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문제 정의
- 등, 1999; Songserm 등, 2000) 두 바이러스의 혼합 감염에 대한 연구 보고는 없었다. 따라서 우리는 육계의 다양한 질병에서 공통으로 분리되기도 하며 (McFerran 등, 1976; Decaesstecker 등, 1988; Lenz 등,1998) 최근 국내에서 많은 문제를 야기하고 있는 ARV 와 FAdV 의 혼합 감염 모델을 통해 그 상관관계 및 병원성을 규명하고자 이 실험을 하였다.
- 이 연구는 국내 분리 ARV와 FAdV 두 병원체를 이용하여 SPF 닭에 접종 시 병원성에 대한 상승효과 여부를 확인하기 위하여 수행하였다. 과거부터 ARV 단독 감염 시 ARV 의 특징적 임상증상 중 하나인 MAS 에 의한 증체 불량이 항상 나타나는 것은 아니었다.
- 이처럼 MAS 의 재현성에 문제가 있어 다양한 연구가 진행되어 ARV 의 감염에 의한 증체 불량은 한가지 원인체로 이루어지는 것이 아니고 다양한 병원체 혹은 요소가 필요하다는 것으로 보고되었지만, 아직도 명확하게 밝혀진 것은 아니다(Decaesstecker 등, 1986; Goodwin 등, 1993; Songserm 등, 2000; Songserm 등, 2002; Songserm 등, 2003). 따라서 이 연구에서는 SPF닭을 이용하여 최근 국내에서 비슷한 일령에 발생 보고가 되고 있는 ARV와 FAdV를 단독 혹은 혼합 접종을 통하여 증체 불량을 재현해 보고자 하였다. 이 실험에서 SPF 닭을 사용한 이유는 만약 일반 실용 계를 사용하면 장내에 이미 다른 병원체들이 있거나 바이러스에 대한 모체이행 항체가 있을 수 있기 때문이었다(Montgomery 등, 1986; Rekik 등, 1991; Songserm 등, 2003).
- 이 연구에서 우리는 ARV와 FAdV 두 병원체를 사용해서 병원성의 상승과 MAS 를 재현해 보고자 하였다. 그러나 ARV 접종에 의한 임상증상, 유전자 검출, 조직병리학적 검사에서 충분한 결과를 얻지는 못했으나 FAdV 접종군에서는 병원성을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- ARV는 MAS 임상증상을 보인 10일령 육계의 장에서분리하였으며, primary chicken embryo liver cell에서 4회계대배양 하였다. 접종 전 TCID50 를 측정하였으며 닭 1 수당 1.6X103.75 TCID50로 접종하였다
- 접종 전 TCID50를 측정하였으며 닭 1수당 102 TCID50로 접종하였다.
- 각 접종군의 SPF 닭은 음압 환경이 조성된 무균사육장치인 HBC2 (Threeshine, 유성, 대전)에서 각각 사육되었고 사료와 물은 자율 급이 하였다. 각 접종군은 두 바이러스의 자연 감염을 재현하기 위해 각각 혹은 혼합하여 경구로 접종하였다. 1 접종군 (R01) 은 ARV 1일령 접종군, 2 접종군(R14)은 ARV 14일령 접종군, 3 접종군(A01) 은 FAdV 1일령 접종군, 4 접종군(A01R01)은 FAdV/ ARV 1일령 동시 접종군, 5 접종군 (A01R14) 은 FAdV/ ARV 1일령/14일령 접종군, 6 접종군(CONT)은 음성대조군으로 phosphate buffered saline (PBS)을 경 구 투여하였다 (Table 1).
- 각 접종군은 두 바이러스의 자연 감염을 재현하기 위해 각각 혹은 혼합하여 경구로 접종하였다. 1 접종군 (R01) 은 ARV 1일령 접종군, 2 접종군(R14)은 ARV 14일령 접종군, 3 접종군(A01) 은 FAdV 1일령 접종군, 4 접종군(A01R01)은 FAdV/ ARV 1일령 동시 접종군, 5 접종군 (A01R14) 은 FAdV/ ARV 1일령/14일령 접종군, 6 접종군(CONT)은 음성대조군으로 phosphate buffered saline (PBS)을 경 구 투여하였다 (Table 1).
