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제안 방법
- 따라서, 본 연구에서는 질산이온 흡수능이 크고 환경에 적응력이 우수한 균종을 분리하던 중, Bacillus sp. PCE3 균주를 축산폐수를 접하는 토양에서 분리하였고, 이 균주의 우수성을 확인하였기에 다양한 조건에서의 균주의 질산이온 흡수 특성을 조사하였다.
- 질산이온의 농도를 30-500 mM까지 증가시키며 Bacillus sp. PCE3 균주의 성장 및 질산이온 흡수능을 측정하였다(Fig. 3). 질산이온의 첨가에 따른 균주의 성장은 대체로 일정하였으며, 높은 질산이온 농도에서도 균주의 성장은 양호하였다.
- Bacillus sp. PCE3 균주의 성장과 질산이온 흡수를 위한 최적 조건을 확인하기 위하여 pH 5-9 범위에서 10시간 배양하였을 때, 균주의 성장과 질산이온 흡수를 측정하였다(Fig. 4). pH가 증가함에 따라 균주의 성장도 같이 증가하였으나, pH 5에서는 균주의 성장과 질산이온의 흡수를 관측할 수 없었다.
- )을 통해 정제하였고, 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA 분석기를 이용하여 결정하였다. 다른 균주와의 유전자 염기서열 상동성은 BLASTn(NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다. 계통수 분석은 neighbor-joining 방법에 따라 만들어졌으며, 진화적 거리는 ClustalW 프로그램을 사용하여 계산하였다.
- 배지의 pH 조절은 조제한 배지가 다량의 단백질 및 펩티드 성분과 인산염 등을 포함하고 있어 자체적인 완충력을 가짐으로 별도의 완충액을 첨가하지 않고 이루어졌다. 따라서 배양전 배지의 초기 pH 조정은 가능한 적은양의 산과 염기를 사용하여 이루어졌다. 즉, PAF 배지를 pH 5에서 pH 9까지 조절하기 위하여, pH 5, 6, 7은 묽은 HCl, pH 8, 9는 묽은 NaOH 용액이 사용되었다.
- 미생물 균주에 의한 질산이온 흡수는 균주의 배양중 배지에 남아있는 질산이온의 양을 정량분석하여 측정하였다. 질산이온의 농도는 질산이온전극과 표준전극(double junction reference electrode)을 이용한 이온분석기(Ion Selective Analyzer, Orion 960 ISE meter)를 사용하여 측정하였다(Kang과 Hong, 2004).
- 즉, PAF 배지를 pH 5에서 pH 9까지 조절하기 위하여, pH 5, 6, 7은 묽은 HCl, pH 8, 9는 묽은 NaOH 용액이 사용되었다. 배지의 pH 변화는 pH 측정기(M-92, MeterLab Co., France)로 측정하였다.
- 배지의 pH 조절은 조제한 배지가 다량의 단백질 및 펩티드 성분과 인산염 등을 포함하고 있어 자체적인 완충력을 가짐으로 별도의 완충액을 첨가하지 않고 이루어졌다. 따라서 배양전 배지의 초기 pH 조정은 가능한 적은양의 산과 염기를 사용하여 이루어졌다.
- 미생물 균주는 다양한 농도의 질산이온, 서로 다른 탄소원, pH별로 PAF 액체배지에서 37℃에 12시간동안 150 rpm의 교반상태로 배양하였다. 세균의 균수는 분광광도계(U2000, Hitachi, Tokyo)를 이용하여 흡광도를 측정하고, 이것을 균수에 따른 표준곡선과 비교하여 평가하였다.
- 분리한 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석하고 염기서열비교방법을 통하여 동정하였다. 유전자 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co., Madison, USA)를 이용하여 미생물 배양체에서 분리하였고, 유전자 증폭은 universal primer인 518F와 800R을 이용하여 이루어졌으며, PCR 산물들은 Wizard SV Gel과 PCR clean-up 시스템(Promega Co.)을 통해 정제하였고, 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA 분석기를 이용하여 결정하였다. 다른 균주와의 유전자 염기서열 상동성은 BLASTn(NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다.
