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문제 정의
- 본 연구는 고량강의 메탄올 추출물로부터 흡착 크로마토그래피에 의하여 분리한 분획에 대하여 광범위한 종양세포에 대하여 항암 효과 검색을 실시하였다. 항암 효과는 in vivo의 생체내 약리조건에 충족시킬 수 있는 hollow fiber assay를 이용하여, 20종의 종양세포에 대한 검색을 실시하였다.
- 본 연구에서는 고량강 추출물의 흡착 크로마토그래피 분획물로부터 항암 효과를 hollow fiber assay를 이용하여 검색하였고, 각 분획물에 대하여 항암효과에 영향을 미치는 성분에 대한 함량을 조사하였다.
- 고량강에 대한 항종양 효과로는 주로 in vitro에서 효과가 입증되었으며, 구체적으로 여러 종류의 종양세포주에 대하여 광범위한 검색과 in vivo에서는 평가되어 있지 않았다. 본 연구에서는 고량강의 MeOH 추출물을 Amberlite XAD 컬럼을 이용한 흡착 크로마토그래피 분획물로부터 항종양 효과를 hollow fiber assay를 이용하여 검색하였고, 각 분획물에 대하여 항종양 효과에 영향을 미치는 성분에 대한 함량을 조사하였다. 그 결과, 고량강의 함종양 활성은 MeOH 분획물에서 나타났으며, 특히 Colo-320, HCT116 및 WiDr와 같은 대장암 세포주에 활성을 나타내었다.
제안 방법
- 각 분획에 대한 분석을 위하여 HPLC(YMC-Pack ODS-A,250×20 ㎜, 이동상 MeOH-H2O gradient(MeOH 10～40%),Agilent 1100 series)로 분석하였고, 동정은 LC/MS로 확인하였다.
- 활성을 측정하고자 하는 시료는 매일 1회씩 5일간 복강 투여하였으며, 양성대조물질로는 5-fluorouracil(25 ㎎/㎏, LD50의 1/10값)을 동일하게 투여하였다. 각 시험물질의 투여농도는 MeOH 추출물은 2,000 ㎎/㎏, MeOH 분획 및 ethylacetate 분획은 100 ㎎/㎏으로 하였다. 대조군은 5% DMSO을투여하였다.
- 각 시험물질의 투여농도는 MeOH 추출물은 2,000 ㎎/㎏, MeOH 분획 및 ethylacetate 분획은 100 ㎎/㎏으로 하였다. 대조군은 5% DMSO을투여하였다.
- 이를 증류수에 현탁시킨 후, Amberlite XAD-2resin column(20×6.0 ㎝)을 이용하여 MeOH 3 ℓ와 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc) 3 ℓ로 순차적으로 용출하여 각각의 건조 분획을 얻었으며, 항암 효과 측정 시는 DMSO에 녹여 투여를 하였다.
- 즉, 세포를 1×106 cells/㎖로 하여 미리 한쪽 끝이 봉인된 멸균 hollow fiber에 5 cc 주사기를 이용하여 세포현탁액을 주입한 후, 세포현탁액이 세어 나오지 못하도록 열을 가하여 hollow fiber의 나머지 한쪽을 봉인하였고, 세포가 충진된 fiber를 2 ㎝ 간격으로 가열 봉인하여 macrocapsule를 만들었다.
