[논문]Tetrameric β를 이용한 고초균 포자에서의 미생물 표면 발현 모체 선별

김준형; 반재구; 김병기

doi:10.7841/ksbbj.2011.26.3.199

Tetrameric β를 이용한 고초균 포자에서의 미생물 표면 발현 모체 선별
Screening of Bacterial Surface Display Anchoring Motif Using Tetrameric β-galactosidase in Bacillus subtilis Spore 원문보기

KSBB Journal, v.26 no.3, 2011년, pp.199 - 205

김준형 (동아대학교 화학공학과) , 반재구 (한국생명공학연구원) , 김병기 (서울대학교 화학생물공학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Using tetrameric ${\beta}$-galactosidase as a model protein, anchoring motives were screened in Bacillus subtilis spore display system. Eleven spore coat proteins were selected considering their expression levels and the location in the spore coat layer. After chromosomal single-copy homologous integration in the amyE site of Bacillus subtilis chromosome, cotE and cotG were chosen as possible spore surface anchoring motives with their higher whole cell ${\beta}$-galactosidase activity. PAGE and Wester blot of extracted fraction of outer layer of purified spore, which express CotE-LacZ or CotG-LacZ fusion verified the existence of exact size of fusion protein and its location in outer coat layer of purified spore. ${\beta}$-galactosidase activity of spore with CotE-LacZ or CotG-LacZ fusion reached its highest value around 16~20 h of culture time in terms of whole cell and purified spore. After intensive spore purification with lysozyme treatment and renografin treatment, spore of BJH135, which expresses CotE-LacZ, retained only 1~2% of its whole cell ${\beta}$-galactosidase activity. Whereas spore of BJH136, which has cotG-lacZ cassette in the chromosome, retained 10~15% of its whole cell ${\beta}$-galactosidase activity, proving minor perturbation of CotG-LacZ, when incorporated in the spore coat layer of Bacillus subtilis compared to CotE-LacZ. Usage of Bacillus subtilis WB700, of which 7 proteases are knocked-out and thereby resulting in 99.7% decrease in protease activity of the host, did not prevent the proteolytic degradation of spore surface expressed CotG-LacZ fusion protein.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

표면 발현 모체 선정을 위한 목적 단백질로는 각각의 크기가 116 kDa인 monomer 단백질이 dimer 혹은 tetramer를 형성하여야만 효소의 활성을 가지는 galactosidase를 이용할 것이다. [15], 이러한 크기와 tetramer를 이루는 특성은 일반적인 미생물의 세포막을 통해서는 분비되기 힘들기 때문에 본 실험에 적합한 목적 단백질이라 할 수 있다.
본 논문에서는 상기에서 기술된 기존 미생물 표면 발현시스템의 여러가지 문제점을 해결할 수 있는, 고초균의 포자를 이용한 표면발현 시스템 개발을 위해서 가장 중요한 표면 발현 모체를 선정하고자 한다. 표면 발현 모체 선정을 위한 목적 단백질로는 각각의 크기가 116 kDa인 monomer 단백질이 dimer 혹은 tetramer를 형성하여야만 효소의 활성을 가지는 galactosidase를 이용할 것이다.
본 연구에서는 기존의 미생물 표면 발현 시스템이 가진 문제점을 해결하기 위하여, 고초균 포자를 이용한 표면 발현 시스템 개발을 위한 적절한 표면 발현 모체가 선정되었다. 주로 고초균 포자 형성 단백질을 대상으로 하여 선별한 결과 cotE 와 c"G유전자가 목적 단백질인 0-galactosidase의 표면 발현에 가장 효과적인 것으로 판명이 되었다.
&"galactosidase는 a-complementation를 이용한 클로닝 시스템에서의 응용과 ^-galactosidase 효소 활성을 이용한 다양한 reporter gene으로서의 활용으로 생물학 및 생물공학에서 가장 널리 이용되는 유전자 중의 하나이다. 서론에서 기술한 바와 같이 [egalactosidase 의 큰 사이즈와 dimer 혹은 tetramer 를 형성하여야만 효소의 활성을 가지는 특성은 일반적인 미생물의 세포막을 통해서는 분비되기 힘들기 때문에 본 실험에 적합한 목적단백질이라 할 수 있다.

