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문제 정의
- 또한 본 연구에서는 expansin 유전자 중에서 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자를 대상으로 애기장대 뿌리에서의 굴중성 반응과 BRs의 신호전달 과정과의 관계를 알아보았다. 먼저 애기장대의 조직 별 AtEXPA3의 발현 양상을 조사한 결과 줄기의 잎, 근출엽, 뿌리, 꽃, 줄기 등 모든 조직에서 발현이 확인되며 특히 생장이 활발한 조직에서 발현량이 높은 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 애기장대의 BRs-insensitive mutant를 이용하여 BRs의 신호전달 과정과 뿌리의 굴중성 작용기작과의 관계를 알아보고자 하였으며, microarray를 통해 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자가 BRs의 신호전달 과정을 통해 발현되는지를 알아보고자 하였다. 또한 애기장대를 이용하여 RNA interference (RNAi)를 이용한 AtEXPA3의 knockout 돌연변이를 제작함으로써 뿌리에서의 AtEXPA3유전자의 굴중성 반응과 함께 BRs와의 작용을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 애기장대의 BRs-insensitive mutant를 이용하여 BRs의 신호전달 과정과 뿌리의 굴중성 작용기작과의 관계를 알아보고자 하였으며, microarray를 통해 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자가 BRs의 신호전달 과정을 통해 발현되는지를 알아보고자 하였다. 또한 애기장대를 이용하여 RNA interference (RNAi)를 이용한 AtEXPA3의 knockout 돌연변이를 제작함으로써 뿌리에서의 AtEXPA3유전자의 굴중성 반응과 함께 BRs와의 작용을 알아보고자 하였다.
- 애기장대의 뿌리에 BL을 처리했을 때, 굴중성 반응이 촉진과 AtEXPA3 유전자의 발현이 증가되는 결과를 통해 BRs의 신호전달 과정이 굴중성에 관여할 가능성을 예상하였다. 이에 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 내생의 BRs가 신호전달 과정을 통해 AtEXPA3 유전자의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해 BRs-insensitive 돌연변이체에 중력자극을 1시간 처리하여AtEXPA3의 발현을 조사하였다. 그 결과, Col-0, BRI-GFP에서 AtEXPA3의 발현이 증가된 반면, bri-301, bak1 돌연변이체에서는 AtEXPA3의 발현이 증가하지 않았다(Fig.
제안 방법
- 5일 또는 10일간 생육된 애기장대 seedling을 액체 질소에 바로 얼린 후 cold pestle과 mortar를 이용해 분쇄한 뒤 Tri reagent를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 역전사 시킨 후 얻어진 cDNA와 AtEXPA3 유전자의 5'-GTCCCTATCCAATACACATCTCT CTCTCT-3'와 5'-TTACACGGTCCATTCGACTCGATCACTGA-3'를 각각 forward와 reverse primer로 사용하여 발현 양상을 조사하였다.
- AtEXPA3의 발현이 뿌리의 굴중성과 관련하여 BL과 IAA에 의해 발현이 증가됨이 애기장대 뿌리에서 확인되어, BL(10-9 M) 또는 IAA (10-10 M)를 처리한 돌연변이체와 Col-0를 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 굴중성 반응을 측정하였다. 그 결과 호르몬을 처리하지 않은 AtEXPA3 RNAi 돌연변이체는 야생형에 비해 15%의 굴중성 억제효과가 나타났다.
- 외부에서 처리한 BL에 의해 애기장대 뿌리에서도 굴중성 반응이 촉진되고 있음이 확인되어, BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 애기장대 뿌리의 굴중성 반응을 조사하였다. BRs의 receptor로서 알려진 BRI1 유전자의 변이에 의해 BRs를 인식하지 못하는 bri1 돌연변이체 중에서 bri-301 및 BRI1과 상호작용하여 BRI1을 인산화시키는 것으로 BRs의 신호전달에 관여하는 BAK1 유전자의 돌연변이체인 bak1, 그리고 BRI1의 promoter와 유전자를 GFP (green fluorescent protein) 유전자에 결합되어 야생형보다 2배 많은 BRI1을 가지는 BRI-GFP 돌연변이체를 이용하여 MS 고형 배지에서 5일간 수직으로 생육하여 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 굴중성 반응을 측정하였다. 그 결과, bri-301 돌연변이체는 Col-0와 비교하여, 약 24%의 굴중성 반응이 억제되었으며, bak1 돌연변이체는 약 14%의 굴중성 반응이 억제되었다.