- 모든 접종군의 닭들은 1일령 때 체중을 측정하였으며 해당 바이러스 최종 접종 후 3, 7, 14 DPI (day postinoculation) 때 각 5수씩, 바이러스 비접종군인 대조군의 닭들은 3, 7, 14, 17, 21, 28 DPI 때 각 3수씩 무작위로 선택하여 체중을 측정하고, 채혈 후 경추 탈구하여 부검을 하였다. 폐사한 개체들은 폐사 당일에 부검을 하였다.
- 실험기간 동안 매일 임상증상을 관찰하였으며 정해진 날에, 채취한 혈청으로는 AST (aspartate aminotransferase), CPK (creatine phosphokinase) 수치를 측정하였다. 부검을 통하여 각 접종군의 육안 병변을 확인하였으며 조직 병리학적 검사를 위해서 간, 선위, 십이지장, 췌장, 공장, 회장, Fabricius 낭, 흉선을 채취하였고, 접종한 바이러스의 유전자 검출을 위해서 간, 맹장편도를 채취하였다.
- CPK (creatine phosphokinase) 수치를 측정하였다. 부검을 통하여 각 접종군의 육안 병변을 확인하였으며 조직 병리학적 검사를 위해서 간, 선위, 십이지장, 췌장, 공장, 회장, Fabricius 낭, 흉선을 채취하였고, 접종한 바이러스의 유전자 검출을 위해서 간, 맹장편도를 채취하였다.
- 각각의 접종군에서 미리 계획된 DPI 별로 간 맹장 편도를 채취하여 유제를 하였으며, 각 유제액은 3, 000 rpm 에서 15분간 원심 분리한 후 상층액으로부터 Viral Gene-spinTM (iNtRON Biotechnology, Inc., Korea)을 사용하여 viral gene을 추출하였다. PCRe 상업적으로 판매되는 AccessQuickTM RT-PCR System (Promega, WI, USA) 과 TaKaRa Ex Taqe™ (TAKARA BIO INC.
- 병리조직학적 병변을 관찰하기 위해서 각각의 접종군에서 각 DPI 별로 간, 선위, 십이지장, 췌장, 공장, 회장, Fabricius 낭, 흉선을 채취 하였다. 채취한 조직은 10% phosphate-buffered formalin 고정액으로 처리하였으며, 고정된 조직은 조직 처리과정을 거친 후 haematoxylin and eosin(H&E) 염색을 한 후 병변을 관찰하였다
- 낭, 흉선을 채취 하였다. 채취한 조직은 10% phosphate-buffered formalin 고정액으로 처리하였으며, 고정된 조직은 조직 처리과정을 거친 후 haematoxylin and eosin(H&E) 염색을 한 후 병변을 관찰하였다
- 각각의 접종군에서 각 DPI 별로 채혈을 실시하였다. 혈액 샘플은 혈청화학적 측정을 위하여 혈청을 분리한 후 충북대학교 수의과대학 임상병리학 교실에 위탁하였고, 혈청 AST, CPK 수치를 측정하였다.
- 실시하였다. 혈액 샘플은 혈청화학적 측정을 위하여 혈청을 분리한 후 충북대학교 수의과대학 임상병리학 교실에 위탁하였고, 혈청 AST, CPK 수치를 측정하였다.
- ARV 단독 접종군과 ARV(R01, R14)와 FAdV 단독 및 혼합 접종군(A01, A01R01, A01R14)의 간과 맹장 편도에서 ARV 에 대한 유전자 검출을 실시하였다. 그 결과, R01 군에서 접종 후 3일째 채취한 닭 5수 중 3 수의 간과 맹장편도에서 접종한 ARV 에 대한 유전자가 검출되었으나 나머지 접종군 및 대조군에서는 ARV 유전자가 전혀 검출 되지 않았다(Table 4).
