[논문]형광 미세입자를 이용한 박테리아 군집의 3차원 형상 분석 및 유동성 생물막의 가시화

김경훈; 박은정; 김중경

doi:10.3795/ksme-b.2012.36.11.1119

문제 정의

이러한 측정기법을 통해 표면의 특성 및 배양 시간에 따라 변하는 군집의 형상과 군집 내 개체수사이의 상관관계를 정량적으로 파악하고자 하였다. 또한 동일한 기법을 적용하여 B. subtilis 생물막 특성을 가시화하여 비교하고 생물막에서 형성되는 유동장 분석 결과를 제시하고자 한다.
본 논문에서는 형광입자를 이용한 가시화 기법을 사용하여 E. coli 콜로니의 시간에 따른 군집 성장을 확인 및 분석하였으며 B. subtilis 콜로니에서 형광입자들의 거동을 관찰하였다. E.
coli의 군집 표면에 분포한 형광입자를 가시화하여 군집의 3차원 형상 프로파일을 획득하였다. 이러한 측정기법을 통해 표면의 특성 및 배양 시간에 따라 변하는 군집의 형상과 군집 내 개체수사이의 상관관계를 정량적으로 파악하고자 하였다. 또한 동일한 기법을 적용하여 B.

가설 설정

Y축을 고정시킬 때 X축 위치의 최소단위는 1 mm, Z축 위치의 최소단위는 1 ㎛이다. 관찰된 박테리아 군집이 Z축을 중심으로 대칭을 이룬다고 가정하여, 군집의 경계를 따라 분포하는 형광입자의 위치로부터 박테리아 군집의 3차원 형상 프로파일을 측정하였다.
여기서 x(㎛)는 소스로부터의 거리, t는 경과 시간(sec), D(㎛2/s)는 용질의 확산계수이고 초기에 용질은 –h < x < h 영역에 C0의 농도로 밀집 분포되어있다고 가정한다.
확산거동을 정량적으로 분석하고자 적절한 회귀분석 모델을 선정하였다. 형광입자의 밝기를 나타내는 계조치가 형광 입자의 농도에 비례한다고 가정하였다. 본 실험 조건에서는 초기에 아가젤에 포함된 일정량의 미세입자가 한쪽 방향으로 확산하게 되므로 Crank⁽⁶⁾가 제시한 다음 식 (2)로 형광입자의 강도 분포를 모델링할 수 있다.

