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문제 정의
- 이 중 NO는 체내 방어기능 등 다양한 생리기능을 가지고 있으며, NO의 형성은 박테리아나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다[Stuehr 등, 1991; McCartney-Francis 등, 1993; Weisz 등, 1996]. 따라서 본 연구에서는 Raw264.7 cell 의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 황백추출물과 Jatrorrh血ine을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 Fig. 4와 같이 나타내었다. LPS 처리군은 LPS 무 처리 군에 비하여 2배에 가까운 200% 정도의 NO 발현을 나타내었으며, 각각의 시료는 모두 농도 의존적으로 NO 발현을 억제하였으며 100 ug/mL必 농도에서 각각 황백추출물은 70% 이상의 억제 효과를 나타내었으며, Jatrorrhizine의 경우 60%의 NO 발현을 억제함을 확인 할 수 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 생리활성 탐색연구의 일환으로 민간에서 한약재로 널리 사용되어지고 있는 황백(/ ^物化纨阳冲서 염증 억제 효과를 가지는 물질이 있음을 확인하고, 유용성분들을 분리, 동정하였으며, macrophage cell 라인인 Raw cell을 이용하여 항염증 효과를 검정하기 위하여 세포내의 단백질의 변화를 Western blotting을 통하여 염증억제효과를 검토하였다.
제안 방법
- 있음이 확인되었다. "-BuOH 분획 농축물을 Sephadex LH-20 및 MCI gel CHP-20 column chromatography 로 정제한 결과 저해활성을 가지는 Jatrorrhizineg- 분리, 동정하였다. 황백추출물과 Jatrorrhizine은 모두 농도 의존적으로 NO 발현을 억제하였고, lOOjig/mL의 농도에서 60% 이상의 억제효괴를 나타내었다.
- 분리된 단백질은 semidry transfer cell 기기(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking bufler (5% skim milk in Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST))에서 배양시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 iNOS (BD Biosience, 1:1000, Sarrjose, CA), COX-2 (Cayman, 1:1000, Ann arbor, MI), Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Santa Cruz Biotechmology, Inc. 1:1000, Santa Cruz, CA) 1 차 항체를 희석하여 4W에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP), bovine anti-goat IgG HRP (Santacruz, l:1000)의 각각의 2차 항체를 1:1000g로 희석하여 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 뒤 암실에서 ECL (Millipore, Bedford, MA) 용액으로 반응시키고 X-ray filing 노출시켜 각각의 band를 Molecular Imager (Bio-Rad)를 이용하여 band를 정량화 하였다[Cho 등, 2008].
- 1:1000, Santa Cruz, CA) 1 차 항체를 희석하여 4W에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP), bovine anti-goat IgG HRP (Santacruz, l:1000)의 각각의 2차 항체를 1:1000g로 희석하여 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 뒤 암실에서 ECL (Millipore, Bedford, MA) 용액으로 반응시키고 X-ray filing 노출시켜 각각의 band를 Molecular Imager (Bio-Rad)를 이용하여 band를 정량화 하였다[Cho 등, 2008].
- NO 저해활성 측정. NO 측정은 cell의 supernatant에서의 NO 의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma Chemical Co.
- (COX-2) 활성 측정. iNOS protein 활성 즉정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw264.7 세포를 suspension을 100 n tissue culture dish 에 각 well 당 2x10, cells/mL cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 시료를 농도별(10, 100 卩以mL처리한배지로 24시간 배양한 후 또 다시 배지를 제거하고 phospate buffer saline (PBS)로 2번 세척해 준 후, Lysis bufler (Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) buffer lOmL에 complete mini 1 tablet을 가함) 100 mL로 용해해서 4℃ 12, 000 rpm에서 20분간 원심 분리 하였다.
- lmL 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각 시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3 mL을 가하여 3TC에서 20분간 배양한 다음 585nm에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출하였다.
- 분석. 핵자기 공명 분광기(NMR) spectrum의 측정은 FT 빙4겁 (Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수정제 물 10 mg을 측정 용매 CDCG+DMSO-Dg+DQ에 5-20% (w/v) 비율로 용해시키고 TMS [Tetramethylsilane; (CH^Si]를 기준물질로 하여 proton magnetic resonance (PMR) 300 MHz로 측정하였다.