- 질산이온 흡수능력이 탁월한 PCE3 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 유전자 증폭방법을 통하여 결정하였다. PCE3 균주의 염기서열은 BLASTn 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 유전자은행에 등록하였다(GenBank Accession No.
- 5 g; glycerol, 10 mL; Agar, 15 g/L)에 도말하여 배양하였다. 질산이온 흡수능이 큰 미생물을 분리하기 위하여 배지에 50 mM KNO3를 첨가하였고, 37℃에서 12시간 이상 배양하여 성장이 우수한 균주를 분리하였다. 미생물 균주는 다양한 농도의 질산이온, 서로 다른 탄소원, pH별로 PAF 액체배지에서 37℃에 12시간동안 150 rpm의 교반상태로 배양하였다.
- 질산이온 흡수에 대한 온도의 영향을 확인하기 위하여 pH를 7.0으로 고정하고 배양온도를 달리하여 균주의 질산이온 흡수를 측정하였다(Fig. 5). 균주를 20, 25, 37, 45℃의 각 온도조건에서 배양하면서 흡광도를 측정한 결과, 20℃에서는 성장이 매우 늦었고 질산이온의 흡수도 약 10%로 거의 이루어지지 않았다.
- 미생물 균주에 의한 질산이온 흡수는 균주의 배양중 배지에 남아있는 질산이온의 양을 정량분석하여 측정하였다. 질산이온의 농도는 질산이온전극과 표준전극(double junction reference electrode)을 이용한 이온분석기(Ion Selective Analyzer, Orion 960 ISE meter)를 사용하여 측정하였다(Kang과 Hong, 2004). 표준용액과 배양액 시료의 측정은 50:1 (v/v)의 비율로 이온강도조정용액(Ion Strength Adjuster)을 섞은 후에 이루어졌다, 전극은 사용하기 전에 50 ppm의 질산이온 표준용액에 2시간동안 안정화시키고, 분석 전에 5 ppm과 50 ppm의 질산이온표준용액을 사용하여 보정을 하였다.
- 양계장과 양돈장을 포함하는 축산농가의 하수 배출구 주위 환경에서 시료를 채취하여 높은 농도의 질산이온을 함유하는 선택배지에서 배양하였다. 총 6종의 미생물 균주를 콜로니의 색과 모양에 따라 분리하였고, 균주의 성장과 질산이온 흡수력을 측정하였다(Fig. 1). 균주중 PCE3 균주는 탁월한 성장력과 더불어 높은 질산이온 흡수능력을 갖고 있었다.
대상 데이터
- 양계장과 양돈장을 포함하는 축산농가의 하수 배출구 주위 환경에서 시료를 채취하여 높은 농도의 질산이온을 함유하는 선택배지에서 배양하였다. 총 6종의 미생물 균주를 콜로니의 색과 모양에 따라 분리하였고, 균주의 성장과 질산이온 흡수력을 측정하였다(Fig.
데이터처리
- 질산이온 흡수능력이 탁월한 PCE3 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 유전자 증폭방법을 통하여 결정하였다. PCE3 균주의 염기서열은 BLASTn 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 유전자은행에 등록하였다(GenBank Accession No. KC544070). PCE3 균주는 phylogenetic tree 분석을 통하여 Bacillus에 속하는 균주임을 확인하였으나, 기존에 보고된 유전자은행의 균주들 중 유전자 서열에서 상동성이 98% 이상인 균주를 찾을 수 없어 Bacillus sp.
- 다른 균주와의 유전자 염기서열 상동성은 BLASTn(NCBI, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 결정하였다. 계통수 분석은 neighbor-joining 방법에 따라 만들어졌으며, 진화적 거리는 ClustalW 프로그램을 사용하여 계산하였다.
이론/모형
- 분리한 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석하고 염기서열비교방법을 통하여 동정하였다. 유전자 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co.
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