독도에 자생하고 있는 식물의 뿌리로부터 내생진균의 분리를 시도하여, 동도로 부터 참억새, 돌피, 쇠무릎과 서도에서 갯별꽃 및 율무쑥등을 연구재료로 사용하였다. 총 21종의 내생진균을 분리하였고, universal primers ITS-1과 ITS-4를 사용하여 ITS 영역을 PCR로 증폭하여 동정하였다. 염기서열 분석결과, 동도에 자생하는 참억새에서는 Penicillium 속 균주가 75%, Aspergillus 균주가 25%, 분리되었고, 돌피에서는 Penicillium 속 균주가 55%, Aspergillus 속 균주가 30%, Zygorhynchus 속 균주가 15%가 분리되었으며, 쇠무릎에서는 Penicillium 속 균주가 50%, Aspergillus 속 균주가 12%, Gibberella 속 균주가 13%, Talaromyces 속 균주가 9%, Umbelopsis 속 균주가 8% 분리되었다. 서도에 자생하는 갯별꽃에서는 Penicillium 속 균주가 76%, Pestalotiopsis 속 균주가 24% 분리되었고, 율무쑥에서는 Penicillium 속 균주가 81%, Mucor 속 균주가 19% 분리되었다. Bioassay결과, 돌피에서 분리된 Ec-3-1균주가 식물생장촉진활성을 나타내었다. 그리고 독도의 5종류 식물에서 Penicillium 속의 내생진균이 가장 많이 존재함을 알 수 있었다.
독도에 자생하고 있는 식물의 뿌리로부터 내생진균의 분리를 시도하여, 동도로 부터 참억새, 돌피, 쇠무릎과 서도에서 갯별꽃 및 율무쑥등을 연구재료로 사용하였다. 총 21종의 내생진균을 분리하였고, universal primers ITS-1과 ITS-4를 사용하여 ITS 영역을 PCR로 증폭하여 동정하였다. 염기서열 분석결과, 동도에 자생하는 참억새에서는 Penicillium 속 균주가 75%, Aspergillus 균주가 25%, 분리되었고, 돌피에서는 Penicillium 속 균주가 55%, Aspergillus 속 균주가 30%, Zygorhynchus 속 균주가 15%가 분리되었으며, 쇠무릎에서는 Penicillium 속 균주가 50%, Aspergillus 속 균주가 12%, Gibberella 속 균주가 13%, Talaromyces 속 균주가 9%, Umbelopsis 속 균주가 8% 분리되었다. 서도에 자생하는 갯별꽃에서는 Penicillium 속 균주가 76%, Pestalotiopsis 속 균주가 24% 분리되었고, 율무쑥에서는 Penicillium 속 균주가 81%, Mucor 속 균주가 19% 분리되었다. Bioassay결과, 돌피에서 분리된 Ec-3-1균주가 식물생장촉진활성을 나타내었다. 그리고 독도의 5종류 식물에서 Penicillium 속의 내생진균이 가장 많이 존재함을 알 수 있었다.
Endophytic fungi were isolated from the roots of plants growing naturally on the island of Dokdo. Plant samples, such as Miscanthus sinensis, Achyranthus japonica and Echinochloa crusgali were isolated from Dongdo, and those such as Honkenya peploides and Artemsia koidzumii were isolated from Seodo....
Endophytic fungi were isolated from the roots of plants growing naturally on the island of Dokdo. Plant samples, such as Miscanthus sinensis, Achyranthus japonica and Echinochloa crusgali were isolated from Dongdo, and those such as Honkenya peploides and Artemsia koidzumii were isolated from Seodo. Twenty one strains of endophytic fungi were isolated from these plants. To identify the strains, PCR (polymerase chain reaction) amplification of the partial ITS (Internal Transcribed Spacer) regions was done with universal primers ITS-1 and ITS-4 to determine the nucleotide sequence of the ITS regions. Of the strains isolated from Miscanthus sinensis, 75% were Penicillium sp. and 25% were Aspergillus sp. Fifty five percent of strains isolated from Achyranthus japonica were Penicillium sp., 30% were Aspergillus sp. and 15% were Zygorhynchus sp. Strains isolated from Echinochloa crusgali were Penicillium sp. (50%), Aspergillus sp. (12%), Giberella sp. (13%), Talaromyces sp. (9%) and Umbelopsis sp. (8%). Of the strains isolated from Honkenya peploides, 76% were Penicillium sp. and 24% were Pestalotiopsis sp. Strains isolated from Artemisia koidzumii were Penicillium sp. (81%) and Mucor sp. (19%). As a result of bioassay, Ec-3-1 strain isolated from Echinochloa crusgalli showed plant growth-promotion activity. Of all the endophytic fungi isolated, Penicillium sp. was the most abundantly distributed fungal strain in all plants used in this study.
