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문제 정의
- 또한 박테리아의 PLD는 산업적으로 유용하게 이용될 수 있는 가능성까지도 있다. 따라서 본 연구에서는 bacteria의 일종인 BacilhK에서 PLD 유전자를 분리하여 E. coli 에서 발현시킨 다음 순수 분리하여 그 생화학 특성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 따라서 분리된 효소는 일반적인 효소의 최적 온도인 37°C보다 조금 높은 온도에서 최적 활성도를 보이는 특성을 나타내고 있다. 다른 bacteria인 Streptomyces 종류에서 분리된 PLD 들도 비교적 높은 온도에서 최적 활성을 보이고 있어 본 실험과 비슷한 결과를 나타 내었다 [Juneja 등, 1988; Hatanaka 등, 2002; Simkhada 등, 2007], 분리된 효소의 열 안정성은 효소를 45, 55, 및 65。(2의 온도에서 일정시간 동안 보존한 다음 잔여 활성도를 측정하는 방법으로 실험하였다(Fig. 5). 이러한 온도에서 20분 동안 열처리시킨 이후의 잔여 활성도는 각각 73, 51, 33%의 활성도를 나타내었다.
- 0에서 표준 효소활성 측정 방법에 의해 PLD의 효소 활성도를 측정하였다. PLD의 효소 활성도에 미치는 온도효과는 최적 pH 조건 하에서 15。(3에서 50°C의 범위의 서로 다른 온도에서 효소 반응을 시킨 후 표준 효소활성도 측정법으로 잔여 활성도를 측정하였다. 나머지 모든 조건은 표준 활성도 측정법에 의하여 활성도를 측정하였다.
- Bacillus 로 부터의 PLD 후보 유전자는 NCBI 유전자은행(1191 bp; NCBI, GI3028580)을 참조하여 선정하였다. PLD 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 분리하기 위하여 sense primer 로서 5-ttg gtg ccg ctt atg att atg gta-3을 그리고 antisense primer 로서 5'- taa aaa gaa tga aat cga ttt cgc-3를 이용하였다. 증폭되는 유전자는 발현벡터에서 His-6 재조합 단백질을 만들기 위하여 stop codon을 제거하도록 프라이머를 구성하였다.
- 5 mL/min 의 비교적 느린 속도로 용출시키며 단백질 분획을 회수하였다. PLD를 함유하는 단백질 분획은 효소 활성도를 측정하여 추적하였다. 효소 활성도를 갖는 단백질 분획들은 완충용액 C (20 mM Tris-HCl, pH 7.
- 0 또는 80을나타내에Imamura 와 Horiuti, 1979; Simkhada 등, 2007] 본 실험에서와 약간의 차이만을 보이고 있다. PLD의 안정성에 미치는 pH 의 효과를 여러 pH 범위에서 조사하였으며 비교적 충분한 시간인 4시간 동안의 처리 이후 표준 효소 활성도 측정법으로 활성도를 조사한 결과가 Fig. 3과 같다. 잔여 활성도를 측정하였을 때 PLD는 전반적으로 산성 또는 알칼리성 보다는 중성 pH에서 비교적 안정함을 보이고 있다.
- PLD의 활성도에 미치는 pH 효과를 시험하기 위하여 pH 5.0에서 11.0까지의 서로 다른 pH 조건에서 효소 활성도를 측정하였다(Fig. 2). 최적 활성도는 pH 7.
- 효소반응은 기질과 효소를 첨가하여 시작하였고 37T에서 30 분간 반응시킨 후 100°C에서 5분간 처리하여 효소반응을 중단시켰다. Phosphatase에 의하여 유리된 piiitrophenol의 생성량은 400 nm* 측정하여 계산 하였다. 효소 활성도 1 unit은 1분 동안에 1UMOL 이의 p-nitrophenol을 생산하는 효소의 량으로 정의하였다.
- 5 mM) 및 5-bromo4chloro-3- indolylD-galacto-pyranoside (75 ug/mL)를 함유하는 agar 함유 고체 배지에서 37°C 조건으로 24시간 동안 배양하였다' PLD 유전자를 함유하는 벡터는 상업용 plasmid 분리 kit (DyneBio, Daejon, Korea)를 사용하여 분리한 후 DNA sequence 분석에 의히여 목적 유전자의 삽입을 확인하였다. 목적하는 유전자가 삽입된 pGEM-T easy vector는 Nde I 및 Sal I으로 분해시켜 삽입 유전자를 추출한 후 역시 같은 제한 효소들로 절단시킨 pET-21(a)에 결합시켰다. 이렇게 민들어진 발현 벡터는 pET-21-pld 로 명명하였다.