- FAdV 유전자도 단독 접종군(A01)과 ARV 혼합 접종 군(A01R01, A01R14)의 간과 맹장편도에서 검출을 실시하였다. 그 결과 A01 접종군에서 접종 후 3일째 간 5수 중 1수에서 검출되었으나 맹장편도에서는 검출되지 않았다.
- 국내 분리 ARV와 FAdV 의 병원성 관련 상호작용을 확인하기 위하여 접종한 바이러스의 배출 혹은 체내장기에서의 존재 여부를 특이 primer를 이용하여 검색한 후 검출률을 비교하였다. ARV 접종군 4개 중(R01, R14, A01R01, A01R14) R01 접종군에서만 접종후 3일에 간과 맹장편도에서 유전자가 검출되었다.
- 조직병리학적 검사 결과에 기초하여 간 손상 정도를평가하기 위해서 혈청 AST, CPK 수치를 측정하였다. AST 수치는 A01 접종군의 접종 후 7일에 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가한 결과를 얻을 수 있었다.
- 국내 육계와 산란계에서 분리한 ARV와 FAdV를통한 SPF 닭에서의 단독 혹은 혼합감염에 의한 MAS 병원성 재현 연구를 위하여 체중측정 및 임상증상, 바이러스 유전자 검출, 조직병리학적, 혈액 화학적인 검사를 하였다. 임상증상은 ARV 접종보다는 FAdV 단독 혹은 ARV와의 혼합접종 시 더욱 강하게 나타났으며 폐사율 또한 높았다.
대상 데이터
- 1일령 Specific pathogen free (SPF) 닭 93수를 이 실험에 사용하였으며 이 병아리는 SPF 계란을 SPAFAS사 (North Franklin, USA)에서 구입하여 본 실험실의 부화기(윤선부화기 평택, 경기)에서 부화하였다 SPF 닭은 실험에 공시하기 전에 ARV와 FAdV 에 대한 모체이행 항체 검사에서 음성을 나타내었다
- ARV는 MAS 임상증상을 보인 10일령 육계의 장에서분리하였으며, primary chicken embryo liver cell에서 4회계대배양 하였다. 접종 전 TCID50 를 측정하였으며 닭 1 수당 1.
- 1일령 SPF 닭 93수를 5개의 접종군(15수/군)과 1개 의 대조군(18수)으로 구분하였으며. 각 접종군의 SPF 닭은 음압 환경이 조성된 무균사육장치인 HBC2 (Threeshine, 유성, 대전)에서 각각 사육되었고 사료와 물은 자율 급이 하였다.
- , Korea)을 사용하여 viral gene을 추출하였다. PCRe 상업적으로 판매되는 AccessQuickTM RT-PCR System (Promega, WI, USA) 과 TaKaRa Ex Taqe™ (TAKARA BIO INC., Japan)을 사용하였다
- ARV primer는 기존 논문의(Bruhn 등 2005) ARV_S4_ P4 (5'-GTG CGT GTT GGA GTT TC-3'), ARV_S4_P5 (5'-ACA AAG CCA GCC AT(G/A) AT-31) 를 사용하였으며, FAdV primer는 기존 논문의 (Meulemans 드 2001) Hexon A(5'-CAA RTT CAG RCA GAC GGT-3')와 Hexon B (5'-TAG TGA TGM CGS GAC ATC AT-3') 를 사용하였다.
성능/효과
- 비접종 대조군인 CONT 군에서는 12 DPI 때 1수가 사고로 폐사한 이외 특별한 임상 증상이 발견되지 않았다 폐사 이외의 임상증상에서도 ARV 단독 접종군과 FAdV 단독 혹은 ARV 혼합 접종군 간에는 확연한 차이가 인정되었다 ARV 단독 접종군은 특이적인 임상 증상이 발견되지 않았지만 A01 group 은 4 DPI 때부터 일부 개체의 활력이 저하되면서, 5~7 DPI 에 걸쳐서 조는 증상이 발견되었다 졸던 개체는 결국 폐사하였으며, 6 DPI 에 2수, 7 DPI 에 3수가 추가로 폐사하였다 혼합 접종 군(A01R01) 은 2~3 DPI 때 설사 등 다른 증상은 없이 활력만 저하되었고 폐사체도 나타나지 않았지만 또 다른 혼합 접종군(A01R14) 은 6~9 DPI 에 걸쳐서 조는 증상이 발견되었으며 졸던 개체들은 모두 폐사하였다 폐사 개체 수는 6 DPI 1수, 8 DPI 3수, 10 DPI 1수 등 모두 5수였다.
