국내 시설농업에서 질소비료의 과다사용은 토양에 염류집적을 유발하고 있다. 토양중 축적된 질산이온을 제거하기 위하여 질산이온 흡수능이 뛰어난 토양미생물을 밭토양으로부터 분리하고, 질산이온 흡수 특성을 조사하였다. 분리한 GS2 50 mM 농도의 질산이온을 12시간 이내에 제거하였다. 이 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 Bacillus sp. GS2로 분리동정하였다. 이 균주의 성장과 질산이온 흡수의 성을 조사하였을 때, 각각 $30-40^{\circ}C$와 $37^{\circ}C$에서 최대치를 보였으며, 두 가지 모두 pH 6-8 범위가 최적의 조건임을 확인하였다. Bacillus sp. GS2 균주는 50 mM 질산이온을 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 43 mM의 농도를 감소시켜 약 86%의 질산이온 흡수를 보였으며, 300 mM 까지의 농도범위에서 유사한 질산이온 제거 능력을 보여, 질산이온 흡수활성이 50 mM 이상에서 포화됨을 확인하였다. 이러한 결과는 Bacillus sp. GS2 균주의 우수한 균주성장과 질산이온 흡수능을 보여주는 것으로, 이 균주는 환경중 질산이온 제거에 유용한 균주로 이용될 수 있을 것이다.
국내 시설농업에서 질소비료의 과다사용은 토양에 염류집적을 유발하고 있다. 토양중 축적된 질산이온을 제거하기 위하여 질산이온 흡수능이 뛰어난 토양미생물을 밭토양으로부터 분리하고, 질산이온 흡수 특성을 조사하였다. 분리한 GS2 50 mM 농도의 질산이온을 12시간 이내에 제거하였다. 이 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 Bacillus sp. GS2로 분리동정하였다. 이 균주의 성장과 질산이온 흡수의 성을 조사하였을 때, 각각 $30-40^{\circ}C$와 $37^{\circ}C$에서 최대치를 보였으며, 두 가지 모두 pH 6-8 범위가 최적의 조건임을 확인하였다. Bacillus sp. GS2 균주는 50 mM 질산이온을 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 43 mM의 농도를 감소시켜 약 86%의 질산이온 흡수를 보였으며, 300 mM 까지의 농도범위에서 유사한 질산이온 제거 능력을 보여, 질산이온 흡수활성이 50 mM 이상에서 포화됨을 확인하였다. 이러한 결과는 Bacillus sp. GS2 균주의 우수한 균주성장과 질산이온 흡수능을 보여주는 것으로, 이 균주는 환경중 질산이온 제거에 유용한 균주로 이용될 수 있을 것이다.
Over-application of nitrogen fertilizer keeps increasing the salinity in the soils of greenhouse in domestic agriculture. In order to remove the excess amounts of soil nitrate, soil microorganisms which have high capacity of nitrate uptake were isolated from the upland soils and their nitrate uptake...
Over-application of nitrogen fertilizer keeps increasing the salinity in the soils of greenhouse in domestic agriculture. In order to remove the excess amounts of soil nitrate, soil microorganisms which have high capacity of nitrate uptake were isolated from the upland soils and their nitrate uptake activities were measured. Strain GS2 was able to remove 50 mM nitrate within 12 h. After sequence comparison analysis of 16S rRNA gene, the strain was identified and named as Bacillus sp. GS2. When the growth and nitrate uptake activities were measured, maximal values were obtained at $30-40^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$, respectively; however, both were optimal at pH 6-8. In the media containing 50 mM nitrate, Bacillus sp. GS2 removed 43 mM nitrate which is corresponding to 86% removal. Similar amounts of nitrate removal were observed at the nitrate concentrations up to 300 mM, showing a saturation in nitrate uptake at concentrations above 50 mM. These results imply that Bacillus sp. GS2 can be a good candidate for the microbial remediation of accumulated environmental nitrate because of its excellent growth and nitrate uptake activity.
Over-application of nitrogen fertilizer keeps increasing the salinity in the soils of greenhouse in domestic agriculture. In order to remove the excess amounts of soil nitrate, soil microorganisms which have high capacity of nitrate uptake were isolated from the upland soils and their nitrate uptake activities were measured. Strain GS2 was able to remove 50 mM nitrate within 12 h. After sequence comparison analysis of 16S rRNA gene, the strain was identified and named as Bacillus sp. GS2. When the growth and nitrate uptake activities were measured, maximal values were obtained at $30-40^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$, respectively; however, both were optimal at pH 6-8. In the media containing 50 mM nitrate, Bacillus sp. GS2 removed 43 mM nitrate which is corresponding to 86% removal. Similar amounts of nitrate removal were observed at the nitrate concentrations up to 300 mM, showing a saturation in nitrate uptake at concentrations above 50 mM. These results imply that Bacillus sp. GS2 can be a good candidate for the microbial remediation of accumulated environmental nitrate because of its excellent growth and nitrate uptake activity.
