This study was carried out to develope enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of canine brucellosis in dogs experimentally inoculated with Brucella abortus 1119-3 and B. canis RM666. Groups A, B and C of dogs (each group consisting of three dogs) were orally inoculated with approxim...
This study was carried out to develope enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of canine brucellosis in dogs experimentally inoculated with Brucella abortus 1119-3 and B. canis RM666. Groups A, B and C of dogs (each group consisting of three dogs) were orally inoculated with approximately $5{\times}10^9$ colony-forming units of B. abortus and B. canis, and with sterile pyrogen-free PBS, respectively. The animals were monitored at regular intervals upto the 12th week post inoculation (PI) by standard tube agglutination test (STAT), plate agglutination test (PAT), Rose Bengal test (RBT), 2-mercaptoethanol rapid slide agglutination test (2ME-RSAT) and ELISA. The induced antibody titers in group A dogs were detected from the first week PI to the eighth week PI in STAT, PAT and RBT using the inactivated whole cells of B. abortus 1119-3 as antigens, while no sera in groups B and C dogs reacted with the antigens. In 2ME-RSAT using whole cells of B. canis M-strain as antigens, the induced antibody titers in group B dogs were observed at the second week PI and persisted for the 12th week PI, while sera of groups A and C dogs did not react with the whole cells. In ELISA using cytoplasmic fractions antigen of B. abortus 1119-3, the mean optical density of antibodies in groups A and B was detected from the first and second weeks PI, respectively, and persisted for 12th week PI, while sera of group C did not cross-react with the fractions antigen. However, in ELISA using the hot saline extracts of B. canis M- as an antigen, the induced antibody titers in only group B dogs were detected from second week PI and persisted for until the end of this study. These results indicate that the ELISA using B. abortus 1119-3 cytoplasmic fractions as antigens can be a good candidate for detection of brucellosis by B. abortus as well as B. canis in dogs.
This study was carried out to develope enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of canine brucellosis in dogs experimentally inoculated with Brucella abortus 1119-3 and B. canis RM666. Groups A, B and C of dogs (each group consisting of three dogs) were orally inoculated with approximately $5{\times}10^9$ colony-forming units of B. abortus and B. canis, and with sterile pyrogen-free PBS, respectively. The animals were monitored at regular intervals upto the 12th week post inoculation (PI) by standard tube agglutination test (STAT), plate agglutination test (PAT), Rose Bengal test (RBT), 2-mercaptoethanol rapid slide agglutination test (2ME-RSAT) and ELISA. The induced antibody titers in group A dogs were detected from the first week PI to the eighth week PI in STAT, PAT and RBT using the inactivated whole cells of B. abortus 1119-3 as antigens, while no sera in groups B and C dogs reacted with the antigens. In 2ME-RSAT using whole cells of B. canis M-strain as antigens, the induced antibody titers in group B dogs were observed at the second week PI and persisted for the 12th week PI, while sera of groups A and C dogs did not react with the whole cells. In ELISA using cytoplasmic fractions antigen of B. abortus 1119-3, the mean optical density of antibodies in groups A and B was detected from the first and second weeks PI, respectively, and persisted for 12th week PI, while sera of group C did not cross-react with the fractions antigen. However, in ELISA using the hot saline extracts of B. canis M- as an antigen, the induced antibody titers in only group B dogs were detected from second week PI and persisted for until the end of this study. These results indicate that the ELISA using B. abortus 1119-3 cytoplasmic fractions as antigens can be a good candidate for detection of brucellosis by B. abortus as well as B. canis in dogs.
