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문제 정의
- 또한 비만으로 인한 산화적 스트레스 증가가 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스 감소를 통하여 뇌 조직의 IEGs (c-fos, c-jun)에 어떠한 영향을 주는지 규명하는 연구가 절실히 필요하다. 따라서 본 연구는 고지방식이 비만유도 rat을 대상으로 조직의 산화적 손상이 neurogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고, 규칙적인 유산소성 운동으로 인한 개선 효과를 분자 생물학적 차원에서 규명하고자 한다.
제안 방법
- Korea)을 물과 함께 공급하여 비만을 유도 하였다. 15주간 비만 유도 후, 비만식이 비훈련군(high fat diet sedentary, HDS, n=15), 비만식이 훈련군(high fat diet training, HDT, n=15)으로 분류하여 사육하였다. 실험 기간 동안 식이 섭취량은 매일 같은 시각(18:00)에 측정하였으며, 체중은 매주 1회(18:30) 일정한 시간에 computingscale 체중계(CAS, Korea)를 이용하여 측정하였고, 식이섭취에 의한 일시적인 체중 변화를 막기 위해 측정 2시간 전에 식이 그릇을 제거한 후 실시 하였다.
- 1주일간의 환경적응(일반식이: Dong-a SF, Korea)을 시킨 후, 15주간 모든 필수 영양소, vitamin과 mineral, 그리고 fat 40%가 함유된 AIN-76A (Jung-ang Lab. Animal, Inc. Korea)을 물과 함께 공급하여 비만을 유도 하였다. 15주간 비만 유도 후, 비만식이 비훈련군(high fat diet sedentary, HDS, n=15), 비만식이 훈련군(high fat diet training, HDT, n=15)으로 분류하여 사육하였다.
- 1차 antibody NGF (sc-548)와 BDNF (sc-546), b-actin (sc-1616) (Santa Cruz biotechnology, Santa, CA, USA), Erk (AF 1576), c-fos, c-jun (R&D system, Minneapolis, MN, USA), MDA를 4℃에서 overnight 반응하였으며, 2차 antibody를 실온에서 1시간 반응한 뒤 ECL solution (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 발색한 뒤 LAS-3000으로 단백질 발현을 확인하였다.
- TC, TG, 및 HDL-C 함량은 효소법에 의한 정량용 kit (각각 AM201-K, AM202-K, AM157S-K, AM203-K, Asan Co., Korea)로 측정하였다. 혈청 0.
- 실험동물들은 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르(ethyl ether)를 이용하여 마취 시켰다. 마취된 실험동물은 해부판 위에 사지를 고정시키고, 70% 알코올 분무기로 분무한 후, 복부를 절개하여 복부 정맥에서 10 ml의 정맥혈을 채혈하였으며, 이후 약 3 g의 해마와 5 g의 간을 샘플링 하였다. 두 조직은 deepfreezer (MVE Co.
- 고지방식이 rat을 대상으로 규칙적인 운동을 시킨 결과 운동 후 rat의 혈중 8-OHdG 농도의 유의한 감소가 나타나 운동의 긍정적 영향을 보고하고 있으며[2,24], 또한 흰쥐를 대상으로 12주간 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스의 지표인 혈중 MDA농도가 감소됨을 발견하여 운동을 통한 산화적 스트레스의 개선을 보고하고 있다[14]. 본 연구는 장기간 고지방식이 유도를 통하여 비만을 유발한 뒤 운동트레이닝의 효과를 분석하였다. 그 결과 TG와 TC 모두 지속적인 고지방식이를 실시한 HDS 그룹에서 유의한 증가가 나타난 반면, HDT그룹은 변화가 나타나지 않았다.
- 산화적 DNA 손상의 지표로 이용되는 8-OHdG는 DNA damage ELISA kit (Assay Designs, USA)로 측정하였다. Sample diluent에서 8-OHdG standard와 sample을 준비한 다음, 8-OHdG immunoassay plate의 각 well에 standard와 sample을 50 μl를 첨가하였으며, 각 well에 anti-8-OHdG를 50 μl 첨가하였다.
- 15주간 비만 유도 후, 비만식이 비훈련군(high fat diet sedentary, HDS, n=15), 비만식이 훈련군(high fat diet training, HDT, n=15)으로 분류하여 사육하였다. 실험 기간 동안 식이 섭취량은 매일 같은 시각(18:00)에 측정하였으며, 체중은 매주 1회(18:30) 일정한 시간에 computingscale 체중계(CAS, Korea)를 이용하여 측정하였고, 식이섭취에 의한 일시적인 체중 변화를 막기 위해 측정 2시간 전에 식이 그릇을 제거한 후 실시 하였다.