- E1I1의 primer는 5'에 XbaI site와 BamHI site를 각각 첨가하여 5'-tctagaCTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'과 5'-ggatccTAGCAAAACCCCA-3'를 제작하였으며, reverseE1 (RE1)의 primer는 5'에 BamHI site와 SacI site를 각각 첨가하여 5'-ggatccATTGTGCCGGAG-3'과 5'-gagctcGACTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'를 제작하여, Col-0에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 이용하여 증폭하였다.
- MS배지에 BL과 IAA를 처리한 후, 종자를 일렬로 심어, growth chamber에서 수직으로 5일 또는 10일간 생육한 것을 굴중성 반응과 길이 측정에 사용하였다. RT-PCR을 통한 유전자의 발현 분석을 위해서는 호르몬을 처리하지 않은 MS 고체 배지에서 5일간 생육한 뒤, 새로운 액상 MS 배지에 각각의 호르몬을 처리한 후, 개체를 액상 MS 배지에서 1시간 처리하였다.
- RNAi를 위한 DNA construct를 제작하기 위하여, AtEXPA3의 3개의 exon 중에서 exon1 (E1)과 intron1 (I1)을 표적으로 하여 primer를 제작하였다. E1I1의 primer는 5'에 XbaI site와 BamHI site를 각각 첨가하여 5'-tctagaCTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'과 5'-ggatccTAGCAAAACCCCA-3'를 제작하였으며, reverseE1 (RE1)의 primer는 5'에 BamHI site와 SacI site를 각각 첨가하여 5'-ggatccATTGTGCCGGAG-3'과 5'-gagctcGACTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'를 제작하여, Col-0에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 이용하여 증폭하였다.
- MS배지에 BL과 IAA를 처리한 후, 종자를 일렬로 심어, growth chamber에서 수직으로 5일 또는 10일간 생육한 것을 굴중성 반응과 길이 측정에 사용하였다. RT-PCR을 통한 유전자의 발현 분석을 위해서는 호르몬을 처리하지 않은 MS 고체 배지에서 5일간 생육한 뒤, 새로운 액상 MS 배지에 각각의 호르몬을 처리한 후, 개체를 액상 MS 배지에서 1시간 처리하였다. 이후 실험에 따라 뿌리와 자엽을 분리하여 total RNA를 뽑아 RT-PCR에 사용하였다.
- 이후 실험에 따라 뿌리와 자엽을 분리하여 total RNA를 뽑아 RT-PCR에 사용하였다. 굴중성 반응과 길이 측정은 digital camera (SANYO, VCTAZ1)를 이용하여 촬영한 뒤, 측정은 Image-Pro Plus 프로그램(Yongma)을 이용하여 각도와 길이를 측정하였다.
- 다양한 농도의 brassinolide (BL, 10-10 M - 10-7 M)을 처리한 MS 고형 배지에서 5일간 수직으로 생육한 Col-0를 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 꺾인 정도를 측정하였다. 그 결과, 외부 처리한 BL의 농도가 증가할수록 뿌리의 굴중성 반응이 촉진되는 결과를 확인하였다(Fig.
- 돌연변이체를 포함한 애기장대 종자는 70% ethanol과 bleach solution (30% clorox, 0.025% Triton X-100)을 사용하여 표면 소독한 후, 4℃, 암조건에서 2일간 춘화 처리하여 사용하였다. 춘화처리 된 종자는 굴중성 반응과 길이를 측정하기 위해 MS (1% sucrose, 0.
- 또한 BRs-insensitive 돌연변이체에 ethylene (0.001 ppm)과 ethylene 생합성 억제제인 AVG (10-2 M)를 6시간 동안 처리하여 굴중성 반응을 조사하였다. 그 결과 ethylene을 처리하였을 경우, 야생형을 포함한 bri-301, BRI-GFP, bak1 돌연변이체에서 각각 15%, 17%, 6% 그리고 20%의 굴중성 반응이 촉진되었으며, AVG를 처리하였을 경우에는 야생형을 포함한 bri-301, BRI-GFP, bak1 돌연변이체에서 각각 55%, 5%, 70% 그리고 53%의 감소된 굴중성 반응이 나타났다(Fig.
- 애기장대의 AtEXPA3 RNAi 돌연변이체를 이용하여 AtEXPA3의 발현이 억제되었을 때, 뿌리에서의 굴중성 반응을 알아 보았다. 먼저 뿌리에서 AtEXPA3의 발현이 뿌리의 생장에 미치는 효과를 알아보고자 뿌리의 생장을 관찰한 결과 RNAi 돌연변이체에서 Col-0와 뿌리의 길이생장을 비교할 때, 약 33%의 길이 생장 억제효과가 관찰되었다(Fig.
