard T3 solution을 분주한 다음, 100 ㎕ T3 HRP-conjugate, 100 ㎕ TBM color solution, 50 ㎕ 2N HCl stop solution을 각각 분주한 후, ELISA reader를 사용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 T3을 측정하였다. T4과 TSH 측정 역시 유사한 방법으로 T4-antibody와 TSH-antibody로 코팅된 microtiter wells에 준비된 샘플 100 ㎕ 씩과 standard T4 및 TSH solution을 분주한 다음, 100 ㎕ T4 및 TSH enzyme conjugate, 100 ㎕ TBM color solution, 50 ㎕ 2N HCl stop solution을 각각 분주한 후, ELISA reader을 사용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 T4과 TSH를 측정하였다.
- 마지막 투약 다음날 체중을 측정하고 채혈 후 rat를 희생시켜 갑상선을 수술로 절제하였다. 채취된 갑상선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하고 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 다음 파라핀 용액에 담가 파라핀 블록을 만들었다.
- 마지막 투약 다음날 체중을 측정하고 채혈 후 rat를 희생시켜 갑상선을 수술로 절제하였다. 채취된 갑상선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하고 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 다음 파라핀 용액에 담가 파라핀 블록을 만들었다. 이후 microtome을 이용하여 4 ㎛의 두께로 각 갑상선조직을 관상으로 절편하여 gelatin coated slide에 부착시켰다.
- 이후 microtome을 이용하여 4 ㎛의 두께로 각 갑상선조직을 관상으로 절편하여 gelatin coated slide에 부착시켰다. 이렇게 만들어진 조직절편들은 조직염색을 위해 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직은 Hematoxyline-Eosin (HE)으로 염색하여 컴퓨터와 연결된 고해상도 카메라가 부착된 광학현미경(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan)이용하여 각각의 디지털 영상을 얻고, 400배 확대하여 비교하였다.
- 이렇게 만들어진 조직절편들은 조직염색을 위해 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직은 Hematoxyline-Eosin (HE)으로 염색하여 컴퓨터와 연결된 고해상도 카메라가 부착된 광학현미경(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan)이용하여 각각의 디지털 영상을 얻고, 400배 확대하여 비교하였다.
- 4주간의 PTU 경피주사, 2주간의 肉蓯蓉 경구투여 및 levothyroxine 복강 내 주사가 체중에 미치는 영향을 관찰하였다. 연구 시작 시점에 시행한 정상군, 대조군, 실험군 간의 체중측정 결과 각 군들에서 통계적으로 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 갑상선호르몬에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 T3, T4, TSH 농도를 측정하였다.
- 肉蓯蓉의 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 Rat의 갑상선 조직에 미친 영향을 알아보기 위해 갑상선을 추출하여 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색 후 광학현미경 하에서 조직학적으로 평가하였다. 정상군에서는 갑상선을 구성하고 있는 각 소엽과 하위조직인 여포(follicle)의 크기와 모양이 잘 유지되고 있으며, 여포이각 소엽의 크기와 간격 역시 잘 유지되어 있었다.
- 먼저 PTU 경피주사가 갑상선기능저하증을 잘 유발시켰는지와 과도한 독성을 유발하지 않았는지를 검증하기 위하여 정상군과 대조군에서 T3, T4, TSH 및 혈액학적 지표의 농도를 측정하였다. 갑상선기능저하증은 혈청 검사를 통해 확진이 이루어지며, 일차성 갑상선기능저하증의 경우 T4의 감소, T3의 정상 내지 감소, TSH의 증가로 진단한다6).
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 갑상선호르몬에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈청 T3, T4, TSH 농도를 측정하였다. T4 항목에서 肉蓯蓉 투여군과 levothyroxine 투여군 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 높은 T4 농도를 나타내었으며, TSH 항목에서는 肉蓯蓉 투여군과 levothyroxine 투여군 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 낮은 TSH 농도를 나타내었다.