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제안 방법
B. abortus 1119-3 과 B. canis RM666을 감염 2일 전 그리고 감염 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12주 후에 요골쪽 피부 정맥에서 채혈, 혈청을 분리하여 一70oC 에 보관하며 실험에 사용하였다
B. abortus 1119-3 을 potato infusion agar 에, B. canis RM666을 Brucella agar 에 각각 접종하여 phosphate buffered saline (PBS)로 부유시 켜 회수한 후 50 ml PBS 에 약 5.0x109 CFU 가 되도록 균수를 조정하여 하룻밤 절식시킨 체중 10〜13 kg 3두씩의 개에게 각각 경구 감염시켰으며, 대조군 개 3두에도 같은 방법으로 같은 양의 PBS 를 경구 투여하였다
B. abortus 1119-3과 B. canis RM666을 인공 감염시킨 후에 형성된 항체 역가는 앞선 논문(백 등, 2000; 허 등, 2001)에서 사용한 B. abortus 1119-3과 B. canis M- 균주를 배양하여 whole cells를 진단액으로 제조한 STAT, PAT, RBT 그리고 2ME-RSAT를 B. canis M- hot saline 추출 항원과 B. abortus 1119-3 의 세포질성 항원을 항원으로 한 ELISA와 상호 비교시험하였다.
PAT: B. abortus 1119-3을 Alton 등(1975)의 방법에 따라 PAT 진단 항원으로 제조하여 각 혈청을 희석배율별로 측정하여 3두의 측정치를 산술 평균하였다 이들 혈청의 희석배율은 Alton 등(1975)의 STAT 판정 기준에서의 혈청 첨가량에 따라 1:25 (80 ㎕), 1:50 (40 ㎕), 1:100(20㎕), 1:200(10 ㎕), 1:400 (5 ㎕), 1:800(2.5 ㎕), 1:1, 600(1.25 ㎕) 그리고 1:3, 200(0.625 ㎕)으로 항체 역가를 표시하였다.
국내 토종견에 B. abortus 1119-3 과 B. canis RM666을 인공 감염시킨 후 형성된 항체 역가를 측정하고자 B. abortus 1119-3 을 STAT 진단 항원으로 제조하여 비교실험 하였던 바, Table 1에서와 같은 결과를 얻었다. 즉, B.
국내 토종견에 B. abortus와 B. canis를 인공 감염시킨후 유도된 항체를 B. abortus 세포질성 물질을 이용한 ELISA를 B. canis M- hot saline extracts를 항원으로 하는 ELISA와 B. abotus 1119-3 의 whole cells를 항원으로 하는 STAT, PAT RBT와 B. canis M- 균주의 whole cells를 항원으로 하는 2ME-RSAT와 상호 비교하여 보았다.
연구자들은 국내에서 브루셀라병을 근절 시키기 위한 연구의 하나로 B. canis를 개에게 인공 감염시킨 후 형성된 항체를 여러 종류의 진단 방법으로 상호 비교하여 인공감염의 성립과정을 관찰한데(백 등, 2000) 이어 국내 젖소에서 분리한 B. abortus biotype 1을 불활성화 시킨 항원으로 개에게 인공 면역시킨 후 소에서의 브루셀라병 표준 진단법인 standard tube agglutination test (STAT), plate agglutination test (PAT) 그리고 rose bengal test(RBT)와 개에서 사용되는 2-mercaptoethanol rapid slide agglutination test (2ME-RSAT) 등의 방법(허 등 2001)으로 항체의 형성과 소실을 관찰한 데 이어서 국내 토종견에 B. abortus와 B. canis를 경구 감염시킨 후 유도된 항체 역가를 동시에 진단할 수 있는 진단법을 개발하기 위해 B. abortus 1119-3을 항원으로 하여 소등에서 브루셀라병 진단법으로 사용되고 있는 STAT, PAT, RBT와 개에서 B. canis에 의한 브루셀라병 검출 시 사용되고 있는 진단법 인 2ME-RSAT를 B. canis M-균주의 hot saline 추출물과 B. abortus 1119-3 의 세포질성 단백질을 항원으로 한 ELISA와 비교 실험을 수행하였다.
