Prunus sargentii of Rosaceae familiy, has been reported to have radical scavenging activity and anti-inflammatory effect. On these facts, this research was conducted to evaluate pharmaceutical activities of the bark extracts P. sargentii. Free radical scavenging activities of fraction (Fr) -5${...
Prunus sargentii of Rosaceae familiy, has been reported to have radical scavenging activity and anti-inflammatory effect. On these facts, this research was conducted to evaluate pharmaceutical activities of the bark extracts P. sargentii. Free radical scavenging activities of fraction (Fr) -5${\sim}$10 isolated from P. sargentii was higher than 80% respectively at 10ppm. The superoxide dismutase (SOD)-like activity of Fr-5, 9 were about 97, 84%, respectively at 1,000 ppm. Xanthine oxidase inhibitory effect of Fr-9, 10 were about 75, 78%, respectively at 1,000 ppm. The tyrosinase inhibitory effect related to skin-whitening was 72, 68% in Fr-2, 9 isolated from Prunus sargentii R. at 1,000 ppm. Hyaluronidase inhibition activity related to the anti-inflammation effect was 98% for Fr-8 at 500 ppm. Isolation of the methanol soluble fraction from P. sargentii yielded two major phenol compounds, (-)-epicatechin and taxifolin. The structure of the compound was certainly determined by chemical analyses, as well as NMR and Mass spectroscopy. The present study was carried out in a search for new cosmetic material from the bark from P. sargentii. and, (-)-epicatechin and taxifolin were isolated as active principles. So P. sargentii R. methanolic extracts may be used for the cosmetic material.
Prunus sargentii of Rosaceae familiy, has been reported to have radical scavenging activity and anti-inflammatory effect. On these facts, this research was conducted to evaluate pharmaceutical activities of the bark extracts P. sargentii. Free radical scavenging activities of fraction (Fr) -5${\sim}$10 isolated from P. sargentii was higher than 80% respectively at 10ppm. The superoxide dismutase (SOD)-like activity of Fr-5, 9 were about 97, 84%, respectively at 1,000 ppm. Xanthine oxidase inhibitory effect of Fr-9, 10 were about 75, 78%, respectively at 1,000 ppm. The tyrosinase inhibitory effect related to skin-whitening was 72, 68% in Fr-2, 9 isolated from Prunus sargentii R. at 1,000 ppm. Hyaluronidase inhibition activity related to the anti-inflammation effect was 98% for Fr-8 at 500 ppm. Isolation of the methanol soluble fraction from P. sargentii yielded two major phenol compounds, (-)-epicatechin and taxifolin. The structure of the compound was certainly determined by chemical analyses, as well as NMR and Mass spectroscopy. The present study was carried out in a search for new cosmetic material from the bark from P. sargentii. and, (-)-epicatechin and taxifolin were isolated as active principles. So P. sargentii R. methanolic extracts may be used for the cosmetic material.
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문제 정의
산벚나무 수피의 radical 소거능과 항염증 효과가 보고되고 있어, 이를 이용하여 화장품원료로 이용하고자 분획물의 생리 활성 및 안정성을 살펴보았다. 산벚나무 수피 추출물의 분획물 Fr.
2003). 이에 본 연구에서는 항산화 및 항염 효과가 우수한 물질을 탐색하기 위하여, 산벚나무 수피 추출 물을 분획하여 생리활성 및 페놀성 화합물을 분리하였으며, 분 획된 물질들의 생리활성을 검증하였다.
제안 방법
각 분취 시료는 박층크로마토그래피 (Thin layer chroma- tography, TLC)에 의해 TLC 플레이트상에 전개된 spot 패턴을 UV 램프로 확인하였으며, 동일 주황색 spot이 확인되면, 서로 합쳐 감압농축한 후 행하였다. 1차 open column에 의해 10개의 분획을 분리한 후, 항산화 실험 및 수율을 고려하여 분획 3과 5를 2, 3, 4차 open column을 실시하여 최종 compound 1과 2를 얻었다. 이 분획물들을 Bondapack C18 stainless steel column (4.