가설 설정

b Assignments of coat proteins to coat layers have been directly demonstrated only for CotE.

제안 방법

BJH₁₃5와 BJH₁₃6의 포자를 분리 , 정제한 후, 고초균 포자의 outer coat layer를 추출하여 6% SDS PAGE로 분석하였다 (Fig. 3). 대조 샘플로 사용된 P-galactosidase (LacZ)는 대장균에서 발현, 분리, 정제하여 사용하였다.
포자 형성 과정과 융합단백질의 발현을 동기화하기 위하여 각각의 포자형성 유전자의 구조유전자와 promoter가 함께 위치하도록 DNA primer를 설계하였다. 각각의 표면 발현 모체와 p-galactosidase의 융합발현을 위해서는 고초균 염새체의 amyE site에 integration 될 수 있는 pDG1728 plasmid vector를 이용하였다 융합 발현된 단백질은 표면 발현 모체 전체가 N-말단 15개의 아미노산을 제외한 전체 ^-galactosidase에 별다른 linker 서열 없이 직접 연결되도록 설계되었다. 증폭된 각각의 PCR 단편과 pDG1728 vector를 제한효소 BamH I과 Sal I으로 절단한 후 ligation하였다.
고초균 DB104, BJH₁₃5, BJH₁₃6어j 대해서, 배양시간에 따른 세포의 성장, 발현된 [egalactosidase의 배양 시간에 따른 전체 효소 활성, 포자 위에 발현된 효소 활성 등을 살펴보았다. 세포 성장의 초기에는 DB104, BJH₁₃5, BJH₁₃6의 비성장속도에는 차이가 없었다.
고초균 포자의 outer coat layer 추출을 위해서는, 문헌에 나온 4% SDS, 10% P-mercaptoethanol, 1 mM dithiothreitol, 0125 M Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol을 포함하는 용액에서 8분 동안 분리 정제된 고초균 포자를 가열하였다 [17],
고초균에서 분비되는 단백질 분해 효소의 CotG-LacZ 융합단백질의 포자 표면 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 , 고초균 야생주인 1168, 두 개의 단백질 분해 효소가 제거된 DB104, 7개의 단백질 분해 효소가 제거된 WB700, 세 가지의 균주를 준비하고, 이에 CotG-LacZ를 발현할 수 있도록 선형화된 pSDJH₉ plasmid를 형질 전환하여 , 균주를 구축하였다 (BJH₁₁5, BJH₁₃6, BJH₁₅2 in Table 3).
각각의 표면 발현 모체와 p-galactosidase의 융합발현을 위해서는 고초균 염새체의 amyE site에 integration 될 수 있는 pDG1728 plasmid vector를 이용하였다 융합 발현된 단백질은 표면 발현 모체 전체가 N-말단 15개의 아미노산을 제외한 전체 ^-galactosidase에 별다른 linker 서열 없이 직접 연결되도록 설계되었다. 증폭된 각각의 PCR 단편과 pDG1728 vector를 제한효소 BamH I과 Sal I으로 절단한 후 ligation하였다. 완성되어진 발현 vector를 pSDJH₄~pSDJH₁₄ 라고 명명하였다 (Fig.
(Table 2). 포자 형성 과정과 융합단백질의 발현을 동기화하기 위하여 각각의 포자형성 유전자의 구조유전자와 promoter가 함께 위치하도록 DNA primer를 설계하였다. 각각의 표면 발현 모체와 p-galactosidase의 융합발현을 위해서는 고초균 염새체의 amyE site에 integration 될 수 있는 pDG1728 plasmid vector를 이용하였다 융합 발현된 단백질은 표면 발현 모체 전체가 N-말단 15개의 아미노산을 제외한 전체 ^-galactosidase에 별다른 linker 서열 없이 직접 연결되도록 설계되었다.