ovis)를 함유한 진단 항원으로 검출할 수 없는 Brucella spp. 즉 B. abortus, B. melitensis 그리고 B. suis에 감염된 개는 Brucella의 세포질성 단백질 항원을 이용하면 진단할 수 있다는 보고가 있어(Carmichael 등, 1984; Baldi 등, 1994), 이 연구에서는 국내 토종견에게 우선 B. abortus 1119-3 과 B. canis를 인공 감염시킨 후 형성된 항체를 소 등에서 브루셀라병 진단에 사용되고 있는 STAT, PAT RBT와 개에서 브루셀라병 진단에 사용되고 있는 2ME-RSAT와 ELISA와 B. abortus 세포질성 물질을 이용한 ELISA 를 상호 비교하여 보았다.
대상 데이터
국립수의과학검역원에서 B. canis RM666과 B. canis M- 균주 그리고 B. abortus 1119-3을 분양받아 B. abortus 1119-3 은 potato infusion agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 에, B. canis RM666과 B. canis M- 균주는 Brucella agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 에 접종하여 37oC에서 24 ~ 72 시간 배양하여 실험에 사용하였다
전라북도 전주에 있는 한 개 사육농가에서 구매한 토종견 중 2ME-RSAT와 RBT를 실시하여 음성인 평균 생후 1년생 9두를 구매하여 3개 군으로 구분하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
2ME-RSAT: B. canis M- 균주를 백 등(2000)의 방법에 따라 진단용 항원을 준비하여 혈청을 분주한 후 0.2 M 2-mercaptoethanol 40 ㎕ 를 첨가하고 준비한 진단액 40 ㎕ l를 첨가한 후 2분 이내에 응집 여부를 확인하였으며, 이들 혈청의 항체 역가는 위 PAT와 동일한 방법으로 표시하였다.
RBT: B. abortus 1119-3을 허 등(2001)의 방법에 따라 제조한 후 각 혈청을 희석배율별로 측정하였다. 이들 혈청의 항체 역가는 위의 PAT와 동일한 방법으로 표시하였다.
STAT: 인공 감염시킨 후의 항체 역가는 허 등 (2001) 의 방법에 따라 B. abortus 1119-3 을 배양하여 STAT 진단 항원으로 제조하여 응집 정도를 혈청 희석배율별로 측정하였으며 3두의 측정치를 산술 평균하였다
abortus 1119-3를 김 등(1998)의 방법을 약간 변형하여 ELISA용 항원으로 제조하였다. 즉, B. abortus를 김 등(1998)의 방법에 따라 준비하여불활화 시켰다 이 불활성화 부유액에 Triton X-100(Merck Co., Rahway, USA)과 Sarkosyl (N-lauroylsarcosine, Sigma Co., Saint Louis, MO, USA)이 각각 0.4% 가 되게 가하여, 세포외막 단백질과 세포질성 단백질을 분리하였다. 이 반응액을 4oC에서 100, 000xg로 1시간 원심분리 하였다 상층액을 조심스럽게 제거한 다음 세포질성 단백질 항원으로 준비하여 냉동보관하며 실험에 사용하였다
성능/효과
B. canis M- 균주를 2ME-RSAT 진단 항원으로 제조하여 인공감염 후 형성된 항체 역가를 측정하였던 바, Table 2에서와 같이] B. canis RM666을 약 5.0x109 CFU로 인공 감염시킨 경우에는 감염 2주 후에 1:50의 항체 역가가 관찰되기 시작하여 4주, 6주 후에 각각 1:660, 1:800의 항체 역가를 관찰되었으며, 감염 10주부터는 1:400 이상의 항체 역가를 계속 유지하였다. 하지만 B.
0 이상의 높은 흡광도가 관찰되었다. B. canis M- 균주를 2ME-RSAT 진단 항원으로 흐]였을 때 B. canis를 인공 감염시킨 2주 후에 1:50 정도의 항체 역가가 관찰되기 시작하여 시험 전 기간 1:400 이상의 높은 항체 역가가 관찰되었고 B. canis M- 균주를 hot saline extracts를 항원으로 ELISA를 수행한 결과 감염 2주 후부터 1.0 이상의 흡광도를 관찰할 수 있었던 반면 B. abortus 1119-3으로 인공 감염시킨 개에서 얻은 혈청에서는 B. canis M- 균주를 항원으로 한 어떤 진단법에도 반응이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 이 같은 결과는 B.