- 부검소견은 ARV 단독 접종군과 ARV와 FAdV 혼합접종 군 간에 차이가 인정되었다 ARV단독 접종군인 R01 군은 3 DPI 때 간에서 미약한 출혈 반점과 장의 확장 특히 맹장 부근의 확장 및 포말성 내용물이 관찰된 것이 유일한 부검소견이었다 또 다른 ARV 접종군인 R14 군에서도 간의 육안 병변은 관찰되지 않았으며, 장의 병변은 R01 접종군에 비해 미약한 수준이었다 반면에 FAdV 접종군에서는 다양한 부검소견이 관찰되었다 A01 접종군에서 발생한 6 DPI 폐사체의 부검 결과 1수에서 간의 출혈반점이 관찰되었고, 7 DPI 폐사체에서는 간의 출혈 반점과 장의 포말성 내용물, 미약한 심낭 수종이 관찰되었다 혼합접종군 A01R01 군에서는 3 DPI, 7 DPI 때 주로 장의 확장 및 포말성 내용물이 관찰된 것이 유일한 부검소견이지만, 또 다른 혼합 접종군 A01R14 군에서 폐사된 개체에서는 간의 출혈반점과 심낭 수종이 모두 관찰되었다
- 체중의 변화는 실험기간 동안 대부분 접종군과 대조군 간에 통계학적 유의한 차이가 인정되지 않았다 단, FAdV 단독 접종군(A01)에서만 접종 후 7일에 대조군 및 다른 접종군과 비교할 때 통계학적으로 유의한 차이가 인정되었다(PV0.05). 그러나 이후 A01 group 의 체중은 회복되었으나 개체 간 표준편차가 29.
- 그 결과, R01 군에서 접종 후 3일째 채취한 닭 5수 중 3 수의 간과 맹장편도에서 접종한 ARV 에 대한 유전자가 검출되었으나 나머지 접종군 및 대조군에서는 ARV 유전자가 전혀 검출 되지 않았다(Table 4).
- A01R14)의 간과 맹장편도에서 검출을 실시하였다. 그 결과 A01 접종군에서 접종 후 3일째 간 5수 중 1수에서 검출되었으나 맹장편도에서는 검출되지 않았다. 그 후 접종 후 6일째 폐사체와 7일째에 채취한 간과 맹장편도에서는 검사대상 5수 중 5수 모두 FAdV 유전자가 검출되었으나 접종 후 14일째에서는 검출되지 않았다.
- 그 결과 A01 접종군에서 접종 후 3일째 간 5수 중 1수에서 검출되었으나 맹장편도에서는 검출되지 않았다. 그 후 접종 후 6일째 폐사체와 7일째에 채취한 간과 맹장편도에서는 검사대상 5수 중 5수 모두 FAdV 유전자가 검출되었으나 접종 후 14일째에서는 검출되지 않았다. FAdV와 ARV 혼합 접종군인 A01R01 군에서는 접종 후 3일째에는 검출되지 않았으나 접종 후 7일째의 간 5수 중 1수, 맹장편도 5 수중 4수에서 FAdV 유전자가 검출되었다.
- 그 후 접종 후 6일째 폐사체와 7일째에 채취한 간과 맹장편도에서는 검사대상 5수 중 5수 모두 FAdV 유전자가 검출되었으나 접종 후 14일째에서는 검출되지 않았다. FAdV와 ARV 혼합 접종군인 A01R01 군에서는 접종 후 3일째에는 검출되지 않았으나 접종 후 7일째의 간 5수 중 1수, 맹장편도 5 수중 4수에서 FAdV 유전자가 검출되었다. 또 다른 혼합접종군인 A01R14군에서는 접종 후 6, 8일째에 폐사한 개체의 간, 맹장편도에서 모두 검출 되었고, 10 일째 폐사한 개체 1수에서는 간에서만 검출되었다.