- 생리활성물질의 정제 및 동정. 흡착성 성질을 가지는 Sephadex LH-20 column (5.0x95 cm)과 다공성 polystyren gel 로서 흡착성을 가지는 MCI-gel CHP 20P column (3乂50 cm)을충진한 후 용출용매로서 normal phase type으로 EtOHr H2O (100t0%), reverse phase type梦로 H2O->EtOH (OtIOO%贸순으로 용출시켜 thin layer 나ironWography (TLC) 상에서 물질의 분리유무를 확인하고 농축, 동결건조 하였다.
대상 데이터
- 항염증 효과 측정을 위한 세포배양. Murine macrophage cell line인 Raw264.7 cells은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 Gibco사의 fetal bovine serum (FBS)를 10%, 100 U/mL penicillin 및 100 卜ig/mL streptomycin 을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 2〜3xl0%nL 정도가 되게 계대 배양하여 5% CO2 조건으로 cell 상태를 유지하였다.
- 재료. 본 실험에 사용한 황백은 영천 소재의 약업사에서 구입하여 분쇄 후 저온저장 하면서 이용하였다.
이론/모형
- 1에서와 같이 n-BuOH 층에서 약 50% 이상 저해되는 것으로 나타나 hyaluronidase의 저해 효과가 있음이 확인되었다. 따라서 항염증 물질의 정제는 n- BuOH 분획으로 수행하였다. Choi 등[2003}은 오가피, 황기, 목과, 목단피, 오미자, 황금 추출물에 대한 hyaluronidase 저해 활성을 조사한 결과 ethyl acetate 분획물에서 44-65%의 저해 활성을 확인한 결과와 비교하였을 때 황백의 hyaluronidase 저해 능과 유사하게 나타났다.
성능/효과
- 황백 분획물로 부터 항염증 물질의 구조 동정. Compound A 를 구조 동정한 결과, 적황색 침상결정이었으며, 'H-NMR spectrum은 9.66과 8.72 ppm에서 각각 H-8, 13위치에 해당하는 singlet의 spectrum이 관찰되었으며, 7.93과 8.05 ppm에서 >=9.0 Hz로서 H-11, 12에 해당하는 doublet spectrum이 관찰되어, protoberberine의 구조를 가지고 있음이 추정되었다. 또한 7.
- 4와 같이 나타내었다. LPS 처리군은 LPS 무 처리 군에 비하여 2배에 가까운 200% 정도의 NO 발현을 나타내었으며, 각각의 시료는 모두 농도 의존적으로 NO 발현을 억제하였으며 100 ug/mL必 농도에서 각각 황백추출물은 70% 이상의 억제 효과를 나타내었으며, Jatrorrhizine의 경우 60%의 NO 발현을 억제함을 확인 할 수 있었다.
- 황백 분획물로 부터 항염증 물질의 정제. n-BuOH 분획 농축물을 Sephadex LH-20 column (5x95 cm)을 이용하여 H2O TEtOH로 gradient 용출한 결과 Fig. 2와 같이 4가지 분획물을 얻을 수 있었으며, 4가지 분획물 중 fraction (Fr) 2에서 hyaluronidase 저해활성이 확인되었다. Fr 2 농축액을 MCI gel CHP-20 column (3x50 cm)을 이용하여 EtOH^HQ로 gradient 용출하여 2차 분리를 수행한 결과 Fr 2-1 에서 Fr 2-5까지 5개의 분획물을 얻을 수 있었으며, Fr 2-2분획에서 hyaluronidase 저해활성이 검출되었다.
- 황백추출물과 Jatrorrhizine의 iNOS와 COX- 2의 억제력을 살펴본 결과, lOOjig/mL의 농도에서 45% 및 29%의 저해효과를 나타내었다. 따라서 황백추출물 및 Jatrorrhizine은 LPS로 유도되어진 대식세포주인 Raw264.7 세포에서의 염증반응의 억제효과를 기대할 수 있었다.