제안 방법

B. subtilis의 경우는 접종 후 11시간 이후 1시간 간격으로 13시간 이후까지의 거동을 관찰하였다. 현미경을 이용한 관찰 측정의 기준은 E.
subtilis의 분비물이다. E. coli와 B. subtilis의 분비물은 12시간 정도 액체 배양을 한 후 배양액을 박테리아가 없는 순수 분비물에 가깝게 하고자 0.2 ㎛ 멸균실린지필터(NY14831, Corning, Germany)에 여과시켜 제조하였다.
E. coli의 경우 4시간 경과 후 각 1시간 간격으로 7시간까지 관찰하였다. 박테리아 군집의 중심이 통과 가능한 Y축을 고정시킨 후 군집의 경계로부터 X축을 옮겨가면서 형광입자가 관찰되는 Z축 위치를 확인하였다.
도립형 현미경(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)에서 20배의 대물렌즈를 통과한 형광입자 영상을 용액을 주입한 다음 10초 후부터 CCD 카메라(Sensicam, Cooke, Romulus, MI, USA)를 이용해 초당 1장씩 총 79장을 획득하였다. ImageJ의 광도측정 기능을 통하여 형광-아가젤 혼합물의 확산거동 영상을 분석하였다. 확산거동을 정량적으로 분석하고자 적절한 회귀분석 모델을 선정하였다.
5%인 세 종류를 사용하였다. LB(Luria-Bertani) broth를 100 ㎖기준으로 2.5 g을 증류수와 실험용 유리병에 넣은 후에 마이크로 아가를 0.5%의 아가젤은 0.5 g, 1.5%의 아가젤은 1.5 g, 2.5%의 아가젤은 2.5 g을 각각 첨가해주었다. 아가젤 용액은 멸균기를 사용하여 120℃, 15분간 멸균하였다.
각 입자 궤적에 대한 MSD-time 그래프를 획득한 후 그래프가 지수함수 형태이면 대류 거동, 선형함수이면 일반적인 확산 거동으로 해석한다.
5절에 기술하였다. 그러므로 Z축 방향으로 존재하는 형광입자들은 E. coli 생물막 내에 균일하게 퍼져있는데, 그 중에서 가장 바깥쪽에 존재하는 형광입자들의 3차원 위치 측정을 통해 박테리아 군집의 단면 프로파일을 획득하였다.
01이 되도록 희석시켰다. 마이크로 파이펫을 사용하여 균 용액 1 ㎕를 형광입자가 코팅된 아가 플레이트 표면 중앙부에 접종하였다. 접종 후 아가 플레이트는 파라핀 필름으로 밀봉하여 36℃에서 배양하였다.
coli의 경우 4시간 경과 후 각 1시간 간격으로 7시간까지 관찰하였다. 박테리아 군집의 중심이 통과 가능한 Y축을 고정시킨 후 군집의 경계로부터 X축을 옮겨가면서 형광입자가 관찰되는 Z축 위치를 확인하였다. Y축을 고정시킬 때 X축 위치의 최소단위는 1 mm, Z축 위치의 최소단위는 1 ㎛이다.
본 논문에서는 표준 배양조건에서 성장하는 E. coli의 군집 표면에 분포한 형광입자를 가시화하여 군집의 3차원 형상 프로파일을 획득하였다. 이러한 측정기법을 통해 표면의 특성 및 배양 시간에 따라 변하는 군집의 형상과 군집 내 개체수사이의 상관관계를 정량적으로 파악하고자 하였다.
사용한 형광입자는 540 nm 파장에서 여기되어 560 nm 파장의 빛을 방출하는 특성을 지녔으므로, 수은램프에서 나온 빛을 적절하게 조합된 필터를 통과시켜 형광입자를 관찰하였다. 위상차 현미경(BX51, Olympus, Tokyo, Japan)에서 20배의 대물렌즈를 통과한 영상을 CCD 카메라 (IMB-20FT, imi Technology, Anyang-si, Korea)로 획득하였다.
아가 플레이트 코팅에 사용한 형광 미세입자와 0.5% 아가 용액 혼합물을 직경 11.7 mm의 원형 배양접시 절반 영역에 20 ㎕ 응고시킨 후 나머지 부분에 4 종류의 용액을 20 ㎕ 주입한 후 형광입자의 확산 현상을 관찰하였다. 주입한 용액은 증류수(DW), LB broth, E.
ImageJ의 입자추적 기능과 상호상관법을 적용하여 입자의 궤적과 속도장을 획득하였다. 입자추적을 통해 얻은 입자 궤적을 이용하여 계산한 MSD(Mean Square Displacement)에 기반하여 형광 입자들의 거동을 분석하였다. MSD는 다음과 같은 식 (1)로 계산된다.
125초 간격으로 연속 획득하여 영상을 추출하였다. 추출된 영상은 ImageJ 프로그램을 통하여 Smooth와 Make binary로 영상을 전처리하였다. ImageJ의 입자추적 기능과 상호상관법을 적용하여 입자의 궤적과 속도장을 획득하였다.
subtilis의 경우는 접종 후 11시간 이후 1시간 간격으로 13시간 이후까지의 거동을 관찰하였다. 현미경을 이용한 관찰 측정의 기준은 E. coli 의 경우 Y축을 기준으로 0.5 mm 간격으로 현미경 재물대의 Z축을 따라 계측하였으며, 계측 기준은 군집 성장한 샘플이 선명하게 관찰되는 시점을 기준으로 하여 형광입자의 위치를 측정하였다.
형광입자를 이용하여 E. coli의 생물막 계면을 가시화하였다. 접종 4시간 후에서 7시간까지 E.
형광입자를 찍은 동영상을 프레임 간격에 따라 0.125초 간격으로 연속 획득하여 영상을 추출하였다. 추출된 영상은 ImageJ 프로그램을 통하여 Smooth와 Make binary로 영상을 전처리하였다.
ImageJ의 광도측정 기능을 통하여 형광-아가젤 혼합물의 확산거동 영상을 분석하였다. 확산거동을 정량적으로 분석하고자 적절한 회귀분석 모델을 선정하였다. 형광입자의 밝기를 나타내는 계조치가 형광 입자의 농도에 비례한다고 가정하였다.