- Amberlite XAD 컬럼을 이용하여 분리된 각 분획물 및MeOH 추출물을 20종의 종양세포에 대하여 hollow fiber assay로 종양세포증식억제효과를 검색하여 본 결과, 전체적으로 고량강 추출물 유래의 물질은 Colo-320, HCT116 및 WiDr과 같은 주로 대장암 유래의 종양세포에 대하여 특이적으로 저해 효과를 나타내었다. 투여 농도의 결정에서 있어서 MeOH추출물에서 경우는 2,000 ㎎/㎏(MeOH 추출물에서 독성을 나타내지 않는 최대농도)로 하였고, Amberlite XAD 컬럼 분획물의 경우는 급성독성(정맥투여)을 나타내는 농도의 1/20이하(100 ㎎/㎏)로 하였다(data not shown). MeOH 추출물에 대한 20종의 종양세포 중 Colo-320과 HCT116에서 각각 52%와 54%의 저해율을 나타내었고, 나머지 종양세포주에서는 50% 이하의 다양한 저해율을 나타내어, 본 연구자가 사용한 hollow fiber 시스템에서는 Colo-320과 HCT116의 두 종류의 세포에서만 특이적으로 실험농도에서 감수성이 있는 것으로 나타났다.
- 이 캡슐을 24시간 동안 37℃ CO2배양기에서 예비 배양한 후, 마우스의 좌우 옆구리 피하에 이식하였다. 평가는 시료 투여일로부터 8일 후에 마우스로부터 hollow fiber 캡슐을적출하여 캡슐 내에 있는 세포농도를 MTT시약(1 ㎎/㎏)으로 염색한 후, 형성된 formazan를 DMSO로 녹여 흡광도(540 nm,Biorad ELISA microreader model 680, USA)를 측정하여 저해율로 측정하였다. 활성을 측정하고자 하는 시료는 매일 1회씩 5일간 복강 투여하였으며, 양성대조물질로는 5-fluorouracil(25 ㎎/㎏, LD50의 1/10값)을 동일하게 투여하였다.
- 본 연구는 고량강의 메탄올 추출물로부터 흡착 크로마토그래피에 의하여 분리한 분획에 대하여 광범위한 종양세포에 대하여 항암 효과 검색을 실시하였다. 항암 효과는 in vivo의 생체내 약리조건에 충족시킬 수 있는 hollow fiber assay를 이용하여, 20종의 종양세포에 대한 검색을 실시하였다. 일반적으로 초기 물질탐색과정부터 동물을 이용한 기존의 물질검색은 많은 시간 및 비용이 소모되는 단점이 있다.
- 평가는 시료 투여일로부터 8일 후에 마우스로부터 hollow fiber 캡슐을적출하여 캡슐 내에 있는 세포농도를 MTT시약(1 ㎎/㎏)으로 염색한 후, 형성된 formazan를 DMSO로 녹여 흡광도(540 nm,Biorad ELISA microreader model 680, USA)를 측정하여 저해율로 측정하였다. 활성을 측정하고자 하는 시료는 매일 1회씩 5일간 복강 투여하였으며, 양성대조물질로는 5-fluorouracil(25 ㎎/㎏, LD50의 1/10값)을 동일하게 투여하였다. 각 시험물질의 투여농도는 MeOH 추출물은 2,000 ㎎/㎏, MeOH 분획 및 ethylacetate 분획은 100 ㎎/㎏으로 하였다.
대상 데이터
- Balb/c 마우스(수컷, 5 주령)는 일본의 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)사의 동물을 중앙실험동물로부터 구입하여 사용하였다. 동물실의 온도는 22±3℃, 습도는 55±5%, 명암주기는 12시간으로 조절하였다.
- 20개의 종양세포주로는 melanoma인 SK-MEL-2, cervix adenocarcinoma인 HeLa와 SiHa, breast adenocarcinoma인 MCF-7와MDAMB-231, ovary adenocarcinoma인 SK-OV-3, pancreas adenocarcinoma인 Capan-1와 Capan-2, colon adenocarcinoma인 Colo320, WiDr 및 HCT116, lung carcinoma인 A549와 H209, larynx carcinoma인 A431, stomach carcinoma인 MKN-28와 MKN-45,prostate carcinoma인 PC-3, cervical carcinoma인 KB, pharynx carcinoma인 FaDu와 liver hepatoblastoma인 Hep-G2를 사용하였다. 모든 세포주는 표준배양배지에 10% fetal bovine serum(FBS, JRH Bioscience)를 사용하였다.