- 이는 salidroside의 iNOS 저해 활성에서 30%의 저해효과를 나타낸 결과보다 황백 추출물이 저해 효과가 높음을 확인할 수 있었다. 또 다른 염증 인자인 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과 황백 추출물의 경우 100 ng/mL에서 30%, Jatrorrhizine의 경우 100 gg/mL 농도에서 20% 미만의 저해 효과를 나타내었다. So 등[2004]과 Byun 등[2005}은 약용작물인 산더덕과 현삼 추출물에 의해 대식세포에서 iNOS와 COX-2 발현이 저해되었다고 보고하였으며 , 본 연구에서도 약용작물의 일종인 황백추출물에서 iNOS와 COX-2에 대해 높은 억제 효과를 나타내는 것으로 보아 NO와 상호 작용을 가진 iNOS 및 COX-2 발현억제에 의해 LPS로유도되어진 대식세포주인 Raw264.
- 또한 Jateorrhizine의 경우 각각 100 卩g/mL의 농도에서 13, 29%의 저해효과를 나타내었다. 이는 salidroside의 iNOS 저해 활성에서 30%의 저해효과를 나타낸 결과보다 황백 추출물이 저해 효과가 높음을 확인할 수 있었다. 또 다른 염증 인자인 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과 황백 추출물의 경우 100 ng/mL에서 30%, Jatrorrhizine의 경우 100 gg/mL 농도에서 20% 미만의 저해 효과를 나타내었다.
- 1 ppm (C-4)보다 down shift되어 나타나므로 C-3 위치에 hydroxy기가 치환되어 있는 것으로 추정하였다. 이상의 결과로 보아 Virinder 등[199기과 Ying 등[2005]이 보고한 문헌의 spectrum ['H- NMR: 4.12 ppm (C-2 OCH3), 4.18 ppm (C-10 OCH3), 4.27 ppm (C-9 OCH3), 6.95 ppm (H-4), 7.73 ppm (H-l), 8.07 ppm (H-ll), 8.15ppm (H-12), 8.84ppm (H-13), 9.85ppm (H-明과 거의 일치하여 compound A는 Jatrorrhizine$로 동정하였다.
- 황백으로부터 h-BuOH 추출물에서 약 50%의 hyaluronidase 저해효과가 있음이 확인되었다. "-BuOH 분획 농축물을 Sephadex LH-20 및 MCI gel CHP-20 column chromatography 로 정제한 결과 저해활성을 가지는 Jatrorrhizineg- 분리, 동정하였다.
- 황백으로부터 용매추출을 수행한 결과 Fig. 1에서와 같이 n-BuOH 층에서 약 50% 이상 저해되는 것으로 나타나 hyaluronidase의 저해 효과가 있음이 확인되었다. 따라서 항염증 물질의 정제는 n- BuOH 분획으로 수행하였다.
- 그러므로 C0X-2에 선택적인 inhibitor의 개발은 염증 치료 target molecule이 되고 있다. 황백추출물과 Jatrorrhizin^l] 의한 NO 생성저해 기전을 확인하기 위해 Western blot으로 NOS의 단백질 생성을 측정한 결과 Fig. 5, 6과 같이 황백 추출물의 경우 대조군에 비해 100卩g/mL의 농도에서 45%£] 높은 억제 효과를 나타내었고, 농도 의존적으로 감소하는 효과를 관찰할 수 있었으며, 특히, 100 n曾mL의 농도에서 53%의 억제능을 확인할 수 있었다. 또한 Jateorrhizine의 경우 각각 100 卩g/mL의 농도에서 13, 29%의 저해효과를 나타내었다.
- "-BuOH 분획 농축물을 Sephadex LH-20 및 MCI gel CHP-20 column chromatography 로 정제한 결과 저해활성을 가지는 Jatrorrhizineg- 분리, 동정하였다. 황백추출물과 Jatrorrhizine은 모두 농도 의존적으로 NO 발현을 억제하였고, lOOjig/mL의 농도에서 60% 이상의 억제효괴를 나타내었다. 황백추출물과 Jatrorrhizine의 iNOS와 COX- 2의 억제력을 살펴본 결과, lOOjig/mL의 농도에서 45% 및 29%의 저해효과를 나타내었다.
- 황백추출물과 Jatrorrhizine은 모두 농도 의존적으로 NO 발현을 억제하였고, lOOjig/mL의 농도에서 60% 이상의 억제효괴를 나타내었다. 황백추출물과 Jatrorrhizine의 iNOS와 COX- 2의 억제력을 살펴본 결과, lOOjig/mL의 농도에서 45% 및 29%의 저해효과를 나타내었다. 따라서 황백추출물 및 Jatrorrhizine은 LPS로 유도되어진 대식세포주인 Raw264.
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