Compound 1과 2 분자량 측정은 high resolution mass spectrometer (Jeol, UK) JMS 700을 사용하여 positive FAB- Mass 방법으로 분자량을 측정하였다, 즉 시료 1 mg을 감압상태 (10-6 ~10-8 mmHg)에 가열 (10(^300°C) 기화시킨 후 시료를 메탄올에 용해시켜 m-NO2-Benzyl-OH matrix# 이용하여 측정하였으며, 이온원의 가속감압을 2〜3kY 이온화의 전압은 22-28 eY 시료 온도는 50°C에서 질량 분석을 하였다.
이때 용출 용매는 메탄올 : 증류수 (20% t 100%), 에 탄올 :증류수 (30% T 100%), 메 탄올 :증류수 (40%— 60%)를 사용하여 화합물 1을 분리하였다. Fraction 5 는 MCI gel CHP 20P 및 Sephadex LH-2Q을 사용하여 정 제하였으며 , 이때 용출 용매는 메탄올 : 증류수 (20% t 100%) 및 메탄올 : 증류수 (30% t 60%)를 사용하여 화합물을 2를 정제하였다 (Fig. 1).
Hyaluronidase 저해활성 측정은 sodium-hyaluronic acid로부 터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethyl-aminobenzaldehyde (DMAB)로 발색시켜 홉광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다 (Reissig et al., 1955). 0.
Open column에서 분리된 분획물을 HPLC (Waters, USA) 로 정량분석을 실시하였다. Column은 bondapack C18 stainless steel column (4.
각 분취 시료는 박층크로마토그래피 (Thin layer chroma- tography, TLC)에 의해 TLC 플레이트상에 전개된 spot 패턴을 UV 램프로 확인하였으며, 동일 주황색 spot이 확인되면, 서로 합쳐 감압농축한 후 행하였다. 1차 open column에 의해 10개의 분획을 분리한 후, 항산화 실험 및 수율을 고려하여 분획 3과 5를 2, 3, 4차 open column을 실시하여 최종 compound 1과 2를 얻었다.
, USA)로 확인하였으며, 발색시약으로는 benzene : ethylformate : formic acid = 2 : 7 : 1의 용액을 사용하 였다. 각 분획물을 실리카겔 TLC로 전개시켜 spot 패턴을 확인한 후, 발색시약으로 페놀성 화합물을 동정한 다음, 분획물을 동결건조하여 시료로 사용하였다.
SOD 유사활성은 Marklund & Marklund (1974)의 방법에 따라 실시하였다. 각 시료용액 0.2ml 에 Tris-HCl의 완충용액 (50mM Tris+10mM EDTA, pH 8.5) 2.6ml와 7.2mM pyrogallol 0.2가하여 25°C에서 10분간 반응시킨 후 1.0N HC1 0.1 mC 를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420nm에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 실험군와 대조군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
경북 포항 죽장면에서 자생하는 산벚나무 (Prunus sargentii Rehder) 수피 300 g를 70% 메탄올에 침지하여 실온에서 3회 추출, 여과한 후 감압 농축하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피 (메탄올 : 증류수 — 0: W 1: 0)로 elution 시키고 마지막으로 아세톤으로 세척한 후, TLC를 실시하여 10개의 fraction (Fr. 1〜10)으로 분획하였다. 이중 fraction 3으로부터 MCI gel CHP 20P, Sephadex LH.
분광분석법 인 Fourier transform infrared spectroscopy (FT- IR) 측정은 액막법을 이용하였으며, compound 1과 2 분획물 은 Genesis II FT-IRTM spectrometer (Mattson, USA)를 사용하여 측정 하였다. 고체 시료를 에탄올에 녹여 NaCl plate (25 x 4 mm, Specta-Tech Inc., USA)에 1 〜2방울 떨어뜨린 후, 또 다른 한 장의 NaCl plate를 겹치게 하여 측정하였다 (An & Lee, 1999; Kim, 2003; An et al.. 2006).