- 애기장대의 어린 뿌리에서의 발현이 확인된 AtEXPA3 유전자를 대상으로 BL과 IAA에 의한 발현 정도를 알아보기 위하여 5일 동안 생육된 Col-0를 BL (10-6 M - 10-8 M)과 IAA (10-6 M - 10-8 M)의 농도를 달리하여 처리한 액상 MS 배지에서 1시간 동안 배양한 후, 뿌리와 자엽을 분리하여 뿌리에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 유전자의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과 BL과 IAA의 농도가 증가함에 따라 AtEXPA3의 발현이 증가됨이 관찰되었다.
- 얻어진 애기장대의 종자(T1)는 상기의 방법으로 표면 소독 후, 춘화 처리하여 kanamycin (50 μg ml-1)이 포함된 MS(1% sucrose, 0.8% micro agar) 배지가 고형화된 사각 petri-dish (125×125×20 mm)에 일렬로 심은 뒤, growth chamber에서 생육하여 kanamycin에 저항성을 나타내는 개체를 선별하였으며, 선별된 개체는 peat moss와 vermiculite를 1:1로 혼합하여 만든 화분(pot)에 옮겨 심어 다음 세대의 종자(T2)를 얻었다.
- 외부에서 처리한 BL에 의해 애기장대 뿌리에서도 굴중성 반응이 촉진되고 있음이 확인되어, BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 애기장대 뿌리의 굴중성 반응을 조사하였다. BRs의 receptor로서 알려진 BRI1 유전자의 변이에 의해 BRs를 인식하지 못하는 bri1 돌연변이체 중에서 bri-301 및 BRI1과 상호작용하여 BRI1을 인산화시키는 것으로 BRs의 신호전달에 관여하는 BAK1 유전자의 돌연변이체인 bak1, 그리고 BRI1의 promoter와 유전자를 GFP (green fluorescent protein) 유전자에 결합되어 야생형보다 2배 많은 BRI1을 가지는 BRI-GFP 돌연변이체를 이용하여 MS 고형 배지에서 5일간 수직으로 생육하여 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 굴중성 반응을 측정하였다.
- 또한 AtEXPA3의 발현이 외부 처리한 BL과 IAA에 의해 증가하는 결과가 나타나 AtEXPA3의 발현이 BL과 IAA에 의해 조절될 가능성이 나타났다. 이러한 결과를 통해 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬을 통해 특정 유전자의 발현을 증가시켜 작용하는 것으로 예상하고 이를 확인하고자 bri-301, bak1, BRI-GFP에 중력자극을 주고 AtEXPA3의 발현을 측정하였다. 그 결과 야생형에서는 AtEXPA3의 발현이 중력자극을 준 뿌리에서 뚜렷한 발현 증가가 나타났으나, bri-301과 bak1에서는 중력자극을 주지 않은 뿌리와 비교할 때 뚜렷한 발현의 차이가 나타나지 않았다.
- RT-PCR을 통한 유전자의 발현 분석을 위해서는 호르몬을 처리하지 않은 MS 고체 배지에서 5일간 생육한 뒤, 새로운 액상 MS 배지에 각각의 호르몬을 처리한 후, 개체를 액상 MS 배지에서 1시간 처리하였다. 이후 실험에 따라 뿌리와 자엽을 분리하여 total RNA를 뽑아 RT-PCR에 사용하였다. 굴중성 반응과 길이 측정은 digital camera (SANYO, VCTAZ1)를 이용하여 촬영한 뒤, 측정은 Image-Pro Plus 프로그램(Yongma)을 이용하여 각도와 길이를 측정하였다.
- E1I1의 primer는 5'에 XbaI site와 BamHI site를 각각 첨가하여 5'-tctagaCTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'과 5'-ggatccTAGCAAAACCCCA-3'를 제작하였으며, reverseE1 (RE1)의 primer는 5'에 BamHI site와 SacI site를 각각 첨가하여 5'-ggatccATTGTGCCGGAG-3'과 5'-gagctcGACTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'를 제작하여, Col-0에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이후 양방향 염기서열 분석에 의해 E1I1-RE1의 construct를 확인한 뒤 pBI121 vector에 삽입하였다. E1I1-RE1/pBI 121vector 이후 electroporator를 이용하여 agrobacterium에 형질전환 한 후, floral dipping방법[6]을 이용하여 애기장대에 형질전환 하였다.