대상 데이터

DNA 중합효소 (polymerase) 는 Boehringer Manheim (Expand Long Template PCR System, catalogue NO.1681834, Germany)사에서 구입하여 사용하였다. 표면 발현 모체인 고초균의 유전자 서열을 얻기 위해서는 Rzc泌subtilis genome site (http:〃www.
林galactosidase를 표면 발현시키기 위한 표면 발현 모체는 20가지 이싱의 spore coat protein 중에서 높은 발현양과 고초균 포자 형성과정에서 포자의 바깥쪽 위치, 두 가지 기준으로 선정되었다. cotA (낮은 발현양), C0F (단백질의 2차 절단), cotS와 cotT (포자의 아래쪽 층에 위치) 등은 선별 대상에서 제외되었다 (Table 1).
82 g/L)를 사용하였으며, 37℃에서 진탕 배양기를 통하여 배양하였다. 각각의 표면 발현모체와 lacZ cassette를 가진 고초균의 선별과 배양을 위해서 spectinomycin (100 mg/mL)를 사용하였다.
고초균 DB104를 기반으로 하여 만들어진 BJH₁₃1 ~BJH₁₄1, 모두 11종류의 균주를 GYS 배지에서 배양한 후, 배양 시간에 따른 두 가지의 샘플을 준비하였다 (16시간, 24시간). 11개의 발현 모체 중 가장 강한 |3-galactosidase 효소 역가를 나타내는 융합 단백질을 선정하기 위하여, 상등액을 제외한 vegetative cell, developing spore, fully developed spore 모두를 포함하는 샘플을 이용하여 Miller assay를 수행하였다 (Fig.
고초균 prototype 1168, 두 개의 단백질 분해 효소가 제거된 DB104, 7개의 단백질 분해 효소가 제거된 WB700이 전 실험에 걸쳐 발현용 숙주로 사용되었다. 배양 배지로는 GYS 배지 ((NH₄)2SC)4 2 g, yeast extract 2 g, K2HPO₄ 3.
3). 대조 샘플로 사용된 P-galactosidase (LacZ)는 대장균에서 발현, 분리, 정제하여 사용하였다. (lane 1: 116 kDa).
걸쳐 발현용 숙주로 사용되었다. 배양 배지로는 GYS 배지 ((NH₄)2SC)4 2 g, yeast extract 2 g, K2HPO₄ 3.3 g/L, sodium citrate 0.1 g, glucose 0.1 g/L, M11SO₄ H₂O 0.1 g, CaCh 0.16 g, MgSO₄ 7H₂O 0.82 g/L)를 사용하였으며, 37℃에서 진탕 배양기를 통하여 배양하였다. 각각의 표면 발현모체와 lacZ cassette를 가진 고초균의 선별과 배양을 위해서 spectinomycin (100 mg/mL)를 사용하였다.
유전자 클로닝을 위중U서는 대장균 JM109와 JM110을 사용하였다. 제한 효소, DNA ligase, 기타 필요한 시약은 Boehringer Manlieim에서 구입하였다.
유전자 클로닝을 위중U서는 대장균 JM109와 JM110을 사용하였다. 제한 효소, DNA ligase, 기타 필요한 시약은 Boehringer Manlieim에서 구입하였다. PCR 증吾단편 및 유전자 단편, plasmid vector의 정제를 위해서는 Quiagen 사의 제품을 이용하였다'
1681834, Germany)사에서 구입하여 사용하였다. 표면 발현 모체인 고초균의 유전자 서열을 얻기 위해서는 Rzc泌subtilis genome site (http:〃www.pasteB.什/Bio/wbtiLisf, html) 의 정보를 이용하였다, PCR 증폭을 위한 DNA primer는 Genotech (Taejeon, Korea)에서 주문, 구입하였다. PCR 증폭을 위해서는 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elms, USA) 을 사용하였다.