대상 데이터

도립형 현미경(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)에서 20배의 대물렌즈를 통과한 형광입자 영상을 용액을 주입한 다음 10초 후부터 CCD 카메라(Sensicam, Cooke, Romulus, MI, USA)를 이용해 초당 1장씩 총 79장을 획득하였다. ImageJ의 광도측정 기능을 통하여 형광-아가젤 혼합물의 확산거동 영상을 분석하였다.
아가젤은 농도가 0.5, 1.5, 2.5%인 세 종류를 사용하였다. LB(Luria-Bertani) broth를 100 ㎖기준으로 2.
사용한 형광입자는 540 nm 파장에서 여기되어 560 nm 파장의 빛을 방출하는 특성을 지녔으므로, 수은램프에서 나온 빛을 적절하게 조합된 필터를 통과시켜 형광입자를 관찰하였다. 위상차 현미경(BX51, Olympus, Tokyo, Japan)에서 20배의 대물렌즈를 통과한 영상을 CCD 카메라 (IMB-20FT, imi Technology, Anyang-si, Korea)로 획득하였다. 본 연구에 사용한 실험 장치의 개략도를 Fig.
형광입자는 각 아가젤의 농도에 맞추어 사용하였다. 지름이 200 nm인 미세형광입자(FluoSpheres, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였고 체적 기준으로 아가젤 용액 99%와 형광입자 1%의 비율로 혼합하였다. 아가 배지 용액은 60℃ 이하에서 고형화되므로 중탕하여 온도를 75℃ 이상으로 유지하였다.

이론/모형

추출된 영상은 ImageJ 프로그램을 통하여 Smooth와 Make binary로 영상을 전처리하였다. ImageJ의 입자추적 기능과 상호상관법을 적용하여 입자의 궤적과 속도장을 획득하였다. 입자추적을 통해 얻은 입자 궤적을 이용하여 계산한 MSD(Mean Square Displacement)에 기반하여 형광 입자들의 거동을 분석하였다.