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문제 정의
본 연구에서는 작물의 생육환경을 개선하고 시설원예 토양에 집적한 질산이온을 제거하기 위하여 토양에 서식하는 미생물을 분리하고 이들 중 질산흡수 능력이 탁월한 토양미생물을 분리하였고, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 동정하였다. 이들을 질산이온이 집적한 시설재배지 토양에 적용한다면 질산이온의 정화에 효과적인 방안이 될 수 있을 것이기에 분리한 미생물들의 질산이온 흡수 특성을 다양한 조건에서 조사하였다.
이들을 질산이온이 집적한 시설재배지 토양에 적용한다면 질산이온의 정화에 효과적인 방안이 될 수 있을 것이기에 분리한 미생물들의 질산이온 흡수 특성을 다양한 조건에서 조사하였다.
제안 방법
GS2 균주의 동정. GS2 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석으로 동정하였다. 유전자 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co.
Bacillus sp. GS2 균주의 생육을 위한 최적 온도와 pH, 질산이온 흡수를 위한 최적 조건을 확인하기 위하여 배양온도를 달리하며 균주의 성장과 질산이온 흡수를 측정하였다(Fig. 4). 균주를 각 온도조건에서 12시간 배양한 후, 흡광도를 측정하였을 때, 30-40℃ 범위에서 최대 성장을 보였다.
질산이온 첨가에 따른 Bacillus sp. GS2 균주의 성장 촉진 여부를 확인하였다(Fig. 3). 균주는 접종 후 약 2시간부터 대수기 성장을 시작하여 6A] 간 동안 증식하였다.
질산이온의 농도를 500mM까지 높이며 Bacillus sp. GS2 균주의 성장과 질산이온흡수능력을 측정하였다(Fig. 6). 배지의 질산이온 농도가 300 mM까지 증가하였을 때, 이 균주의 균체성장에 따른 흡광도는 약 2.
따라서 이 균주를 Bacillus sp. GS2로 명명하고 질산흡수 특성을 조사하였다. 균주의 전자현미경 사진은 Fig.
pH 변화에 따른 균주성장과 질산이온 흡수 특성은 pH 5-9의 범위에서 측정하였다(Fig. 5). 균주의 최적 성장온도와 질산흡수 능력은 모두 pH 6-8 범위에서 고르게 높게 나타났으며, 이보다 높거나 낮은 pH 조건에서는 성장과 질산이온 흡수능 모두 거의 완전히 저해되었다.
토양의 화학적 특성은 한국 국립농업과학원에서 개발한 방법들을 이용하여 측정하였다. 간단하게, 토양의 pH 와 전기전도도(EC) 측정은 증류수를 이용하여 토양을 5배 희석한 추출물을 시용하였으며, 각각 pH 측정기 (Thermo Orion, US/EA920)와 전기전도도 측정기를 사용하였다.
고정한 균주는 ethanole- 30-100%까지 차례로 농도를 높인 용액으로 처리하여 탈수시킨 후, isoamyl acetate에 60분간 배양하였다. 고정한 세포는 금박한 후 주사전자현미경 (Cari-Zeiss LEO-1530FE)로 관측하였다.
) 에 의해 정제되었고, 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA 분석기에서 결정되었다. 다른 균주와의 염기서열 상동은 BLASTn (NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다. 계통수(Phylogenetic tree) 분석은 neighbor-joining 방법에 따라 만들어졌으며, 진화적 거리는 ClustalX 프로그램을 사용하여 계산하였다.
분리한 균주 중 질산이온 흡수능력이 가장 우수하였던 GS9 균주는 Bacillus cereal 염기서열 상동성이 100%로 밝혀져 식중독을 유발할 수 있는 병원성 균주임을 확인하였다. 따라서, 다음으로 질산이온 흡수능이 큰 GS2 균주의 염 기서 열을 분석 하였고 유전자은행 에 등록하였다(Genebank Accession No. GQ386842). GS2 균주의 염기서열은 BLASTn 프로그램을 사용하여 분석하였고, phylogenetic tree 분석을 통하여 Bacillus 속에 속하는 균주임을 확인하였으나, 상동성이 98% 이상 높은 균주를 발견할 수 없어 기존에 보고된 유전자은행의 균주들과는 다른 rRNA 유전자를 가진 균주임을 확인하였다(Fig.
분리한 균주들 중 질산이온 흡수능력이 큰 균주 3가지를 선택하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 유전자 증폭방법을 통하여 분석하였다. 분리한 균주 중 질산이온 흡수능력이 가장 우수하였던 GS9 균주는 Bacillus cereal 염기서열 상동성이 100%로 밝혀져 식중독을 유발할 수 있는 병원성 균주임을 확인하였다.