1 ml를 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제로 DMAB시약 3ml를 가하여 37°C에서 20분간 배양한 다음 585 ml 에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 측정하였다.
산벚나무 수피를 70% 메탄올로 추출하고 그 추출물을 Sephadex LH-20과 MCI gel을 반복하여 분리정제 하였다. 분리된 활성 물질을 HPLC, FT-IR, 1H, 13C-NMR and FAB-Mass를 통하여 확인한 결과 화합물의 구조는 (-)-epicatechin과 taxifolin으 로 결정하였다.
8에서 98%의 저해능을 나타내었다. 산벚나무 수피를 70% 메탄올로 추출하고 그 추출물을 Sephadex LH-20과 MCI gel을 반복하여 분리정제 하였다. 분리된 활성 물질을 HPLC, FT-IR, 1H, 13C-NMR and FAB-Mass를 통하여 확인한 결과 화합물의 구조는 (-)-epicatechin과 taxifolin으 로 결정하였다.
1차 open column에 의해 10개의 분획을 분리한 후, 항산화 실험 및 수율을 고려하여 분획 3과 5를 2, 3, 4차 open column을 실시하여 최종 compound 1과 2를 얻었다. 이 분획물들을 Bondapack C18 stainless steel column (4.6 x 150 mm)을 이용한 고속액체크로마 토그래피 (high perfbmance liquid chromatography, HPLC)를 실시하였다.
1〜10)으로 분획하였다. 이중 fraction 3으로부터 MCI gel CHP 20P, Sephadex LH.20을 단계적으로 사용하여 반복 정제하였다. 이때 용출 용매는 메탄올 : 증류수 (20% t 100%), 에 탄올 :증류수 (30% T 100%), 메 탄올 :증류수 (40%— 60%)를 사용하여 화합물 1을 분리하였다.
폴리페놀 정량은 AOAC (1984)에 준하여 정량하였다. 즉, 100게, 희석한 시료용액 3ml에 Folin-ciocalteu phenol 용액 1ml를 가하고, 포화 Na2CO3 용액 1 ml 를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, IN HC1 0.2ml을 가하여 640nm에서 흡광도를 측정한 후, 미리 작성한 tannic acid 표준곡선 의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
대상 데이터
03%)를 사용하였으며, chemical shift는 ppm 단위로 나타내었다. 13C-NMR spectrum도 Varian사의 125 MHz FT- NMR spectrometer를 사용하였으며, 1H-NMR과 같은 용매와 표준물질을 사용하여 나타내었다.
Compound 1과 2의 구조분석은 VMan사 (USA)의 1H- nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum 500 MHz FF NMR spectrometer를 사용하였으며, 용매는 CD3OD (Aldrich, USA)를 사용하였고, 내부 표준물질로는 tetramethylsilane (TMS 0.03%)를 사용하였으며, chemical shift는 ppm 단위로 나타내었다. 13C-NMR spectrum도 Varian사의 125 MHz FT- NMR spectrometer를 사용하였으며, 1H-NMR과 같은 용매와 표준물질을 사용하여 나타내었다.
데이터처리
통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산 분석 (ANOVAianalysis of variance)을 한 후 a = 0.05 수준에서 Duncan의 다중 검증법 (DMRT:Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다.
이론/모형
SOD 유사활성은 Marklund & Marklund (1974)의 방법에 따라 실시하였다. 각 시료용액 0.
Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi (1986) 등의 방법에 따라 측정 하였다. 반응구는 0.
Xanthine oxidase 저해활성 측정은 Stirpe & Corte (1969) 의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료용액 0.
분광분석법 인 Fourier transform infrared spectroscopy (FT- IR) 측정은 액막법을 이용하였으며, compound 1과 2 분획물 은 Genesis II FT-IRTM spectrometer (Mattson, USA)를 사용하여 측정 하였다. 고체 시료를 에탄올에 녹여 NaCl plate (25 x 4 mm, Specta-Tech Inc.