- 분리된 PLD의 최적 온도를 시험하기 위하여 표준 효소 활성도 측정 조건에서 온도만 다르게 효소 활성을 측정하였다(Fig. 4). PLD 는 40-45P에서 최적 활성도를 나타내었고 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다.
- 여러 종류의 non ionic, anionic, 또는 zwitterionic detergent들이 PLD의 효소 활성도에 미치는 영향에 대하여 조사 하였다(Table 2). 여러 종류의 deteigent 중에서 non ionic deteigent인 Triton X-100이 PLD의 효소 활성도를 가장 많이 촉진시켰으며 zwitter ionic detergents CHAPS에 의해서도 상당한 효소 활성 촉진 효과가 있었다.
- 5, 200 mM NaCl, 20% glycerol, 및 2mM ED1A)를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 투석시켰다. 이중에서 효소 활성도가 가장 높은 분획을 이용하여 전기영동 분석 및 각종 생화학 실험을 수행하였다.
- 이렇게 서로 다른 완충용액에 녹인 효소는 실내온도(약 25°C)에서 4시간 동안 보존하였다. 잔여 활성도를 측정하기 위하여 50rL를 회수한 후 pH 7.0에서 표준 효소활성 측정 방법에 의해 PLD의 효소 활성도를 측정하였다. PLD의 효소 활성도에 미치는 온도효과는 최적 pH 조건 하에서 15。(3에서 50°C의 범위의 서로 다른 온도에서 효소 반응을 시킨 후 표준 효소활성도 측정법으로 잔여 활성도를 측정하였다.
- PLD 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 분리하기 위하여 sense primer 로서 5-ttg gtg ccg ctt atg att atg gta-3을 그리고 antisense primer 로서 5'- taa aaa gaa tga aat cga ttt cgc-3를 이용하였다. 증폭되는 유전자는 발현벡터에서 His-6 재조합 단백질을 만들기 위하여 stop codon을 제거하도록 프라이머를 구성하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 5분 동안 denaturation, 58℃에서 20초 동안 annealing, 72C에서 1분 30초 동안 amplification의 과정을 25회 반복하여 수행하였다.
- PCR 반응조건은 94℃에서 5분 동안 denaturation, 58℃에서 20초 동안 annealing, 72C에서 1분 30초 동안 amplification의 과정을 25회 반복하여 수행하였다. 증폭된 유전자를 pET-21(a) 발현 벡터에 삽입시키기 위하여 N-terminal의 시작 부위에 Nde I을 부착하기 위한 2 차 PCR을 시도하였으며 이때 sense primei로서 5'-cat atg gtg ccg ctt atg att atg-3, (밑줄 부분은 Nde I 적응부위)을 이용하였고 antisense primer는 1차 PCR에서와 같은 primer를 사용하였으며 PCR 조건도 같았다. 이렇게 얻어진 PCR 산물은 분리하여 pGEM-T Easy vector (Promega, Sanfrancisco, CA) 에 결합시킨 다음에 E.
- 통과시켰다. 컬럼은 완충용액 B (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 500 mM NaCl, 및 80mM imida刼e)로 씻어냈고 이어서 resir에 결합된 단백질은 추출용 완충용액(50 mM Tris-HCl pH 7.9, 500 mM Nad, 및 50-1000 mM imidazole linear gradient)을 이용하여 0.5 mL/min 의 비교적 느린 속도로 용출시키며 단백질 분획을 회수하였다. PLD를 함유하는 단백질 분획은 효소 활성도를 측정하여 추적하였다.