- 肉蓯蓉이 PTU로 유발된 rat의 갑상선기능저하증에 미치는 효과를 연구하기 위하여 肉蓯蓉 투여에 따른 혈청 T3, T4, TSH의 변화 및 간독성, 신독성, 지질대사, 혈당, 단백대사에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 생후 2개월 된 200±20 g의 Sprague-Dawley系 male rat(중앙실험동물, Korea)를 구입하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하며 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며, 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
데이터처리
- 통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 4.03, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하여 전 군을 one-way analysis of variance(ANOVA)에 이어 tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다.
- 각각의 수치는 평균±표준편차(mean±S.D.)로 표시했으며, 양방 검정 유의도(Two-tailed p value)는 p값이 <0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.
성능/효과
- . 이러한 유사성을 바탕으로 하여 補陽의 효능을 가진 한약재가 寒證을 나타내는 갑상선기능저하증에 효과를 보일 수 있다는 실험적 근거가 되었다. 肉蓯蓉은 補陽藥에 속하면서도 성질이 燥熱하지 않아 寒性便秘를 치료하는 작용이 있으므로16) 갑상선기능저하증의 증상 중 하나인 변비도 동시에 개선시킬 수 있어 포괄적으로 갑상선기능저하증에 유효할 것으로 보인다.
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 간기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 ALP, AST, ALT 농도를 측정한 결과 3가지 관찰항목 모두에서 대조군과 肉蓯蓉 투여군 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다(Table 2)
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 신기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 BUN과 creatinine 농도를 측정한 결과 대조군과 肉蓯蓉 투여군 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 혈당에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 glucose 농도를 측정한결과 대조군과 肉蓯蓉 투여군 및 각 군 모두에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다(Table 4)
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 지질대사에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 HDL-cholesterol과 LDL-cholesterol, total cholesterol, triglyceride 농도를 측정한 결과 모든 항목에서 대조군과 肉蓯蓉 투여군 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 단백대사에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈중 albumin과 total protein 농도를 측정한 결과 모든 항목에서 대조군과 肉蓯蓉 투여군 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다(Table 6).
- 정상군에서는 갑상선을 구성하고 있는 각 소엽과 하위조직인 여포(follicle)의 크기와 모양이 잘 유지되고 있으며, 여포이각 소엽의 크기와 간격 역시 잘 유지되어 있었다. 대조군에서는 여포간의 결합조직이 위축되고 PTU에 의한 갑상선 호르몬의 형성이 억제되어 여포의 모양을 유지하지 못하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 여포내부의 Thyroglobulin과 결합한 colloid가 모두 비어있었으며, 여포사이의 간격도 좁아져있었다.
- levothyroxine투여군에서는 여포간 결합조직이 정상군에 비해서는 위축되어있으나, 대조군에 비해 여포강 내 콜로이드의 생성으로 불균일하게나마 여포를 유지하고 있는 것을 관찰할 수 있다. 또한 갑상선 epithelial cell의 증가 및 비후가 대조군에 비해 억제되어 있는 양상이 관찰되었다. 肉蓯蓉 투여군에서는 소포의 모양과 여포사이 간격이 정상군과 비슷하게 유지되고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서 대조군의 T3와 T4 농도는 정상군에 비해 통계적으로 유의성 있게 낮았다. 대조군의 TSH 농도는 정상군에 비해 통계적으로 유의성 있게 높았다. 따라서 본 실험에 사용된 동물모델은 갑상선 기능저하증이 효과적으로 유발되었음을 확인할 수 있었다.
- 대조군의 TSH 농도는 정상군에 비해 통계적으로 유의성 있게 높았다. 따라서 본 실험에 사용된 동물모델은 갑상선 기능저하증이 효과적으로 유발되었음을 확인할 수 있었다. 또한 다른 혈액학적 지표들에 있어서 정상군과 대조군사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 보이지 않아 과도한 독성을 유발하지 않았다는 사실도 확인하였다.