- HeLa, MCF-7, Hep-G2,KB, Colo-320, WiDr, HCT116와 SK-MEL-2는 minimum essential medium (MEM)를, SK-OV-3는 McCoy's 5a medium을 이용하였다.
- 고량강은 청주에 위치한 한의원으로부터 공급받아 실험에 사용하였으며, voucher specimen은 국립공주대학교에 보관되어 있다. Polyvinylidene fluoride(PVDF) hollow fibers(500,000Da molecular weight cut-off and 1.0 ㎜ ID)는 Spectrum Laboratories(USA)로부터 구입하였다. Balb/c 마우스(수컷, 5 주령)는 일본의 SLC Inc.
- 고량강은 청주에 위치한 한의원으로부터 공급받아 실험에 사용하였으며, voucher specimen은 국립공주대학교에 보관되어 있다. Polyvinylidene fluoride(PVDF) hollow fibers(500,000Da molecular weight cut-off and 1.
- 20개의 종양세포주로는 melanoma인 SK-MEL-2, cervix adenocarcinoma인 HeLa와 SiHa, breast adenocarcinoma인 MCF-7와MDAMB-231, ovary adenocarcinoma인 SK-OV-3, pancreas adenocarcinoma인 Capan-1와 Capan-2, colon adenocarcinoma인 Colo320, WiDr 및 HCT116, lung carcinoma인 A549와 H209, larynx carcinoma인 A431, stomach carcinoma인 MKN-28와 MKN-45,prostate carcinoma인 PC-3, cervical carcinoma인 KB, pharynx carcinoma인 FaDu와 liver hepatoblastoma인 Hep-G2를 사용하였다. 모든 세포주는 표준배양배지에 10% fetal bovine serum(FBS, JRH Bioscience)를 사용하였다. HeLa, MCF-7, Hep-G2,KB, Colo-320, WiDr, HCT116와 SK-MEL-2는 minimum essential medium (MEM)를, SK-OV-3는 McCoy's 5a medium을 이용하였다.
이론/모형
- 항암활성의 측정은 Hollingshead 등(1995)의 방법을 이용하였다. 즉, 세포를 1×106 cells/㎖로 하여 미리 한쪽 끝이 봉인된 멸균 hollow fiber에 5 cc 주사기를 이용하여 세포현탁액을 주입한 후, 세포현탁액이 세어 나오지 못하도록 열을 가하여 hollow fiber의 나머지 한쪽을 봉인하였고, 세포가 충진된 fiber를 2 ㎝ 간격으로 가열 봉인하여 macrocapsule를 만들었다.
성능/효과
- Amberlite XAD 컬럼을 이용하여 분리된 각 분획물 및MeOH 추출물을 20종의 종양세포에 대하여 hollow fiber assay로 종양세포증식억제효과를 검색하여 본 결과, 전체적으로 고량강 추출물 유래의 물질은 Colo-320, HCT116 및 WiDr과 같은 주로 대장암 유래의 종양세포에 대하여 특이적으로 저해 효과를 나타내었다. 투여 농도의 결정에서 있어서 MeOH추출물에서 경우는 2,000 ㎎/㎏(MeOH 추출물에서 독성을 나타내지 않는 최대농도)로 하였고, Amberlite XAD 컬럼 분획물의 경우는 급성독성(정맥투여)을 나타내는 농도의 1/20이하(100 ㎎/㎏)로 하였다(data not shown).
- 01%(Table 1). MeOH 분획에서는 diarylheptanoids 및flavonoids의 함량이 EtOAc 분획 대비 전반적으로 높게 검출이 되었고, 특징적으로는 galangin와 kaempheride의 함량이EtOAc 분획보다 높게 나타났다.