- 두 그룹 내 운동과 비운동군 뇌 인지기능의 효과를 검증하기 위해 Morris water maze (MWM)를 사용하였다[18]. 실험 절차는 미로학습 검사를 시작하기 하루 전에 도피대가 없는 상태에서 수영풀 안을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 하여 물에 대한 적응을 유도하였으며, 훈련이 시작되면 동물은 4사분면 중 한쪽에서 동물의 머리가 벽면을 향하도록 하여 살며시 물 안으로 놓아주어, 2그룹 모두 3일 동안 총 6회 실시하여 platform을 찾아 올라갈 때까지의 잠재기를 측정하였다.
- 운동 프로그램은 15주간 고지방식이를 통해 비만을 유도한 후, Sim 등[30]의 연구에서 사용된 방법과 동일하게, 주 5일, 1일 40분씩 8주간 실시하였다. 트레드밀 운동은 1~4주는 경사도 0° 고정된 조건에서 처음 5분간은 2 m/min의 속도로, 다음 5분간은 5 m/min의 속도로, 그리고 남은 30분 동안은 8 m/min의 속도로 실시하였다.
- 트레드밀 훈련 전과 후에 꼬리 정맥에서 1 ml의 혈액을 채혈하였으며, 혈청지질성분과 8-OHdG를 분석하였다. 트레드밀 훈련 후 채혈과 조직샘플링은 일시적인 운동 효과를 배제하기 위해, 훈련종료 48시간 경과 후에 실시하였으며, 사료는 12시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다.
- 트레드밀 훈련 전과 후에 꼬리 정맥에서 1 ml의 혈액을 채혈하였으며, 혈청지질성분과 8-OHdG를 분석하였다. 트레드밀 훈련 후 채혈과 조직샘플링은 일시적인 운동 효과를 배제하기 위해, 훈련종료 48시간 경과 후에 실시하였으며, 사료는 12시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다. 실험동물들은 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르(ethyl ether)를 이용하여 마취 시켰다.
대상 데이터
- 두 그룹 내 운동과 비운동군 뇌 인지기능의 효과를 검증하기 위해 Morris water maze (MWM)를 사용하였다[18]. 실험 절차는 미로학습 검사를 시작하기 하루 전에 도피대가 없는 상태에서 수영풀 안을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 하여 물에 대한 적응을 유도하였으며, 훈련이 시작되면 동물은 4사분면 중 한쪽에서 동물의 머리가 벽면을 향하도록 하여 살며시 물 안으로 놓아주어, 2그룹 모두 3일 동안 총 6회 실시하여 platform을 찾아 올라갈 때까지의 잠재기를 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 동물은 국가공인 동물취급업체로부터 분양 받은 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐(4주령) 30마리로서 D대학교 의과대학 동물실험실에서 한 cage에 2마리씩 넣어 사육하였다. 동물 사육실은 high efficiency particulate arrestant(HEPA) 항시 무균청정공기를 공급시키는 필터와 외부의 오염공기가 차단되는 양압 설비를 갖추고 있으며, 사육실 내의 온도는 22-24℃, 습도는 60%, 조명 등이 자동 제어되어 일정한 조건의 사육환경이 제공될 수 있는 시설을 갖추었다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻은 자료는 SPSS Windows Ver 14.0 통계 package를 이용하여, 모든 측정항목에 대해 평균과 표준 편차를 산출하였다. 집단 간의 트레이닝에 따른 혈액성분에 대한 차이검증을 위해 이원분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하였으며, 시기 간 차이가 있을 시 대응표본 t-test를 실시하였고, 집단 간 차이가 있을 시 독립표본 t-test를 실시하였다.
- 집단 간의 트레이닝에 따른 혈액성분에 대한 차이검증을 위해 이원분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하였으며, 시기 간 차이가 있을 시 대응표본 t-test를 실시하였고, 집단 간 차이가 있을 시 독립표본 t-test를 실시하였다. 조직분석은 독립표본 t-test를 실시하였으며, 모든 통계적 유의 수준은 ɑ=0.05로 설정하였다.