- 따라서 본 실험에 사용된 동물모델은 갑상선 기능저하증이 효과적으로 유발되었음을 확인할 수 있었다. 또한 다른 혈액학적 지표들에 있어서 정상군과 대조군사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 보이지 않아 과도한 독성을 유발하지 않았다는 사실도 확인하였다.
- 갑상선기능저하증 동물 모델에서 肉蓯蓉이 갑상선호르몬에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구 종료 후 혈청 T3, T4, TSH 농도를 측정하였다. T4 항목에서 肉蓯蓉 투여군과 levothyroxine 투여군 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 높은 T4 농도를 나타내었으며, TSH 항목에서는 肉蓯蓉 투여군과 levothyroxine 투여군 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 낮은 TSH 농도를 나타내었다. TSH는 시상하부-뇌하수체-갑상선 축의 되먹이기 기전에 의해 조절되므로 갑상선호르몬의 농도가 올라가면 TSH는 반대로 감소한다1).
- TSH는 시상하부-뇌하수체-갑상선 축의 되먹이기 기전에 의해 조절되므로 갑상선호르몬의 농도가 올라가면 TSH는 반대로 감소한다1). 따라서 본 실험의 결과는 肉蓯蓉이 갑상선호르몬의 합성에 효과가 있다는 뜻이다.
- 혈중 T3의 80～90%는 말초 조직 내에서 T4으로부터 전환된 것이며, T4에서 T3으로의 탈요오드화는 5`-탈요오드화효소에 의해 이루어지는데, 항갑상선제인 PTU는 이 효소의 활성을 억제한다6). 따라서 본 실험에서 T4의 농도가 증가하였음에도 불구하고 T3로의 탈요오드화가 PTU에 의해 억제되어 모든 군에서 T3 농도가 증가하지 않은 것으로 보인다.
- 이상의 結果를 종합해 볼 때, 肉蓯蓉은 PTU로 유발된 rat의 갑상선호르몬 합성을 촉진하며, 더욱이 간과 신장에 독성을 유발하지 않고, 혈당과 지질, 단백대사에도 큰 영향을 미치지 않는다는 결과를 얻었다. 따라서 肉蓯蓉은 갑상선기능저하증 치료에 안전하면서도 효과적인 약물로 활용될 수 있으리라 사료된다.
후속연구
- 이상의 연구에서 肉蓯蓉은 갑상선기능저하증 치료에 안전하면서도 효과적인 약물로 활용될 수 있으리라 사료된다. 단일 약재를 이용하여 갑상선기능저하증에 적용시킨 연구들을 살펴보면 약물의 농도에 비례하여 갑상선호르몬의 합성이 증가하는 경향을 보였으므로32), 향후 肉蓯蓉의 농도를 달리한 실험이 필요하다고 생각된다.
- 단일 약재를 이용하여 갑상선기능저하증에 적용시킨 연구들을 살펴보면 약물의 농도에 비례하여 갑상선호르몬의 합성이 증가하는 경향을 보였으므로32), 향후 肉蓯蓉의 농도를 달리한 실험이 필요하다고 생각된다. 추가적으로 세포, 분자수준의 연구를 통해 肉蓯蓉이 어떠한 기전으로 갑상선호르몬의 합성과 분비에 관여하는지를 밝히는 과정이 필요할 것이다.
- 따라서 肉蓯蓉은 갑상선기능저하증 치료에 안전하면서도 효과적인 약물로 활용될 수 있으리라 사료된다. 향후 levothyroxine과의 효능을 비교 연구하기 위하여 肉蓯蓉을 고용량으로 투여하는 실험이 필요할 것으로 생각되며, 또한 肉蓯蓉이 갑상선호르몬의 합성과 분비에 어떠한 기전으로 작용을 하는지에 대한 구체적인 연구가 뒷받침 되어야 할 것으로 보인다.
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