이론/모형

24시간). 11개의 발현 모체 중 가장 강한 |3-galactosidase 효소 역가를 나타내는 융합 단백질을 선정하기 위하여, 상등액을 제외한 vegetative cell, developing spore, fully developed spore 모두를 포함하는 샘플을 이용하여 Miller assay를 수행하였다 (Fig. 2).
고초균에서의 p-galactosidase 효소 역가 측정은 보고된 바와 같이 하였으며, Miller Unit으로 계산되었다. 1 Miller Unite 1 분간 420 nm에서의 흡광도 변화를 ODe에서 측정된 세포의 O.
완성된 11 개의 발현벡터 pSDJH₄~pSDJH₁₄를 고초균으로 도입하기 위해서는 Two-step (SPI, SPII) 방법을 이용하였다 [16],
유전자 조작의 일반적인 방법은 Sambrook 등의 방법을 따랐다. 유전자 클로닝을 위중U서는 대장균 JM109와 JM110을 사용하였다.

성능/효과

없었지만 (Fig. 5(a)), 전체 세포와 분리 정제된 포자에서 발현되는 P-galactosidase 효소 활성에는 상당한 차이가 있었다 (Fig. 5(b), (c)).
1168, DB104, WB700 기반의 세 균주 모두 세포 성장에는 차이가 없었지만 (Fig. 5(a)), 전체 세포와 분리 정제된 포자에서 발현되는 P-galactosidase 효소 활성에는 상당한 차이가 있었다 (Fig.
(lane 1: 116 kDa). BJH₁₃5와 BJH₁₃6의 포자에서 추출된 단백질에서 CotG-LacZ (lane 2: 138 kDa)와 CotE-LacZ (lane 3: 135 kDa)의 예상된 크기의 융합 단백의 존재를 확인하였다 반면, 대조 샘플로 사용한, 동일한 방법으로 처리된, DB104의 고초균 포자에서는 어떤 크기의 단백질도 발견되지 않았다. 위의 결과는 실험에 사용된 두 가지의 고초균 BJH₁₃5와 BJH₁₃6 포자의 outer coat layer에서 계획한 바와 같이 정확한 크기의 CotE- LacZ와 CotG-ImZ의 융합 단백질이 표면 발현되었음을 증명하는 것이다.
주로 고초균 포자 형성 단백질을 대상으로 하여 선별한 결과 cotE 와 c"G유전자가 목적 단백질인 0-galactosidase의 표면 발현에 가장 효과적인 것으로 판명이 되었다. 그러나, cotE 발현 모체의 경우, 고초균의 포자 형성 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이기 때문에, CotE-LacZ 융합 단백질의 발현이 포자 형성의 후반부를 저해하는 것으로 해석이 되었고, lysozyme 처리와 renografin 방법에 의한 포자의 분리, 정제 후에는 포자 표면에서 대부분의 P-galactosidase 효소 활성이 사라진 것을 확인하였다. 본 연구에서는 P-galactosidase 표면 발현을 위해서는 効G가 가장 우수한 표면 발현 모체로 판명이 되었으며, PAGE 분석에서 포자의 outer coat layer 에서 CotG-LacZ 융합 단백질이 계획한 대로 발현되었음이 증명되었다.
4(b)). 두 균주 모두 배양시간 10시간을 지나면서 , P-galactosidase 흐仝 활성이 나타나기 시작하였고, 16~20시간 정도의 구간에서 가장 높은 P-galactosidase 효소 활성을 나타내었다. 이후 배양 시기에서 효소 활성이 감소하는 것은 고초균이 분비하는 다양한 단백질 분해효소에 의한 작용으로 해석이 된다.
그러나, cotE 발현 모체의 경우, 고초균의 포자 형성 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이기 때문에, CotE-LacZ 융합 단백질의 발현이 포자 형성의 후반부를 저해하는 것으로 해석이 되었고, lysozyme 처리와 renografin 방법에 의한 포자의 분리, 정제 후에는 포자 표면에서 대부분의 P-galactosidase 효소 활성이 사라진 것을 확인하였다. 본 연구에서는 P-galactosidase 표면 발현을 위해서는 効G가 가장 우수한 표면 발현 모체로 판명이 되었으며, PAGE 분석에서 포자의 outer coat layer 에서 CotG-LacZ 융합 단백질이 계획한 대로 발현되었음이 증명되었다. 7개의 단백질 분해 효소가 제거된 WB700 기반의 고초균 숙주에서도 발현된 CotG-LacZ 융합 단백질의 분해는 계속되어 앞으로 더 나은 숙주개발이 요구된다고 할 수 있다.
배양액에 포함된 vegetative cells, sporulating cells, spores 등은 lysozyme 처리 혹은 renografin (sodium diatrizoate, S-4506, Sigma)을 이용한 밀도차이로 분리하였다. 분리 정제된 포자는 현미경 관측을 통하여, 순수한 포자만 존재하는 것으로 확인되었다.
선형화된 vecttn는 고초균 염색체의 amyE 위치에 homologous recombination 에 의한 double cross-over 형태로 삽입되게 되며, 이는 고초균 amyE 유전자의 정상적인 발현을 방해한다, 완성된 모든 고초균은 starch plate에서 amylase가 발현되지 못하는 것을 확인하였다 (data not shown). 이렇게 구축되어진 고초균을 BJH₁₁4~BJH₁₅2라고 명명하였다 (Table 3).
5(b), (c)). 예상한 바와 같이 즉정되는 B-galactosidase 효소 활성은 고초균 숙주에서 단백질 분해 효소가 가장 많이 제거된 WB700 기반의 균주에서 제일 높게 측정되었다. 이는 발현양의 차이라기보다는 발현된 후, 세포 내외의 단백질분해효소에 의해 제거되는 양이 작아지기 때문에 나타나는 현상이라고 이해할 수 있다.
BJH₁₃5와 BJH₁₃6의 포자에서 추출된 단백질에서 CotG-LacZ (lane 2: 138 kDa)와 CotE-LacZ (lane 3: 135 kDa)의 예상된 크기의 융합 단백의 존재를 확인하였다 반면, 대조 샘플로 사용한, 동일한 방법으로 처리된, DB104의 고초균 포자에서는 어떤 크기의 단백질도 발견되지 않았다. 위의 결과는 실험에 사용된 두 가지의 고초균 BJH₁₃5와 BJH₁₃6 포자의 outer coat layer에서 계획한 바와 같이 정확한 크기의 CotE- LacZ와 CotG-ImZ의 융합 단백질이 표면 발현되었음을 증명하는 것이다. ^-galactosidase의 항체를 이용한 Western blot 실험에서도 정확한 크기의 융합단백질의 존재를 확인할 수 있었다 (data not shown).