- 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자의 조직 별 발현양상을 알아보기 위해 30일 동안 growth chamber에서 생육된 Col-0를 대상으로 RT-PCR을 통해 AtEXPA3의 발현을 조사하였다. 그 결과 AtEXPA3 유전자의 발현이 애기장대의 모든 부분, 즉 줄기의 잎, 근출엽(rosette leaf), 뿌리, 꽃, 줄기에서 발현되는 것이 확인되었다(Fig.
- 추출한 RNA를 역전사 시킨 후 얻어진 cDNA와 AtEXPA3 유전자의 5'-GTCCCTATCCAATACACATCTCT CTCTCT-3'와 5'-TTACACGGTCCATTCGACTCGATCACTGA-3'를 각각 forward와 reverse primer로 사용하여 발현 양상을 조사하였다.
대상 데이터
- 각각의 개체에서 얻어진 종자는 다시 kanamycin이 포함된 멸균된 1× MS 고체 배지에서 저항성을 갖는 개체만을 화분에 옮겨 얻어진 종자(T3)만을 RNAi mutant로 실험에 사용하였다.
- 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 야생형으로 Col-0(Columbia-0)를 이용하였으며, 애기장대의 BRs 관련 mutants(bri1-301, bak1, BRI-GFP)는 모두 University of Michigan(Ann Arbor, MI)의 Jianming Li로부터 공여 받았다.
이론/모형
- 이후 양방향 염기서열 분석에 의해 E1I1-RE1의 construct를 확인한 뒤 pBI121 vector에 삽입하였다. E1I1-RE1/pBI 121vector 이후 electroporator를 이용하여 agrobacterium에 형질전환 한 후, floral dipping방법[6]을 이용하여 애기장대에 형질전환 하였다. 이후 실온에서 이틀간 애기장대(T0)를 말린 후, growth chamber (light 16 hr, 22℃/dark 8 hr, 20℃, 습도 70%)에서 생육하여 종자(T1)를 얻었다.
성능/효과
- BRs에 의한 발현증가가 확인된 AtEXPA3이 직접적인 뿌리의 굴중성 반응을 나타내는지를 알아보기 위해 RNAi 돌연변이체를 이용하여 확인한 결과 RNAi 돌연변이체에 중력자극이 주어졌을 때 야생형에 비해 굴중성 반응이 억제되는 결과를 확인하였다. 또한 AtEXPA3 유전자의 결핍에 따라 뿌리의 길이와 측근의 생성이 억제되는 결과를 통해, AtEXPA3가 굴중성 반응뿐만 아니라 뿌리의 생장 전반에 관여하고 있음을알 수 있었다.
- 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자의 조직 별 발현양상을 알아보기 위해 30일 동안 growth chamber에서 생육된 Col-0를 대상으로 RT-PCR을 통해 AtEXPA3의 발현을 조사하였다. 그 결과 AtEXPA3 유전자의 발현이 애기장대의 모든 부분, 즉 줄기의 잎, 근출엽(rosette leaf), 뿌리, 꽃, 줄기에서 발현되는 것이 확인되었다(Fig. 4A). 특징적인 것은 이러한 AtEXPA3 유전자의 발현이 성체시기에 뿌리에서 좀더 강하게 발현되었으며, 어린 식물을 대상으로 5일과 10일 정도 키운 애기장대를 뿌리와 자엽으로 나누어 AtEXPA3의 발현을 조사하였을 경우에는 성체시기에서 나타나는 것과는 달리 뿌리 보다는 자엽에서의 발현이 강하게 나타났다(Fig.
- M)의 농도를 달리하여 처리한 액상 MS 배지에서 1시간 동안 배양한 후, 뿌리와 자엽을 분리하여 뿌리에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 유전자의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과 BL과 IAA의 농도가 증가함에 따라 AtEXPA3의 발현이 증가됨이 관찰되었다. 그러나 BL (10-7 M)과 IAA(10-8 M)를 함께 처리하였을 경우에는 BL과 IAA의 상승효과로 인한 발현 증가는 나타나지 않았다(Fig.