- 0 통계 package를 이용하여, 모든 측정항목에 대해 평균과 표준 편차를 산출하였다. 집단 간의 트레이닝에 따른 혈액성분에 대한 차이검증을 위해 이원분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하였으며, 시기 간 차이가 있을 시 대응표본 t-test를 실시하였고, 집단 간 차이가 있을 시 독립표본 t-test를 실시하였다. 조직분석은 독립표본 t-test를 실시하였으며, 모든 통계적 유의 수준은 ɑ=0.
성능/효과
- Table 2와 같이 공간학습효과를 알아보기 위해 MWM latency 방법을 이용한 결과 두 그룹 모두 첫날에 비해 3일째에 유의하게 시간을 단축하였다(p<0.05).
- Table 3에서 혈청지질 성분의 분석 결과 HDS군에서 TG와 TC 모두 8주 전에 비해 후에서 유의하게 증가하였으며(p<0.05), post 시점의 그룹간 비교는 HDS군에 비해 HDT군이 유의하게 낮게 나타났다(p<0.05).
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고찰
고지방식이 비만 유도 쥐를 대상으로 8주간의 트레드밀 훈련은 고지방 식이로 인한 혈청 지질성분의 불균형을 완화해주었으며, 동시에 산화적 스트레스의 감소를 가져왔다. 그리고 규칙적인 유산소성 운동이 비만으로 발생된 뇌 성장 인자의 감소를 막아, NT와 초기발현 단백질 농도를 개선함으로써 뇌기능 향상에 긍정적인 결과를 얻을 수 있었다.
- 본 연구는 장기간 고지방식이 유도를 통하여 비만을 유발한 뒤 운동트레이닝의 효과를 분석하였다. 그 결과 TG와 TC 모두 지속적인 고지방식이를 실시한 HDS 그룹에서 유의한 증가가 나타난 반면, HDT그룹은 변화가 나타나지 않았다. 그리고 HDL-c는 HDT그룹에서 유의한 증가가 나타났다.
- 그 결과 TG와 TC 모두 지속적인 고지방식이를 실시한 HDS 그룹에서 유의한 증가가 나타난 반면, HDT그룹은 변화가 나타나지 않았다. 그리고 HDL-c는 HDT그룹에서 유의한 증가가 나타났다. 이러한 결과는 고지방식이에 따른 혈청지질의 불균형 현상이 규칙적인 운동으로 TG와 TC가 악화되는 것을 막아주며, HDL-c는 개선시키는 것으로 고지방식이에 대한 지질성분의 불균형을 운동트레이닝으로 막을 수 있었다.
- 그리고 HDL-c은 그룹 간 유의한 차이가 나타나지 않았지만, HDT군에서 8주간의 트레드밀 훈련 전에 비해 훈련 후 유의한 증가가 나타났다(p<0.05).
- 고지방식이 비만 유도 쥐를 대상으로 8주간의 트레드밀 훈련은 고지방 식이로 인한 혈청 지질성분의 불균형을 완화해주었으며, 동시에 산화적 스트레스의 감소를 가져왔다. 그리고 규칙적인 유산소성 운동이 비만으로 발생된 뇌 성장 인자의 감소를 막아, NT와 초기발현 단백질 농도를 개선함으로써 뇌기능 향상에 긍정적인 결과를 얻을 수 있었다.
- 이러한 결과는 선행연구에서 시상하부에 국한된 것과는 달리 운동의 긍정적 효과가 인지기능과 학습능력에 직접적으로 관여하는 뇌의 해마에서 나타남으로써 그 의미가 크다고 할 수 있다. 따라서 규칙적인 운동이 해마에서 NGF의 발현은 물론 c-jun의 발현을 증가 시켜 학습능력과 기억력의 향상을 유발하였으며, 유기체의 신경세포성장에 긍정적인 영향을 주게 되어 공간인지 능력의 향상을 가져온 것으로 판단된다.
- 또한 3일째 그룹간의 비교에서 HDT가 HDS보다 유의하게 시간을 단축시켰다(p<0.05).
- 05), HDT군은8주간의 트레드밀 훈련 전후 차이가 없었다. 또한 훈련 후HDT에 비해 HDS 수준이 높게 나타났다.
- 운동과 관련된 선행연구를 보면, Chae 등[4]은 6주간의 트레드밀 훈련이 Erk의 발현을 증가 시킨다고 하였으며, Iemitsu 등[13]은 12주간의 트레드밀 훈련후 Erk의 발현이 증가한다고 보고하였다. 본 연구 결과 고지방 식이는 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스 감소뿐만 아니라, 특히 선행연구와 같은 시상하부가 아니 뇌의 해마에서 MAPK cascades의 Erk 발현 증가현상을 가져왔으며, 또한 NTs의 긍정적 변화를 통해 감소된 BDNF 발현 증가를 가져온 것으로 사료된다.