그 결과 B. abortus 1119-3을 진단 항원으로 한 STAT, PAT, RBT의 경우에 B. abortus 1119-3을 5.0x109 CFU로 인공 감염시킨 후 유도된 항체는 모두 감염 1주 후부터 응집반응이 관찰되었지만, 점차 항체 역가가 감소하여 STAT와 RBT 에서는 감염 10주 후부터 그리고 PAT 에서는 감염 8주 후부터 응집반응이 관찰되지 않았지만 B. abortus 1119-3의 세포질성 물질을 항원으로 사용한 ELISA 에서는 감염 1주 후부터 시험이 끝나는 전 기간에 걸쳐 1.5 이상의 흡광도가 관찰되었다 그리고 B. canis를 5.0x109 CFU로 인공 감염시킨 후 STAT, PAT 그리고 RBT를 이용하여 항체 역가를 측정한 결과, 이들 모든 진단법에서 응집반응이 관찰되지 않았지만 B. abortus 1119-3의 세포질성 물질을 항원으로 한 ELISA 에서는 감염 4주 후부터 2.0 이상의 높은 흡광도가 관찰되었다. B.
canis M- 균주를 항원으로 한 어떤 진단법에도 반응이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 이 같은 결과는 B. abortus 1119-3의 세포질성 단백질을 항원으로 한 ELISA는 개에서 B. abortus와 B. canis의 감염에 의한 브루셀라병 검출에 유용한 진단법임을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는 B. abortus 1119-3의 세포질성 단백질을 힝원으로 한 ELISA는 개에서 B. abortus와 B. canis 의 감염에 의한 브루셀라병 검출에 유용한 진단법임을 확인할 수 있었다.
1에서 보는 바와 같았다. 즉 B. canis RM666으로 감염시킨 경우에는 감염 전, 감염 1주, 2주 4주 6주 8주 10주 그리고 12주 후의 흡광도는 각각 0.658, 0.744, 1.092, 1.109, 1.241, 1.1.257, 1.249 그리고 2.16이었으며, B. abortus 1119-3으로 인공 감염시킨 경우와 대조군의 경우에는 모든 혈청에서 시험 전 기간 0.7 이하의 흡광도가 관찰되었다.
abortus 1119-3 을 STAT 진단 항원으로 제조하여 비교실험 하였던 바, Table 1에서와 같은 결과를 얻었다. 즉, B. abortus 1119-3 을 약 5.0x109 CFU로 인공 감염시킨 경우에는 감염 1주, 2주, 4주, 6주 그리고 10주 후에 각각 1:530, 1:260, 1:160, 1:100 그리고 1:10의 항체 역가가 각각 관찰되었지만, B. canis RM666을 인공 감염시킨 경우와 대조군의 경우에는 응집반응이 관찰되지 않았다
후속연구
끝으로 우리나라에서 최근 5년간 매년 약 5,000여두 이상에서 소 브루셀라병에 의해 살처분 되고 있는 실정을 고려하면 정부가 지금까지 펼쳐온 브루셀라병 방역정책인 검색과 살처분 정책만으로는 농민의 피해를 막을 수 없을 뿐만 아니라 이 질병의 확산은 분명할 것으로 생각되어 국내에서 소와 함께 생활하고 있는 개에서의 브루셀라병에 관한 연구가 필요할 것이라 생각하였으며, 국내 토종견에서 B. abortus 1119-3 인공 감염에 따른 이 연구 결과는 향후 국내 소에서의 브루셀라병 원인균인 B. abortus biotype 1에 대한 개에서의 진단법 확립에 대한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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