- 또 다른 혼합접종군인 A01R14군에서는 접종 후 6, 8일째에 폐사한 개체의 간, 맹장편도에서 모두 검출 되었고, 10 일째 폐사한 개체 1수에서는 간에서만 검출되었다. 대조군에서 주기적으로 채취한 간과 맹장편도에서는FAdV 유전자가 검출되지 않았다(Table 5).
- 실험기간 동안 대조군을 포함한 접종군에서 채취한 간, 선위, 십이지장, 췌장, 공장, 회장, Fabri cius 낭, 흉선에 대하여 조직병리학적 병변을 평가해본 결과 간을 제외한 장기에서는 특이적인 병변이 관찰되지 않았다. 간에서 관찰된 주요 병변은 림프구의 침윤과 간세포의 괴사 소견이었다.
- 폐사가 발생하는 동안 무작위 추출이 없었던 A01R14 접종군의 경우, 1일령 SPF 닭에서의 폐사율은 약 33%로 확인되었다. 일반적으로 HPS 유래 FAdV로연구를 할때 접종 일령에 따라 혹은 접종 바이러스의 종류에 따라 다양한 폐사율이 보고된 바 있다.
- 후 검출률을 비교하였다. ARV 접종군 4개 중(R01, R14, A01R01, A01R14) R01 접종군에서만 접종후 3일에 간과 맹장편도에서 유전자가 검출되었다. 기존 연구결과를 보면 빠르게는 접종 후 1일부터 길게는 접종 후 15일까지 바이러스가 확인된 바 있다(Kouwenhoven 등, 1988; Rekik 등, 1991; Ni와 Kemp, 1995; Lenz 등, 1998; Songserm 등, 2003).
- (Ni 와 Kemp, 1995). 이 연구에서 R01 접종군에서 접종 후 3일에 ARV 유전자가 간에서 검출된 것은 전신감염이 이루어진 것으로 판단된다. 그러나 이후 지속적인 검출이 되지 않은 것은 숙주의 면역시스템에 의하여 viremia 가 지속하지 못하였기 때문이다.
- 대부분 접종 후 7일에서 FAdV 유전자가 검출되었으며, 폐사체의 경우는 접종 후 10일까지 검출되었다. 기존 연구 결과 중에도 본 연구의 결과와 유사하게 접종 후 7일에서만 FAdV가 확인되었다(Songserm 등, 2000).
- 이런 현상이 나타나는 이유는 HPS 유래 FAdV가 임상증상을 일으키기 시작한 시기부터 폐사가 일어나는 시기 사이에 바이러스의 재분리가 용이하기 때문이며 또한, 이 시기에 유전자가 검색되는 것으로 판단된다. 흥미있는 결과는 A01R01 접종군에서는 임상 증상 및 폐사가 발견되지 않았지만 접종 후 7일에 FAdV 유전자가 간과 맹장편도에서 모두 검출되었다는 점이다. 그러나 A01R01 혼합접종군의 간에서의 FAdV 유전자 검출률 20%는 A01 접종군에서의 유전자 검출률 100%와 비교할 때 현저히 낮았다.
- 흥미있는 결과는 A01R01 접종군에서는 임상 증상 및 폐사가 발견되지 않았지만 접종 후 7일에 FAdV 유전자가 간과 맹장편도에서 모두 검출되었다는 점이다. 그러나 A01R01 혼합접종군의 간에서의 FAdV 유전자 검출률 20%는 A01 접종군에서의 유전자 검출률 100%와 비교할 때 현저히 낮았다. 이러한 결과로 우리는 두 가지 가정을 세워 볼 수 있었다.