- coli DH5a 세포에 형질전환 시켰다. 형질 전환된 대장균은 ampicillin (100 gg/mL), isopropyl P-D- thiogalacto-pyranoside (IPTG; 0.5 mM) 및 5-bromo4chloro-3- indolylD-galacto-pyranoside (75 ug/mL)를 함유하는 agar 함유 고체 배지에서 37°C 조건으로 24시간 동안 배양하였다' PLD 유전자를 함유하는 벡터는 상업용 plasmid 분리 kit (DyneBio, Daejon, Korea)를 사용하여 분리한 후 DNA sequence 분석에 의히여 목적 유전자의 삽입을 확인하였다. 목적하는 유전자가 삽입된 pGEM-T easy vector는 Nde I 및 Sal I으로 분해시켜 삽입 유전자를 추출한 후 역시 같은 제한 효소들로 절단시킨 pET-21(a)에 결합시켰다.
- PLD를 함유하는 단백질 분획은 효소 활성도를 측정하여 추적하였다. 효소 활성도를 갖는 단백질 분획들은 완충용액 C (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 20% glycerol, 및 2mM ED1A)를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 투석시켰다. 이중에서 효소 활성도가 가장 높은 분획을 이용하여 전기영동 분석 및 각종 생화학 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 전체의 genomic DNA는 genomic DNA 분리 kit (Bioneer, Daejon, Korea)를 사용하여 분리히였으며 -2(/C에 보존하면서 실험에 사용하였다. Bacillus 로 부터의 PLD 후보 유전자는 NCBI 유전자은행(1191 bp; NCBI, GI3028580)을 참조하여 선정하였다. PLD 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 분리하기 위하여 sense primer 로서 5-ttg gtg ccg ctt atg att atg gta-3을 그리고 antisense primer 로서 5'- taa aaa gaa tga aat cga ttt cgc-3를 이용하였다.
- 본 실험에서 사용된 Bacillus licheniformis (KACC 10476)는 Korean Agricultural Culture Collection (KACC)에서 분양을 받았으며 beef extract 1.0 g/L, yeast extract 2.0 g/L, peptone 5.0 g/L 및 NaCl 5.0 g/L로 제조된 배지에서 배양하였다. E.
- 전체의 genomic DNA는 genomic DNA 분리 kit (Bioneer, Daejon, Korea)를 사용하여 분리히였으며 -2(/C에 보존하면서 실험에 사용하였다. Bacillus 로 부터의 PLD 후보 유전자는 NCBI 유전자은행(1191 bp; NCBI, GI3028580)을 참조하여 선정하였다.
- 즉, 효소반응은 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 10 mM CaCI2, p-nitrophenylphosphocholine (25 gmol), 2.5 unit 의 phosphatase (from potato, Sigma, St Louis, Missouri) 용액을 이용하였다. 효소반응은 기질과 효소를 첨가하여 시작하였고 37T에서 30 분간 반응시킨 후 100°C에서 5분간 처리하여 효소반응을 중단시켰다.
이론/모형
- PLD의 효소활성도는 D'Arrigo 등의 방법[1955]에 따라 spectrophotometry의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 효소반응은 50 mM Tris-HCl (pH 7.
- PLD의 효소 활성도에 미치는 온도효과는 최적 pH 조건 하에서 15。(3에서 50°C의 범위의 서로 다른 온도에서 효소 반응을 시킨 후 표준 효소활성도 측정법으로 잔여 활성도를 측정하였다. 나머지 모든 조건은 표준 활성도 측정법에 의하여 활성도를 측정하였다. PLD의 효소활성에 미치는 2가 금속이온의 영향은 표준 활성도 측정법의 조건에서 금속이온을 첨가하는 방법에 의하였고 나머지 모든 조건은 같았다.
- 단백질 농도는 Bradford[1976]의 방법에 준했으며 표준 단백질로 bovine serum albumin을 사용 하였다. 전기영동(SDS-PAGE)은 Laemmli [1970]의 방법에 따라서 5% 의 stacking gel과 12.
- 0은 Tris-HCl 완충용액을 사용하였다. 이와 같이 효소 반응을 위한 완충 용액만 다르게 한 후 효소 반응은 상기와 같이 표준 효소반응 측정법으로 활성도를 측정하였다. pH 변화가 효소의 안정성에 미치는 영향을 실험하기 위하여 분리된 효소 분획 100 UL 를 서로 다른 왼충액에 녹였으며 이때 사용된 완충액의 pH 범위는 4.
- 하였다. 전기영동(SDS-PAGE)은 Laemmli [1970]의 방법에 따라서 5% 의 stacking gel과 12.5%의 resolving gel을 사용하였고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 단백질들을 염색하였다.