후속연구

본 연구에서는 P-galactosidase 표면 발현을 위해서는 効G가 가장 우수한 표면 발현 모체로 판명이 되었으며, PAGE 분석에서 포자의 outer coat layer 에서 CotG-LacZ 융합 단백질이 계획한 대로 발현되었음이 증명되었다. 7개의 단백질 분해 효소가 제거된 WB700 기반의 고초균 숙주에서도 발현된 CotG-LacZ 융합 단백질의 분해는 계속되어 앞으로 더 나은 숙주개발이 요구된다고 할 수 있다.
본 논문에서 서술된, 고초균의 포자를 이용한 표면 발현시스템은, 기존의 미생물 표면 발현 시스템이 해결하지 못했던 다양한 문제점들을 극복함과 동시에, 고초균 포자가 태생적 2로 가지는 외부 환경에 대한 저항성 및 안정성, 그리고 여러 생물학적인 응용에 대한 GRAS (Generally Regarded As Safe) 균주로서 그 응용범위를 넓혀갈 것이다. [22],
8 kDa의 크기를 가진, 고초균 포자의 형성과정에서 outer coat layer를 형성하는 것으로 알려진 유전자이다. 상기 융합 발현된 p-galactosidase 효소 역가 측정 결과에 따라, BJH₁₃5와 BJH₁₃6가 향후 계속적인 연구를 위해 선정되었다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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