- 001 ppm)과 ethylene 생합성 억제제인 AVG (10-2 M)를 6시간 동안 처리하여 굴중성 반응을 조사하였다. 그 결과 ethylene을 처리하였을 경우, 야생형을 포함한 bri-301, BRI-GFP, bak1 돌연변이체에서 각각 15%, 17%, 6% 그리고 20%의 굴중성 반응이 촉진되었으며, AVG를 처리하였을 경우에는 야생형을 포함한 bri-301, BRI-GFP, bak1 돌연변이체에서 각각 55%, 5%, 70% 그리고 53%의 감소된 굴중성 반응이 나타났다(Fig. 3). 이러한 결과는 뿌리에서의 굴중성 반응은 내생의 BRs가 신호전달 과정이 정상적으로 이루어지지 않더라도 외부에서 처리 한 ethylene에 의해서도 굴중성 반응이 촉진되며, 뿌리에서의 ethylene 생합성이 AVG를 통해 억제되었을 경우 상당한 굴중성 억제 효과가 나타나 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬에 의해 조절되는 것으로 생각된다.
- 이러한 결과를 통해 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬을 통해 특정 유전자의 발현을 증가시켜 작용하는 것으로 예상하고 이를 확인하고자 bri-301, bak1, BRI-GFP에 중력자극을 주고 AtEXPA3의 발현을 측정하였다. 그 결과 야생형에서는 AtEXPA3의 발현이 중력자극을 준 뿌리에서 뚜렷한 발현 증가가 나타났으나, bri-301과 bak1에서는 중력자극을 주지 않은 뿌리와 비교할 때 뚜렷한 발현의 차이가 나타나지 않았다. 또한 BRI-GFP에서는 중력자극을 준 뿌리에서 뚜렷한 AtEXPA3의 발현이 확인되었는데 이러한 결과는 중력자극을 통해 내생 함량이 증가된 BRs가 신호전달 과정을 통해 AtEXPA3 유전자의 발현을 증가시켜 굴중성 반응을 나타내는 것으로서 뿌리에서의 굴중성 반응이 BRs에 의해 특정 유전자의 발현을 조절함으로써 나타나는 것이라 하겠다.
- M)를 처리한 돌연변이체와 Col-0를 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 굴중성 반응을 측정하였다. 그 결과 호르몬을 처리하지 않은 AtEXPA3 RNAi 돌연변이체는 야생형에 비해 15%의 굴중성 억제효과가 나타났다. 반면 BL을 처리하였을 경우에는 각각 Col-0에서 48%, RNAi에서는 24%의 굴중성 촉진효과가, IAA을 처리한 경우 Col-0, RNAi에서 각각 12%, 3%의 굴중성 촉진효과가 나타났다.
- 이에 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 내생의 BRs가 신호전달 과정을 통해 AtEXPA3 유전자의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해 BRs-insensitive 돌연변이체에 중력자극을 1시간 처리하여AtEXPA3의 발현을 조사하였다. 그 결과, Col-0, BRI-GFP에서 AtEXPA3의 발현이 증가된 반면, bri-301, bak1 돌연변이체에서는 AtEXPA3의 발현이 증가하지 않았다(Fig. 5). 이러한 결과는 중력자극에 의한 AtEXPA3의 발현이 BRs의 신호전달 과정을 통해 조절되는 것이라 하겠다.
- BRs의 receptor로서 알려진 BRI1 유전자의 변이에 의해 BRs를 인식하지 못하는 bri1 돌연변이체 중에서 bri-301 및 BRI1과 상호작용하여 BRI1을 인산화시키는 것으로 BRs의 신호전달에 관여하는 BAK1 유전자의 돌연변이체인 bak1, 그리고 BRI1의 promoter와 유전자를 GFP (green fluorescent protein) 유전자에 결합되어 야생형보다 2배 많은 BRI1을 가지는 BRI-GFP 돌연변이체를 이용하여 MS 고형 배지에서 5일간 수직으로 생육하여 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 굴중성 반응을 측정하였다. 그 결과, bri-301 돌연변이체는 Col-0와 비교하여, 약 24%의 굴중성 반응이 억제되었으며, bak1 돌연변이체는 약 14%의 굴중성 반응이 억제되었다. 그러나 BRI-GFP의 경우 약 28%의 굴중성 반응이 촉진되었다(Fig.
- M)을 처리한 MS 고형 배지에서 5일간 수직으로 생육한 Col-0를 6시간 동안 중력자극을 주어 뿌리의 꺾인 정도를 측정하였다. 그 결과, 외부 처리한 BL의 농도가 증가할수록 뿌리의 굴중성 반응이 촉진되는 결과를 확인하였다(Fig. 1).