분리한 미생물 균주는 다양한 농도의 질산이온을 포함하는 PAF 배지에서 37。。에 12시간동안 150rpm의 교반상태로 배양하였다. 세포의 밀도는 분광광도계 (U-2000, Hitachi, Tokyo)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 관측하였다.
GS2 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석으로 동정하였다. 유전자 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co., Madison, WI)를 사용하여 미생물 배양체에서 순수분리하였다. 유전자 증폭은 보편적인 primed 27F와 1492R을 이용하여 이루어졌으며, PCR 산물들은 Wizard SV Gel과 PCR clean-up 시스템 (Promega Co.
, Madison, WI)를 사용하여 미생물 배양체에서 순수분리하였다. 유전자 증폭은 보편적인 primed 27F와 1492R을 이용하여 이루어졌으며, PCR 산물들은 Wizard SV Gel과 PCR clean-up 시스템 (Promega Co.) 에 의해 정제되었고, 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA 분석기에서 결정되었다. 다른 균주와의 염기서열 상동은 BLASTn (NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다.
3과 37 mg kg-'이었다. 이 균주들은 질산이온을 포함한 배지에서 증식하였고, 질산이온 흡수능력을 측정하였다(Fig .1). 분리한 균주들 중 GS1과 GS2, GS9는 우수한 질산이온 흡수력을 보였으며, 특히 GS9는 탁월한 생장력과 질산이온 흡수력을 보였다.
질산이온 흡수측정. 질산이온 흡수는 균주를 배양하며 배지에 남아있는 질산이온의 양을 분석하여 측정하였다. 질산이온의 농도는 질산이온전극과 표준전극(double junction reference electrode)을 이용한 이온분석기(Ion Selective Analyzer, Orion 960 ISE meter)를 사용하여 측정하였다[Kang과 Hong, 2004; Kim 등, 2009].
토양미생물의 분리 동정 및 질산이온 흡수 특성 환경 중 과다 집적한 질산이온의 제거를 목적으로 밭토양에서 9가지 미생물을 콜로니의 색과 모양의 차이에 따라 분리하였다. 토양 시료는 충북대학교 개신캠퍼스 실험농장의 밭토양에서 채취하였으며, 토양시료의 물리화학적 특성은 pH 6.
토양분석. 토양시료는 충북대학교 실험 농장의 밭 토양으로부터 수집하였다. 토양의 화학적 특성은 한국 국립농업과학원에서 개발한 방법들을 이용하여 측정하였다.
이론/모형
다른 균주와의 염기서열 상동은 BLASTn (NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다. 계통수(Phylogenetic tree) 분석은 neighbor-joining 방법에 따라 만들어졌으며, 진화적 거리는 ClustalX 프로그램을 사용하여 계산하였다.
질산이온 흡수는 균주를 배양하며 배지에 남아있는 질산이온의 양을 분석하여 측정하였다. 질산이온의 농도는 질산이온전극과 표준전극(double junction reference electrode)을 이용한 이온분석기(Ion Selective Analyzer, Orion 960 ISE meter)를 사용하여 측정하였다[Kang과 Hong, 2004; Kim 등, 2009]. 표준용액과 토양추출시료는 50:1 (v/v)의 비율로 이온강도조정용액 (ISE)을 섞어주었다.
토양시료는 충북대학교 실험 농장의 밭 토양으로부터 수집하였다. 토양의 화학적 특성은 한국 국립농업과학원에서 개발한 방법들을 이용하여 측정하였다. 간단하게, 토양의 pH 와 전기전도도(EC) 측정은 증류수를 이용하여 토양을 5배 희석한 추출물을 시용하였으며, 각각 pH 측정기 (Thermo Orion, US/EA920)와 전기전도도 측정기를 사용하였다.
성능/효과
균주를 각 온도조건에서 12시간 배양한 후, 흡광도를 측정하였을 때, 30-40℃ 범위에서 최대 성장을 보였다. 25。(2에서의 성장은 생균수로 측정하였을 때, 최적 성장의 약 20%를 보였다. 그러나 같은 배양조건에서 질산이온의 흡수는 37℃에서 최대치 86.
동일한 조건에서 Bacillus sp. GS2 균주를 배양한 질산이온 첨가 배지에서 질산이온의 잔여량을 정량분석하여 조사한 질산이온의 흡수는 배양 후 2시간 정도부터 증가하여 6-S시간에 최대 흡수를 보였고, 12시간이 경과하였을 때 약 80% 이상이 홉수되었다. 시간에 따른 균주생장과 질산이온의 감소 곡선 간에는 서로 대칭관계를 보여 질산이온 흡수와 균주의 성장 사이에 매우 밀접한 관련이 있음을 확인하였다.