전자공여능 (EDA; electron donating abilities) 측정은 Blois (1958)의 방법을 따라 측정하였다. 각 시료용액 2 ml에 0.
폴리페놀 정량은 AOAC (1984)에 준하여 정량하였다. 즉, 100게, 희석한 시료용액 3ml에 Folin-ciocalteu phenol 용액 1ml를 가하고, 포화 Na2CO3 용액 1 ml 를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, IN HC1 0.
성능/효과
9와 같이 aromatic proton 영역에서 ABX 계 시그널 한쌍과 서로 meta-coupling한 2개의 proton, aliphatic 영역에서 2개의 oxymethine, 1개의 methylene 시그널이 관찰된 것으로부터 문헌과의 비교를 통하여 본 화합물은 카테킨류임을 시사하였다. "C-NMR데이터를 (~)-epicatechin과 비교하였을 때 모든 시그널 데이터가 일치하는 점 및 FAB Mass spectrum의 결과로부터 분자량이 290임을 확인하였다. (Fig.
"C-NMR데이터를 (~)-epicatechin과 비교하였을 때 모든 시그널 데이터가 일치하는 점 및 FAB Mass spectrum의 결과로부터 분자량이 290임을 확인하였다. (Fig. 10, 11) 따라서 본 화합물의 구조를 (-)-epicatechin으로 결정하였으며, 화합물의 절대구조를 결정하기 위해 선광도 값 을 측정한 결과 - [a]D21 = -51.2º로 나타나 (-)-epicatechin으 로 확정하였다 (Fig. 12).
화합물 1은 메탄올 추출물로부터 백색 분말상태로 얻어졌으며 TLC로 확인시, UW (254/365 nm)에서 강한 UV 흡수를 보였으며, 붉은색으로 발색되었다. HPLC 측정시 Fig. 7과 같이 단일피크를 확인할 수 있었으며, FT-IR 스펙트럼 측정 결과 Fig. 8에서 나타낸 바와 같이 OH 및 aromatic C = C로 추정되는 밴드가 강하게 나타났으므로 이 화합물은 페놀성 OH기를 가진 aromatic 화합물로 추청되었다. 또한 1H-NMR을 측정한 결과, Fig.
8에서 나타낸 바와 같이 OH 및 aromatic C = C로 추정되는 밴드가 강하게 나타났으므로 이 화합물은 페놀성 OH기를 가진 aromatic 화합물로 추청되었다. 또한 1H-NMR을 측정한 결과, Fig. 9와 같이 aromatic proton 영역에서 ABX 계 시그널 한쌍과 서로 meta-coupling한 2개의 proton, aliphatic 영역에서 2개의 oxymethine, 1개의 methylene 시그널이 관찰된 것으로부터 문헌과의 비교를 통하여 본 화합물은 카테킨류임을 시사하였다. "C-NMR데이터를 (~)-epicatechin과 비교하였을 때 모든 시그널 데이터가 일치하는 점 및 FAB Mass spectrum의 결과로부터 분자량이 290임을 확인하였다.
13〜18과 같으며, 화합물 2 는 백색 분말이며, aromatic 영역에는 ABX계 시그널 한쌍,meta coupling한 시그널 2개와 2개의 oxygenated proton이 관찰되었으며, 이는 플라보노이드계 화합물임을 시사했다. 본 화합물의 13C-NMR 데이터 및 FAB Mass로부터의 분자식을 고려하여 본 화합물은 Fig. 18에 나타낸 구조의 3, 3', 4\ 5, 7-pentahydroxyflavanone, 즉 dihydroquercetin인 taxifolin임이 중명되 었다.
화합물 2를 분석한 결과는 Fig. 13〜18과 같으며, 화합물 2 는 백색 분말이며, aromatic 영역에는 ABX계 시그널 한쌍,meta coupling한 시그널 2개와 2개의 oxygenated proton이 관찰되었으며, 이는 플라보노이드계 화합물임을 시사했다. 본 화합물의 13C-NMR 데이터 및 FAB Mass로부터의 분자식을 고려하여 본 화합물은 Fig.
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