- 또한 애기장대의 BRs-insensitive 돌연변이체에 ethylene을 처리하여 ethylene에 의한 굴중성 반응을 확인한 결과 bri-301, bak1, BRI-GFP에서 ethylene에 의한 굴중성 반응 활성이 유사하게 나타났다. 또한 AVG를 처리하여 내생의 ethylene의 생합성이 저해되었을 때, 굴중성 반응이 현저히 억제되는 결과가 나타났는데, 이를 통해 ethylene 그 자체도 굴중성을 촉진시키는 활성을 갖고 있으며, 뿌리에서의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬의 상호작용에 의해 조절되리라 예상할 수 있다.
- BRs에 의한 발현증가가 확인된 AtEXPA3이 직접적인 뿌리의 굴중성 반응을 나타내는지를 알아보기 위해 RNAi 돌연변이체를 이용하여 확인한 결과 RNAi 돌연변이체에 중력자극이 주어졌을 때 야생형에 비해 굴중성 반응이 억제되는 결과를 확인하였다. 또한 AtEXPA3 유전자의 결핍에 따라 뿌리의 길이와 측근의 생성이 억제되는 결과를 통해, AtEXPA3가 굴중성 반응뿐만 아니라 뿌리의 생장 전반에 관여하고 있음을알 수 있었다. 또한 외부 처리한 BL 또는 IAA에 의해서 RNAi 돌연변이체에 굴중성 반응이 촉진되는 결과가 나타났다.
- 이를 고려할 때, 본 연구에서 확인한 AtEXPA3의 뿌리에서의 발현은 지속적인 뿌리생장에 반드시 필요한 것으로 생각된다. 또한 AtEXPA3의 발현이 외부 처리한 BL과 IAA에 의해 증가하는 결과가 나타나 AtEXPA3의 발현이 BL과 IAA에 의해 조절될 가능성이 나타났다. 이러한 결과를 통해 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬을 통해 특정 유전자의 발현을 증가시켜 작용하는 것으로 예상하고 이를 확인하고자 bri-301, bak1, BRI-GFP에 중력자극을 주고 AtEXPA3의 발현을 측정하였다.
- 그 결과 야생형에서는 AtEXPA3의 발현이 중력자극을 준 뿌리에서 뚜렷한 발현 증가가 나타났으나, bri-301과 bak1에서는 중력자극을 주지 않은 뿌리와 비교할 때 뚜렷한 발현의 차이가 나타나지 않았다. 또한 BRI-GFP에서는 중력자극을 준 뿌리에서 뚜렷한 AtEXPA3의 발현이 확인되었는데 이러한 결과는 중력자극을 통해 내생 함량이 증가된 BRs가 신호전달 과정을 통해 AtEXPA3 유전자의 발현을 증가시켜 굴중성 반응을 나타내는 것으로서 뿌리에서의 굴중성 반응이 BRs에 의해 특정 유전자의 발현을 조절함으로써 나타나는 것이라 하겠다.
- 이상과 같이 본 연구에서는 애기장대의 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 뿌리에서의 굴중성 반응이 BRs의 신호 전달 과정을 통한 AtEXPA3 유전자 발현변화로 인해 일어남을 확인 하였다. 또한 BRs와 auxin에 의해 생합성이 증가되는 것으로 알려진 ethylene도 뿌리의 굴중성 반응을 촉진함을 확인하였다. 본 연구를 통해 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬, 즉 BRs, auxin, ethylene에 의해 나타나며, 또한 이러한 식물 호르몬 중에서 BRs에 의해 세포 생장에 관여하는 expansin 유전자 중에서 AtEXPA3 유전자의 발현이 굴중성 반응을 증가하는 것을 처음으로 확인하였다.
- 6A). 또한 RNAi 돌연변이체는 Col-0에 비하여, 측근의 형성이 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 6B). 이러한 결과는 뿌리에서의 AtEXPA3 유전자의 발현이 뿌리의 생장과 측근 형성에 관여하는 것으로 뿌리의 생장에 이러한 AtEXPA3의 발현이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 또한 애기장대의 BRs-insensitive 돌연변이체에 ethylene을 처리하여 ethylene에 의한 굴중성 반응을 확인한 결과 bri-301, bak1, BRI-GFP에서 ethylene에 의한 굴중성 반응 활성이 유사하게 나타났다. 또한 AVG를 처리하여 내생의 ethylene의 생합성이 저해되었을 때, 굴중성 반응이 현저히 억제되는 결과가 나타났는데, 이를 통해 ethylene 그 자체도 굴중성을 촉진시키는 활성을 갖고 있으며, 뿌리에서의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬의 상호작용에 의해 조절되리라 예상할 수 있다.