성능/효과

^(1,2) 박테리아 군집 성장에서 중요한 역할을 하는 것은 박테리아의 군집 이동과 정족수 인식 등의 집단적 거동이라고 보고된 바 있다.⁽³⁾ 정족수 인식에 의해 분비되어 형성된 생물막은 계면활성제의 특성을 가지며 영양분 흡수를 돕고 외부로부터 내부 개체를 보호할 뿐만 아니라 박테리아 증식을 촉진시킨다. 따라서 최근들어 생물막 연구의 중요성이 대두되고 있다.
5% 아가 배지에서는 많은 형광입자들이 배지 표면에 층을 이루었고 박테리아 군집 내부에 분포하는 입자 밀도가 상대적으로 훨씬 낮게 관찰되었다. 0.5% 아가 배지에서 자란 박테리아 군집은 같은 시간동안 다른 표면에서 성장한 군집에 비해 지름은 작은 반면 높이는 보다 높은 것을 확인할 수 있다. 시간에 따라 점진적으로 상승하는 형광입자들을 통해 측정한 E.
그 뿐만 아니라 아가의 농도에 따라서 형광 입자의 거동에도 차이가 있었다. 0.5%에서 다량의 형광입자가 군집이동에 따라 광범위하고 집단적으로 거동하는 것이 관찰되었던 반면에 1.5%에서는 소량의 형광입자만이 생물막 유동장을 따라 거동하는 것이 관찰되었다.
coli 군집 경계에 분포하는 형광입자의 3차원 위치 측정을 통해 성장하는 박테리아 군집의 단면 형상 프로파일을 얻을 수 있었다. B. subtilis 군집에서 거동하는 형광입자의 가시화를 통해 생물막 유동의 속도분포를 측정할 수 있었으며 군집 경계에서 형성되는 와류를 명확하게 관찰할 수 있었다. 다른 연구진의 선행 연구에서 산화마그네슘 단일입자를 추적하여 생물막 유동 형태를 분석한 방법에 비해 본 연구에서 사용한 가시화 기법은 아가 플레이트 전 영역에 형광입자가 균일하게 분포되므로 박테리아의 성장에 따른 유동성 생물막의 거동을 관측하는데 유리하다.
subtilis 콜로니에서 형광입자들의 거동을 관찰하였다. E. coli 군집 경계에 분포하는 형광입자의 3차원 위치 측정을 통해 성장하는 박테리아 군집의 단면 형상 프로파일을 얻을 수 있었다. B.
5(a-d)는 1초 간격으로 박테리아 군집의 성장과정을 촬영한 사진이다. 각 사진에서 B. subtilis 군집 밖에 형성된 유동경계면의 존재를 통해 생물계면활성제가 분비된다는 것을 확인할 수 있다. Be'er 등⁽⁴⁾도 최근 논문에서 생물계면활성제 경계면의 존재를 보고한 바 있다.
군집 경계를 따라 분포하는 200 nm 크기의 형광입자 위치를 측정하여 성장하는 박테리아 군집의 단면 형상 프로파일을 얻을 수 있었다. 매질의 공극 크기보다 작은 입자를 저밀도로 사용하는 경우에 공간해상도가 높아지기 때문에 박테리아 군집의 형상을 파악하기 쉽다는 것이 본 기법의 장점이다.
매질의 공극 크기보다 작은 입자를 저밀도로 사용하는 경우에 공간해상도가 높아지기 때문에 박테리아 군집의 형상을 파악하기 쉽다는 것이 본 기법의 장점이다. 또한 형광입자의 크기가 다공성 매질의 공극보다 상대적으로 작을수록, 매질 속에서 이탈하여 박테리아 군집 안으로 들어가는 형광입자의 수가 많았다. 예를 들어, 상대적으로 공극의 크기가 큰 0.
5% 아가 배지의 경우에는 일부 입자들만 매질을 빠져나와 군집 내부에서 층을 이루었다. 아가 배지 표면 아래에서 얇은 층으로 분포하던 형광입자들이 박테리아가 표면에서 생물막을 형성하고 군집을 형성함에 따라 매질에서 박테리아 군집 내부로 이동하여 군집의 경계 부근에서 층을 이루는 것을 확인하였다.
subtilis가 분비한 계면활성제가 가장 작은 값으로 측정되었다. 유효확산계수가 가장 큰 증류수에서 형광입자가 빠르게 거동하고 확산 계수가 가장 작은 B. subtilis의 분비물에서 가장 느리게 거동하는 현상을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 형광 미세입자가 아가젤로부터 이탈하는 현상은 농도 차에 의한 확산 거동으로 인한 것임을 알 수 있다.
회귀 분석을 통해 얻은 유효확산계수를 Table 1에 나타내었다. 유효확산계수의 크기는 증류수가 제일 크고 LB broth가 E. coli가 분비한 습윤제보다 약간 크며 B. subtilis가 분비한 계면활성제가 가장 작은 값으로 측정되었다. 유효확산계수가 가장 큰 증류수에서 형광입자가 빠르게 거동하고 확산 계수가 가장 작은 B.
coli의 생물막 계면을 가시화하였다. 접종 4시간 후에서 7시간까지 E. coli가 군집을 형성한 이후 대부분의 형광입자가 아가 배지 밖으로 빠져나와 박테리아 군집의 경계면을 따라 분포하는 것을 확인하였다. Fig.
입자추적 기법을 통해 얻은 MSD-time 그래프 경향은 지수 함수형태를 가지기 때문에 대류 거동이 있음을 알 수 있다. 형광입자들은 B. subtilis 군집이동시 형성되는 생물막의 유동을 따라 움직이는 것을 알 수 있었다. 이러한 관찰 결과는 Be'er 등⁽⁴⁾의 연구에서 보고된 E.