성능/효과
- 0 mM)의 효소 활성도를 나타내었다. Mn2+, Co2+, Zn2+, Fe2+ 또는 Cu거' 이온은 효소 활성을 상당히 억제하는 현상을 나타내었다. 한편 S chromqfitscus의 PLD는 철 및 망간에 의해 효소 활성이 촉진되며 [Zambonelli 등, 2003] Streptomyces sp.
- 4). PLD 는 40-45P에서 최적 활성도를 나타내었고 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다. 비교적 높은 온도인 5(FC의 온도 조건에서도 최대 활성도의 약 60%의 효소 활성도를 나타내었다.
- coli 에서의 발현시킬 때 어려움을 겪는 경우가 종종 있다. 그런데 본 실험에서는 PLD가 용해성 상태로 발현되었는데도 균주가 지속적으로성장한 점으로 보아 본 실험의 효소와 약 41% homology를 보이며 독성을 나타내는 C. pseudotuberculosis 의 PLD 와는 서로 다른 것으로 판단된다.
- coli는 보다 낮은 온도인 2WC의 조건에서 비교적 느린 속도인 50rpm으로 교반 하면서 배양하였으며 이러한 조건에서 용해성 단백질을 얻어냈다. 단백질이 발현되는 균체는 2시간 간격으로 16시간 까지 표본을 채취하고 효소 활성도를 측정한 결과 이러한 조건에서는 10시간 가량 발현시킬 때 16.8 U/mg protein 을 나타내 상대적으로 가장 많은 PLD가 생성되는 것으로 판단 되었다. 따라서 이 조건에서 발현시킨 단백질은 세포내에 상당히 높은 비율로 축적된 상태이기 때문에 친화크로마토그라피로 비교적 쉽게 분리 되었다(Fig.
- 동물 세포에서 분리된 PLD는 detergent의 일종인 Triton X-100에 의해 용해도와 활성도 모두가 증가되는경우가 많아 PLD 활성도를 측정할 경우에 detergent를 첨가하는 경우가 종종 있다[Kanoh 등, 1991; Horwitz와 Davis, 1993]. 따라서 본 실험에서 분리된 bacteria 기원의 PLD에 대하여서도 detergent 효과를 측정한 결과 Triton X-100에 의하여 효소 활성도가 증대하였다. 이러한 결과는 다른 bacteria인 Streptomyces 종에서 분리된 PLD들과 비슷한 결과를 나타내고있에Shimkada 등, 2007; Mander 등, 2009] 본 실험에서 분리된 PLD 와 비슷한 용해 특성을 보이는 것으로 판단된다.
- 그러나 25°C의 온도 조건 에서는 약 45%의 효소 활성도를 나타내었다. 따라서 분리된 효소는 일반적인 효소의 최적 온도인 37°C보다 조금 높은 온도에서 최적 활성도를 보이는 특성을 나타내고 있다. 다른 bacteria인 Streptomyces 종류에서 분리된 PLD 들도 비교적 높은 온도에서 최적 활성을 보이고 있어 본 실험과 비슷한 결과를 나타 내었다 [Juneja 등, 1988; Hatanaka 등, 2002; Simkhada 등, 2007], 분리된 효소의 열 안정성은 효소를 45, 55, 및 65。(2의 온도에서 일정시간 동안 보존한 다음 잔여 활성도를 측정하는 방법으로 실험하였다(Fig.
- PLD 는 40-45P에서 최적 활성도를 나타내었고 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다. 비교적 높은 온도인 5(FC의 온도 조건에서도 최대 활성도의 약 60%의 효소 활성도를 나타내었다. 그러나 25°C의 온도 조건 에서는 약 45%의 효소 활성도를 나타내었다.
- 2). 최적 활성도는 pH 7.0 근처에서 나타났으며 pH 9.0의 조건에서도 여전히 최대 활성도의 65%를 보였다. 약산성인 pH 6.
- 0에서도 여전히 82%의 잔여 활성도를 보이고 있다. 한편 비교적 산성인 pH 5.0 또는 알칼리성인 pH 9.0으로 pH 가 변화할 경우 각각 64 및 60%의 잔존활성도를 나타내어 점점 효소의 안정도가 떨어짐을 알 수 있었다.
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