- 또한 AtEXPA3 유전자의 결핍에 따라 뿌리의 길이와 측근의 생성이 억제되는 결과를 통해, AtEXPA3가 굴중성 반응뿐만 아니라 뿌리의 생장 전반에 관여하고 있음을알 수 있었다. 또한 외부 처리한 BL 또는 IAA에 의해서 RNAi 돌연변이체에 굴중성 반응이 촉진되는 결과가 나타났다. 이러한 결과는 세포 생장에 관여하는 다수의 expansin 중 AtEXPA3 이외에 다른 expansin 유전자와 세포 생장에 관련된다른 유전자가 BL 또는 IAA를 통해 굴중성 반응에 관여하기 때문인 것으로 사료된다(Fig.
- 반면 BL을 처리하였을 경우에는 각각 Col-0에서 48%, RNAi에서는 24%의 굴중성 촉진효과가, IAA을 처리한 경우 Col-0, RNAi에서 각각 12%, 3%의 굴중성 촉진효과가 나타났다. 또한BL과 IAA를 동시에 처리했을 경우에는 Col-0, RNAi에서 각각 70%, 38%로 굴중성 촉진효과가 나타났다(Fig. 7). 이는 AtEXPA3 유전자의 발현은 뿌리의 생장을 촉진함으로써 굴중성 반응을 촉진시키며, 또한 BL과 IAA에 의해 발현이 증가되어 활성을 나타내는 결과라 하겠다.
- 애기장대의 AtEXPA3 RNAi 돌연변이체를 이용하여 AtEXPA3의 발현이 억제되었을 때, 뿌리에서의 굴중성 반응을 알아 보았다. 먼저 뿌리에서 AtEXPA3의 발현이 뿌리의 생장에 미치는 효과를 알아보고자 뿌리의 생장을 관찰한 결과 RNAi 돌연변이체에서 Col-0와 뿌리의 길이생장을 비교할 때, 약 33%의 길이 생장 억제효과가 관찰되었다(Fig. 6A). 또한 RNAi 돌연변이체는 Col-0에 비하여, 측근의 형성이 뚜렷하게 관찰되었다(Fig.
- 또한 본 연구에서는 expansin 유전자 중에서 중력자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 AtEXPA3 유전자를 대상으로 애기장대 뿌리에서의 굴중성 반응과 BRs의 신호전달 과정과의 관계를 알아보았다. 먼저 애기장대의 조직 별 AtEXPA3의 발현 양상을 조사한 결과 줄기의 잎, 근출엽, 뿌리, 꽃, 줄기 등 모든 조직에서 발현이 확인되며 특히 생장이 활발한 조직에서 발현량이 높은 것을 확인하였다. Wieczorek 등[15]은 AtEXPA3가 shoot specific expression 한다고 보고하였지만, 최근 microarray data에서 AtEXP3의 발현이 뿌리의 발달 전 시기 동안 지속되고 있음을 확인하였다[28].
- 그 결과 호르몬을 처리하지 않은 AtEXPA3 RNAi 돌연변이체는 야생형에 비해 15%의 굴중성 억제효과가 나타났다. 반면 BL을 처리하였을 경우에는 각각 Col-0에서 48%, RNAi에서는 24%의 굴중성 촉진효과가, IAA을 처리한 경우 Col-0, RNAi에서 각각 12%, 3%의 굴중성 촉진효과가 나타났다. 또한BL과 IAA를 동시에 처리했을 경우에는 Col-0, RNAi에서 각각 70%, 38%로 굴중성 촉진효과가 나타났다(Fig.
- 또한 BRs와 auxin에 의해 생합성이 증가되는 것으로 알려진 ethylene도 뿌리의 굴중성 반응을 촉진함을 확인하였다. 본 연구를 통해 뿌리의 굴중성 반응이 다양한 식물 호르몬, 즉 BRs, auxin, ethylene에 의해 나타나며, 또한 이러한 식물 호르몬 중에서 BRs에 의해 세포 생장에 관여하는 expansin 유전자 중에서 AtEXPA3 유전자의 발현이 굴중성 반응을 증가하는 것을 처음으로 확인하였다. 그러나 애기장대에서 다수의 expansin 유전자가 존재함이 알려져 있어 AtEXPA3이외에 다른 expansin 유전자도 BRs를 포함한 auxin과 ethylene에 의해 조절될 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 애기장대의 뿌리에 BL을 처리했을 때, 굴중성 반응이 촉진과 AtEXPA3 유전자의 발현이 증가되는 결과를 통해 BRs의 신호전달 과정이 굴중성에 관여할 가능성을 예상하였다. 이에 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 내생의 BRs가 신호전달 과정을 통해 AtEXPA3 유전자의 발현을 조절하는지를 알아보기 위해 BRs-insensitive 돌연변이체에 중력자극을 1시간 처리하여AtEXPA3의 발현을 조사하였다.