후속연구

다른 연구진의 선행 연구에서 산화마그네슘 단일입자를 추적하여 생물막 유동 형태를 분석한 방법에 비해 본 연구에서 사용한 가시화 기법은 아가 플레이트 전 영역에 형광입자가 균일하게 분포되므로 박테리아의 성장에 따른 유동성 생물막의 거동을 관측하는데 유리하다. 본 연구는 박테리아 군집에서 분비되는 계면활성제가 포함된 유동성 생물막의 특성을 파악하기 위한 연구수단을 제시하였을 뿐만 아니라, 발전된 영상기법을 통해 박테리아 군집의 3차원 형상과 유동성 생물막의 물리적 특성을 실시간으로 측정하기 위한 후속연구에 활용될 것으로 기대된다.
형광 미세입자를 이용한 분석 방법은 박테리아군집의 3차원 분석에 용이할 뿐만 아니라 박테리아 군집 내부의 집단거동에 의한 유동현상을 관찰하는데도 도움이 될 것으로 기대된다. 앞으로 유동성 생물막의 점도, 표면장력 등의 물리적인 특성을 직접 측정하는 방법을 추가로 개발할 필요가 있다.
coli 생물막 위에서는 산화마그네슘 입자가 계면에 고정되어 있다는 관찰 결과이다. 이러한 연구에 활용된 광학영상기법은 생물막의 특성 차이를 관찰하는데는 유용하지만 유동성 생물막의 유체역학적 특성을 상세하게 밝혀주지는 못한다는 제약이 있다.
형광 미세입자를 이용한 분석 방법은 박테리아군집의 3차원 분석에 용이할 뿐만 아니라 박테리아 군집 내부의 집단거동에 의한 유동현상을 관찰하는데도 도움이 될 것으로 기대된다. 앞으로 유동성 생물막의 점도, 표면장력 등의 물리적인 특성을 직접 측정하는 방법을 추가로 개발할 필요가 있다.

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	단일입자를 추적하여 생물막의 거동을 관측하는 방법의 단점이 무엇인가?	Be'er 등(4)은 단일입자를 추적하여 생물막의 거동을 관측하였다. 그러나 이러한 방법은 단일입자이기 때문에 생물막의 유동 패턴을 정확하게 나타낼 수 없다. 이와 달리 본 연구진이 시도한 형광입자를 이용한 가시화 기법은 군집이동에 의한 생물막의 유동 속도분포를 측정할 수 있다.
	광학영상기법의 장단점은 무엇인가?	coli 생물막 위에서는 산화마그네슘 입자가 계면에 고정되어 있다는 관찰 결과이다. 이러한 연구에 활용된 광학영상기법은 생물막의 특성 차이를 관찰하는데는 유용하지만 유동성 생물막의 유체역학적 특성을 상세하게 밝혀주지는 못한다는 제약이 있다.
	표면 주위의 물리화학적 환경에 따른 박테리아 군집의 반응이 의미하는 것은 무엇인가?	표면 주위의 물리화학적 환경에 따라 박테리아군집은 특이적인 반응을 보인다. 이는 박테리아의 군집 성장을 표면성질의 변화를 통해 제어할 수 있다는 가능성을 의미한다.(1,2) 박테리아 군집 성장에서 중요한 역할을 하는 것은 박테리아의 군집 이동과 정족수 인식 등의 집단적 거동이라고 보고된 바 있다.

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