- 이러한 결과로 우리는 두 가지 가정을 세워 볼 수 있었다. 첫째는 접종 후 7일에 유전자가 검출된 점은 FAdV 에 의한 폐사는 FAdV 가 전신적인 순환에 의해서 간까지 도달해야 한다는 것이며, 둘째는 ARV와 FAdV 의 초기 증식장소가 장관계통으로 서로 유사함으로써 두 바이러스 간에 간섭현상을 일으켜 A01R01 접종 군의 간에서 FAdV 유전자 검출률이 감소한다는 것이다.
- 측정하였다. AST 수치는 A01 접종군의 접종 후 7일에 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가한 결과를 얻을 수 있었다. 그러나 혈청 내 CPK 수치는 모든 접종군에서 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다 따라서 우리는 혈청 화학적 검사에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 없었지만 최소한 A01 접종군의 접종 후 7일에 증가한 AST 수치가 근육 손상과는 관계가 없으며 간 손상과 관계된 것이라고 해석 할 수 있었다.
- AST 수치는 A01 접종군의 접종 후 7일에 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가한 결과를 얻을 수 있었다. 그러나 혈청 내 CPK 수치는 모든 접종군에서 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다 따라서 우리는 혈청 화학적 검사에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 없었지만 최소한 A01 접종군의 접종 후 7일에 증가한 AST 수치가 근육 손상과는 관계가 없으며 간 손상과 관계된 것이라고 해석 할 수 있었다. 향후 병원성이 높은 ARV 혹은 FAdV를 접종한다면 이 AST 및 CPK 수치도 통계학적으로 유의성 있게 변할 것으로 판단된다.
- 하였다. 임상증상은 ARV 접종보다는 FAdV 단독 혹은 ARV와의 혼합접종 시 더욱 강하게 나타났으며 폐사율 또한 높았다. 바이러스 검출은 복합감염보다 단독감염에서의 유전자 검출 확률이 높았으며 조직병리학적인 병변은 대조군보다 복합감염 군에서 높은 병변지수를 나타냈다.
- 임상증상은 ARV 접종보다는 FAdV 단독 혹은 ARV와의 혼합접종 시 더욱 강하게 나타났으며 폐사율 또한 높았다. 바이러스 검출은 복합감염보다 단독감염에서의 유전자 검출 확률이 높았으며 조직병리학적인 병변은 대조군보다 복합감염 군에서 높은 병변지수를 나타냈다. 향후 다양한 장관계통 관련 바이러스와 ARV 의 병원성 관련 관계를 규명하기 위하여 다양한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
후속연구
- trigger 역할을 한다는 사실이 보고된 바 있다(Kouwenhoven 등, 1988; Songserm 등, 2002). 따라서 이번 연구에서는 MAS 재현이 이루어지지 않았지만 국내에서 분리되는 ARV 및 FAdV를 포함하여 로타바이러스, 아스트로바이러스 등 다양한 원인체에 의한 MAS 의 발현에 대해서는 향후 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 그러나 혈청 내 CPK 수치는 모든 접종군에서 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다 따라서 우리는 혈청 화학적 검사에서 유의성 있는 결과를 얻을 수 없었지만 최소한 A01 접종군의 접종 후 7일에 증가한 AST 수치가 근육 손상과는 관계가 없으며 간 손상과 관계된 것이라고 해석 할 수 있었다. 향후 병원성이 높은 ARV 혹은 FAdV를 접종한다면 이 AST 및 CPK 수치도 통계학적으로 유의성 있게 변할 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 아쉬웠던 점은 ARV 의 병원성이 충분히 강하지 못했던 점이다. 그러나 MAS 를 발현하는 닭 가검물에 있어서 ARV는 거의 항상 분리되고 있으며, 기존의 연구결과에서 중요한 원인체 중 하나라는 사실은 확실하므로 향후 ARV를 중심으로 다른 병원체 혹은 요소들을 복합적으로 연계하여 MAS 관련 연구를 지속해야 할 것으로 생각한다.
- 바이러스 검출은 복합감염보다 단독감염에서의 유전자 검출 확률이 높았으며 조직병리학적인 병변은 대조군보다 복합감염 군에서 높은 병변지수를 나타냈다. 향후 다양한 장관계통 관련 바이러스와 ARV 의 병원성 관련 관계를 규명하기 위하여 다양한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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