- 또한 Toldy 등[35]은 전두엽과 소뇌에서 규칙적인 운동으로 c-jun이 증가한다고 보고하였으며, Iemitsu 등[13]은 심장에서 rats을 대상으로 48시간의 트레드밀 운동이 그렇지 않은 그룹보다 c-jun의 발현이 증가 한다고 보고하였다. 본 연구 결과 해마에서 트레드밀 훈련 후의 NGF의 단백질 발현이 증가되었으며, 또한 c-jun의 발현이 HDT 그룹에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 인지기능 검사의 직접적인 효과로서 Water maze time을 유의하게 감소시켰다.
- 운동 이후 NT의 증가가 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 free radical의 감소를 유발하며, ROS의 수준을 긍정적으로 조절하기 위한 NT의 적응력 향상으로 뇌기능 향상의 저해 요소인 산화적 손상을 완화하는 것으로 보고되고 있다[29]. 본 연구에서 트레드밀 운동은 해마에서 고지방식이 유도 비만 쥐의 감소된 BDNF를 증가시켜 주는 것으로 나타났다. 한편, BDNF의 downstream인 MAPK cascades중 Erk는 뇌의 학습과 기억, 그리고 synaptic plasticity와 같은 기능 조절을 담당하며[33], 3개의 주요한 cascade인 extracellular signal-regulated kinase (Erk), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 그리고 p38 MAPK (p38)로 분류할 수 있다[28].
- 뿐만 아니라, Fig. 2와 같이 간에서 MDA는 8주간의 트레드밀 훈련 후 HDT군이 HDS군보다 유의하게 낮게 나타났다(p<0.05).
- 산화적 DNA 손상의 지표인 8-OHdG는 Fig. 1과 같이 HDS군에서 8주 전후 유의한 차이가 나타났지만(p<0.05), HDT군은8주간의 트레드밀 훈련 전후 차이가 없었다.
- 그리고 HDL-c는 HDT그룹에서 유의한 증가가 나타났다. 이러한 결과는 고지방식이에 따른 혈청지질의 불균형 현상이 규칙적인 운동으로 TG와 TC가 악화되는 것을 막아주며, HDL-c는 개선시키는 것으로 고지방식이에 대한 지질성분의 불균형을 운동트레이닝으로 막을 수 있었다. 한편, 혈중 8-OHdG 농도와 간에서의 MDA 발현은 트레드밀 훈련 후 HDS 보다 HDT 그룹에서 유의하게 감소하였다.
- 하지만 c-jun과 BDNF는 8주간의 트레드밀 훈련 후 HDT군이 HDS군보다 유의하게 높은 것으로 나타났다(p<0.05).
- 이러한 결과는 고지방식이에 따른 혈청지질의 불균형 현상이 규칙적인 운동으로 TG와 TC가 악화되는 것을 막아주며, HDL-c는 개선시키는 것으로 고지방식이에 대한 지질성분의 불균형을 운동트레이닝으로 막을 수 있었다. 한편, 혈중 8-OHdG 농도와 간에서의 MDA 발현은 트레드밀 훈련 후 HDS 보다 HDT 그룹에서 유의하게 감소하였다. 이러한 결과로 볼 때 지속적인 고지방 식이에도 불구하고 규칙적인 운동은 체중 감소를 유도하고 산화적 스트레스에 의한 간에서의 조직 손상 악화를 효과적으로 방어해 준다고 볼 수 있다.
후속연구
- 그러나 운동에 의한 항비만 효과에 이러한 기전들이 어떻게 작용하는지에 대해서는 아직 알려진바 없다. 또한 비만으로 인한 산화적 스트레스 증가가 규칙적인 운동으로 산화적 스트레스 감소를 통하여 뇌 조직의 IEGs (c-fos, c-jun)에 어떠한 영향을 주는지 규명하는 연구가 절실히 필요하다. 따라서 본 연구는 고지방식이 비만유도 rat을 대상으로 조직의 산화적 손상이 neurogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고, 규칙적인 유산소성 운동으로 인한 개선 효과를 분자 생물학적 차원에서 규명하고자 한다.
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