GQ386842). GS2 균주의 염기서열은 BLASTn 프로그램을 사용하여 분석하였고, phylogenetic tree 분석을 통하여 Bacillus 속에 속하는 균주임을 확인하였으나, 상동성이 98% 이상 높은 균주를 발견할 수 없어 기존에 보고된 유전자은행의 균주들과는 다른 rRNA 유전자를 가진 균주임을 확인하였다(Fig. 2). 따라서 이 균주를 Bacillus sp.
4). 균주를 각 온도조건에서 12시간 배양한 후, 흡광도를 측정하였을 때, 30-40℃ 범위에서 최대 성장을 보였다. 25。(2에서의 성장은 생균수로 측정하였을 때, 최적 성장의 약 20%를 보였다.
5). 균주의 최적 성장온도와 질산흡수 능력은 모두 pH 6-8 범위에서 고르게 높게 나타났으며, 이보다 높거나 낮은 pH 조건에서는 성장과 질산이온 흡수능 모두 거의 완전히 저해되었다. 이것은 Bacillus sp.
GS2 균주는 오염된 환경중 질산이온 제거에 유용할 것으로 여겨진다. 다만, 이 균주의 질산흡수를 위한 최적 온도는 303TC로 높으나 외부 온도의 증가에 따라 유리온실 등의 시설내 온도가 쉽게 고온에 이른다는 점을 고려하면 토양 표층에서 질산이온 제거역할에는 긍정적인 효과가 있을 것으로 판단된다. 질산이온의 과다에 의한 문제점을 근본적으로 제거하기 위해서는 질소비료의 시용량을 적정화하고, 질소고정세균의 이용과 같은 생물비료 시용이나 Bacillus sp.
분석하였다. 분리한 균주 중 질산이온 흡수능력이 가장 우수하였던 GS9 균주는 Bacillus cereal 염기서열 상동성이 100%로 밝혀져 식중독을 유발할 수 있는 병원성 균주임을 확인하였다. 따라서, 다음으로 질산이온 흡수능이 큰 GS2 균주의 염 기서 열을 분석 하였고 유전자은행 에 등록하였다(Genebank Accession No.
1). 분리한 균주들 중 GS1과 GS2, GS9는 우수한 질산이온 흡수력을 보였으며, 특히 GS9는 탁월한 생장력과 질산이온 흡수력을 보였다. GS4와 GS5 균주는 중간 정도의 질산이온 흡수를 보였으나, 나머지 균주들은 매우 약한 흡수를 보였다.
GS2 균주를 배양한 질산이온 첨가 배지에서 질산이온의 잔여량을 정량분석하여 조사한 질산이온의 흡수는 배양 후 2시간 정도부터 증가하여 6-S시간에 최대 흡수를 보였고, 12시간이 경과하였을 때 약 80% 이상이 홉수되었다. 시간에 따른 균주생장과 질산이온의 감소 곡선 간에는 서로 대칭관계를 보여 질산이온 흡수와 균주의 성장 사이에 매우 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 그럼에도 불구하고 GS2 균주는 질산이온을 첨가하지 않은 배지에서도 우수한 성장을 보여 다른 질소원을 포함하는 배지에서 질산이온이 성장에 반드시 필요한 필수요소는 아님을 확인하였다.
05으로 흡광도의 증기를 보였다. 이것을 생균 수로 측정하였을 때, 대조구의 6.37x106 cfh/mL에서 질산첨가 배지의 1.36시V cfii/mL로 균체가 약 2.13배 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 질산이온에 의한 균주의 성장촉진 효과를 나타내는 것이다.
성장곡선에서 가장 빠르게 성장한 GS9 균주는 질산흡수에서도 가장 빠르고 높은 활성을 보였다. 전반적으로 높은 성장을 보이는 균주들의 질산이온 흡수능력도 크게 나타났다.
후속연구
GS2는 우수한 질산이온 흡수능을 가진 토양미생물로 질산이온 존재시 생육이 촉진되며, pH 6-8의 범위에서 질산이온 흡수능이 우수한 균주이다. 이러한 특성은 포징적용실험을 통하여 확인되어야 할 것이다. 본 연구실에서 기존에 질산이온 흡수 특성을 보고한 균주 Enterobacter amnigenus GG0461은 그람 음성균으로서 질산이온의 흡수력은 우수하였으나 환경에서 지속적인 활력유지에 어려움이 있었다(Kim 등, 2009].
GS2 균주에 의한 질산이온 흡수가 외부농도의 증가에도 일정한 수준으로 유지되어, 50 mM 이상의 농도에서 포화현상을 보이는 것이다. 즉, 세포막의 질산이온 수송체나 세포 내 질산이온 환원효소 등의 효소활성이 질산이온 농도의 증가에 따라 포화됨을 의미하며, 이것을 밝혀내기 위해서는 분자기작에 대한 접근이 필요할 것이다.
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