- 투여 농도의 결정에서 있어서 MeOH추출물에서 경우는 2,000 ㎎/㎏(MeOH 추출물에서 독성을 나타내지 않는 최대농도)로 하였고, Amberlite XAD 컬럼 분획물의 경우는 급성독성(정맥투여)을 나타내는 농도의 1/20이하(100 ㎎/㎏)로 하였다(data not shown). MeOH 추출물에 대한 20종의 종양세포 중 Colo-320과 HCT116에서 각각 52%와 54%의 저해율을 나타내었고, 나머지 종양세포주에서는 50% 이하의 다양한 저해율을 나타내어, 본 연구자가 사용한 hollow fiber 시스템에서는 Colo-320과 HCT116의 두 종류의 세포에서만 특이적으로 실험농도에서 감수성이 있는 것으로 나타났다. 또한 Amberlite XAD 컬럼으로부터의 MeOH 및 EtOAc분획물의 경우, 동일 농도에서 비교 평가한 결과 MeOH 분획물에서 Colo-320, HCT116 및 WiDr에서 각각 68%, 60% 및 57%의 저해율을 나타내어 컬럼 분획 전 단계인 MeOH 추출물에서와 유사한 활성 스펙트럼을 나타내었다.
- MeOH분획물에서 함량이 높은 순서로는 galangin(4), 3,5-dihydroxy1,7-diphenylheptane(3) 및 kaempheride(5)으로 나타났으며, EtOAc분획물에서는 5-hydroxy-1,7-diphenyl-3-heptanone(1)과 5-methoxy7-(4"-hydroxy-3"-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanone(6)이 주요한 성분으로 나타났으나, MeOH 분획에서 가장 높게 검출된 galangin의 경우는 검출되지 않았다.
- 본 연구에서는 고량강의 MeOH 추출물을 Amberlite XAD 컬럼을 이용한 흡착 크로마토그래피 분획물로부터 항종양 효과를 hollow fiber assay를 이용하여 검색하였고, 각 분획물에 대하여 항종양 효과에 영향을 미치는 성분에 대한 함량을 조사하였다. 그 결과, 고량강의 함종양 활성은 MeOH 분획물에서 나타났으며, 특히 Colo-320, HCT116 및 WiDr와 같은 대장암 세포주에 활성을 나타내었다. 활성이 나타난 MeOH 분획물의 주요성분으로는 함량이 높은 순서로 galangin, 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane 및 kaempheride으로 flavonoids와 diarylheptanoids이 검출되었고, EtOAc 분획물에서는 5-hydroxy-1,7-diphenyl3-heptanone)과 5-methoxy-7-(4"-hydroxy-3"-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanone와 같은 diarylheptanoids만이 소량으로 검출되었다.
- MeOH분획물에서 함량이 높은 순서로는 galangin(4), 3,5-dihydroxy1,7-diphenylheptane(3) 및 kaempheride(5)으로 나타났으며, EtOAc분획물에서는 5-hydroxy-1,7-diphenyl-3-heptanone(1)과 5-methoxy7-(4"-hydroxy-3"-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanone(6)이 주요한 성분으로 나타났으나, MeOH 분획에서 가장 높게 검출된 galangin의 경우는 검출되지 않았다. 따라서, 본 물질들이 항종양 활성에 가장 영향력을 나타내는 성분으로는 MeOH 분획물에서 높은 함량을 나타낸 galangin(4), 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane(3) 및 kaempheride(5)의 성분들로 사료된다. 또한 Table 2의 hollow fiber assay의 결과에서 보는 바와 같이 주요 활성 성분으로 예측되는 3가지 성분이 많이 함유된 MeOH 분획물에서 나타났다.
- 또한 Table 2의 hollow fiber assay의 결과에서 보는 바와 같이 주요 활성 성분으로 예측되는 3가지 성분이 많이 함유된 MeOH 분획물에서 나타났다. 따라서, 본 연구결과에서는 고강량의 항종양 활성은 MeOH 분획물에서 나타났으며, 이러한 분획 중의 주요 활성성분으로는 galangin(4), 3, 5-dihydroxy1, 7-diphenylheptane(3) 및 kaempheride(5)으로 추정되었다. 본연구의 이러한 결과는, 비록 in vitro 검색 결과이기는 하지만, 이 등(2008)의 결과와 유사하게 대장암 세포주(HCT-15)에 활성을 나타내었고, 검출된 활성성분으로는 galangin과 kaempheride으로 본 연구결과와도 일치하였다.