- 4B). 이러한 결과는 AtEXPA3의 발현이 식물체의 모든 부분에서 발현되며, 식물의 생장이 활발한 어린 시기에는 뿌리보다는 자엽에서 활발히 발현되어 잎과 줄기의 생장에 관여하며, 생장이 더 이상 진행되지 않은 성체시기에서는 그 발현이 점차 줄어드는 것으로 사료된다. 이와는 달리 지속적인 생장을 하는 뿌리에서는 성체시기에도 AtEXPA3의 발현이 감소하지 않는 것으로 사료된다.
- 이상과 같이 본 연구에서는 애기장대의 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용하여 뿌리에서의 굴중성 반응이 BRs의 신호 전달 과정을 통한 AtEXPA3 유전자 발현변화로 인해 일어남을 확인 하였다. 또한 BRs와 auxin에 의해 생합성이 증가되는 것으로 알려진 ethylene도 뿌리의 굴중성 반응을 촉진함을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서 야생형의 애기장대 뿌리에 다양한 농도의 BL을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 굴중성 반응을 증가되는 것을 확인 하였다. 이에 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용한 굴중성 반응에서 야생형 애기장대와 비교한 결과, bri-301과 bak1은 야생형보다 감소된 굴중성 반응을 보이며, 야생형보다 BRs의 신호전달이 증가된 BRI-GFP에서는 굴중성 반응의 증가현상이 나타났다. 이는 BRs의 신호전달 과정이 애기장대 뿌리의 굴중성 반응을 조절하는 것으로, 뿌리가 중력자극을 받으면 내생의 BRs의 함량을 증가시켜 BRs의 신호전달 과정을 통해 특정 유전자의 활성을 증가시킨 후, 이 유전자의 발현을 통해 굴중성 반응에 작용하는 것으로 사료된다.
- 이에 본 연구에서 야생형의 애기장대 뿌리에 다양한 농도의 BL을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 굴중성 반응을 증가되는 것을 확인 하였다. 이에 BRs-insensitive 돌연변이체를 이용한 굴중성 반응에서 야생형 애기장대와 비교한 결과, bri-301과 bak1은 야생형보다 감소된 굴중성 반응을 보이며, 야생형보다 BRs의 신호전달이 증가된 BRI-GFP에서는 굴중성 반응의 증가현상이 나타났다.
- 4A). 특징적인 것은 이러한 AtEXPA3 유전자의 발현이 성체시기에 뿌리에서 좀더 강하게 발현되었으며, 어린 식물을 대상으로 5일과 10일 정도 키운 애기장대를 뿌리와 자엽으로 나누어 AtEXPA3의 발현을 조사하였을 경우에는 성체시기에서 나타나는 것과는 달리 뿌리 보다는 자엽에서의 발현이 강하게 나타났다(Fig. 4B). 이러한 결과는 AtEXPA3의 발현이 식물체의 모든 부분에서 발현되며, 식물의 생장이 활발한 어린 시기에는 뿌리보다는 자엽에서 활발히 발현되어 잎과 줄기의 생장에 관여하며, 생장이 더 이상 진행되지 않은 성체시기에서는 그 발현이 점차 줄어드는 것으로 사료된다.
후속연구
- 그러나 애기장대에서 다수의 expansin 유전자가 존재함이 알려져 있어 AtEXPA3이외에 다른 expansin 유전자도 BRs를 포함한 auxin과 ethylene에 의해 조절될 가능성이 있는 것으로 사료된다. 따라서 뿌리의 굴중성 반응기작을 이해하기 위해서는 굴중성 반응에 작용하는 식물 호르몬인 BRs, auxin, ethylene에 의해 발현이 조절되는 expansin 유전자를 구체적으로 선별하고 이들 유전자의 기능과 식물 호르몬과의 상관관계를 연구하는 것이 필요하다 생각된다.
- 6B). 이러한 결과는 뿌리에서의 AtEXPA3 유전자의 발현이 뿌리의 생장과 측근 형성에 관여하는 것으로 뿌리의 생장에 이러한 AtEXPA3의 발현이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
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