- 이러한 결과로 볼 때 두 분획물의 항종양 활성의 차이는 각 분획물의 성분의 함량차이로 사료가 된다. 따라서,본 연구결과에서 구체적 성분에는 약간의 차이가 있었으나 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane와 같은 diarylheptanoids와 galangin 및 kaempheride와 같은 flavonoids류가 주요 활성 성분으로 사료되었다. 또한 본 연구결과는 이전의 연구자들은 주로 in vitro 연구결과이었으나, 마우스를 이용한 in vivo 결과에서 입증한 것에 의의가 있다고 할 수 있으며, 이러한 결과는 향후 대장암 치료에 있어서 diarylheptanoids와 flavonoids류를 이용한 치료에 적용할 수 있는 기초적인 자료라 판단된다.
- 또한 Amberlite XAD 컬럼으로부터의 MeOH 및 EtOAc분획물의 경우, 동일 농도에서 비교 평가한 결과 MeOH 분획물에서 Colo-320, HCT116 및 WiDr에서 각각 68%, 60% 및 57%의 저해율을 나타내어 컬럼 분획 전 단계인 MeOH 추출물에서와 유사한 활성 스펙트럼을 나타내었다. 반면에 EtOAc분획물 처리에서는 Colo-320, HCT116 및 WiDr을 포함한 나머지 모든 종양세포주에서 MeOH 분획물 처리시 보다 낮은 저해율을 나타내어 전반적으로 Amberlite XAD 컬럼 분획 시에MeOH 용출에 활성성분이 많이 용출되는 것으로 판단되었다.
- 즉, 3종류의 diarylheptanoids 성분으로 5-hydroxy-1,7-diphenyl-3-heptanone(1)는 1.2%, 5-hydroxy-7-(4"-hydroxy-3"-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanone(2)는 0.4%, 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane(3)는 3.8%이 검출되었고, 2종류의 flavonoids로는 galangin(4) 5.8%와 kaempheride(5) 3.0%가 검출이 되었다.
후속연구
- 따라서,본 연구결과에서 구체적 성분에는 약간의 차이가 있었으나 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane와 같은 diarylheptanoids와 galangin 및 kaempheride와 같은 flavonoids류가 주요 활성 성분으로 사료되었다. 또한 본 연구결과는 이전의 연구자들은 주로 in vitro 연구결과이었으나, 마우스를 이용한 in vivo 결과에서 입증한 것에 의의가 있다고 할 수 있으며, 이러한 결과는 향후 대장암 치료에 있어서 diarylheptanoids와 flavonoids류를 이용한 치료에 적용할 수 있는 기초적인 자료라 판단된다.
- 여러 연구자들의 연구결과, 고량강의 항암 활성 성분으로는 diarylheptanoids류와 galangin과 같은 flavonoids류가 주요 약리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며 (Houghton 등 2007; Lee & Houghton 2005; Lu 등 2007; Yasukawa 등 2008), 본 연구결과에서 구체적 성분에는 약간의 차이가 있었으나, 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane와 같은 diarylheptanoids와 galangin 및 kaempheride와 같은 flavonoids류가 주요 활성 성분으로 사료되었다. 본 연구결과의 의의는 이전의 연구자들은 주로 in vitro 연구결과이었으나, 본 연구자는 이러한 in vitro 결과를 마우스를 이용한 in vivo 결과에서 입증한 것에 의의가 있다고 할 수 있으며, 이러한 결과는 향후, xenograft 동물모델을 이용하여 입증과 나아가서는 대장암에 대하여 구체적으로 효능을 접근할 수 있는 주요한 자료라 사료가 된다.
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