Endophytic fungi were isolated from the roots of plants growing naturally on the island of Dokdo. Plant samples, such as Miscanthus sinensis, Achyranthus japonica and Echinochloa crusgali were isolated from Dongdo, and those such as Honkenya peploides and Artemsia koidzumii were isolated from Seodo. Twenty one strains of endophytic fungi were isolated from these plants. To identify the strains, PCR (polymerase chain reaction) amplification of the partial ITS (Internal Transcribed Spacer) regions was done with universal primers ITS-1 and ITS-4 to determine the nucleotide sequence of the ITS regions. Of the strains isolated from Miscanthus sinensis, 75% were Penicillium sp. and 25% were Aspergillus sp. Fifty five percent of strains isolated from Achyranthus japonica were Penicillium sp., 30% were Aspergillus sp. and 15% were Zygorhynchus sp. Strains isolated from Echinochloa crusgali were Penicillium sp. (50%), Aspergillus sp. (12%), Giberella sp. (13%), Talaromyces sp. (9%) and Umbelopsis sp. (8%). Of the strains isolated from Honkenya peploides, 76% were Penicillium sp. and 24% were Pestalotiopsis sp. Strains isolated from Artemisia koidzumii were Penicillium sp. (81%) and Mucor sp. (19%). As a result of bioassay, Ec-3-1 strain isolated from Echinochloa crusgalli showed plant growth-promotion activity. Of all the endophytic fungi isolated, Penicillium sp. was the most abundantly distributed fungal strain in all plants used in this study.
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문제 정의
본 연구는 천연기념물 및 특정도서 제1호로 지정된 독도에서 자생하고 있는 참억새, 쇠무릎, 돌피, 갯별꽃, 율무쑥등 뿌리내부 진균을 분리하여 동정을 수행하였으며, 아직까지 연구되지 않은 지역에 존재하는 내생진균을 분리동정하여 다양성을 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 동도에 서식하고 있는 참억새(Miscanthus sinensis)와 쇠무릎(Achyranthes japonica) 그리고 돌피(Echinochloa crusgalli), 서도에 서식하고 있는 갯별꽃(Honkenya peploides)과 율무쑥(Artemisia koidzumii)의 뿌리에서 공생 및 상호작용 관계에 있는 내생진균을 확인하기 위하여 이들 식물뿌리 내부에서 진균류를 분리하여, rDNA-ITS 영역을 이용하여 동정하였으며, 내생진균이 가지는 식물생장촉진활성을 검정하기 위하여 bioassay를 수행하였고, 이들 균주의 다양성에 대하여 조사하였다[5-9,14]
제안 방법
5% Agarose gel에서 전기영동 후, EtBr (Ethidium bromide)로 10분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인하였다[6,7,8,9,14]. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하였으며, 생산된 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 분석하였다[14]. 그리고 분석된 내생진균 종들 간에 계통분석은 MEGA 4.
독도식물 뿌리에서 분리한 내생진균를 배양하기 위하여 Czapek's liquid medium (1% Glucose, 1% Bacto-peptone, 0.1% KH2PO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4 · 7H2O, 0.001% FeSO4 · 7H2O, pH 7.3)에 접종하여 25℃에서 180 rpm의 조건으로 7일간 진탕 배양하였으며 filter paper를 사용하여 배양액을 여과하였다.
독도에서 분리한 내생진균의 분자적인 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 분리된 균류들과 서열 상동성이 가장 높은 균류 들을 분석하였다(Table 2).
독도의 동도와 서도에서 채취한 식물 시료의 뿌리부분을 절단하여 흙을 모두 제거하고, 계면활성제인 Tween 80을 첨가하고 10분간 교반 한 후에 증류수로 세척하였다. 그리고 과 염소산(Perchloric acid) 1%에 10분간 2회 교반 후, 증류수로 세척하였으며 3~4 cm로 절단하여 수분을 제거하였다.
그리고 배양액은 bioassay시험을 위하여 5일 동안 동결건조 후에 30배 농축하였다. 동결건조를 수행한 내생진균은 DNeasy Plant mini kit (QIAgen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다[6,7,8,9,]. 추출된 genomic DNA는 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS영역을 증폭하였다.
1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara)를 사용하였으며, 50 ul로 반응용량을 맞추어 사용하였다. 반응조건은 predenaturation (95℃, 2min), denaturation (95℃, 30 sec), annealing (54.5℃, 1 min), extension (72℃, 1 min), total cycles (35 cycles), final extension (72℃, 7 min)으로 수행하여 4℃에 보관하였으며, 증폭된 PCR 산물은 1.5% Agarose gel에서 전기영동 후, EtBr (Ethidium bromide)로 10분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인하였다[6,7,8,9,14]. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc.
식물생장촉진활성을 검정하기 위하여 uniconazol 80 ppm과 스포탁을 24시간 처리하였고, 난장이벼 유묘의 이엽기 부분에 내생진균의 농축배양을 10 μl 처리하여 7일 동안 유묘의 생장을 측정하였다.
추출된 genomic DNA는 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS영역을 증폭하였다. PCR수행 조건은 최종농도 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 nM dNTPs이고, 10 pmol의 primer와 0.1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara)를 사용하였으며, 50 ul로 반응용량을 맞추어 사용하였다. 반응조건은 predenaturation (95℃, 2min), denaturation (95℃, 30 sec), annealing (54.
식물시료는 동도(dongdo)에서 참억새와 쇠무릎 및 돌피를 채취하였고, 서도(Seodo)에서 갯별꽃과 율무쑥을 채취 하였다(Table 1). 본 연구는 독도에 서식하는 식물의 뿌리로부터 분리한 내생진균을 사용하였고, 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 Gibberella fujikuroi (KCCM 12329) 균주를 control로 사용하였으며, 식물생장촉진활성 검정인 bioassay 시험을 위하여 식물시료는 난장이벼(waito-c)를 사용하였다.
식물시료는 동도(dongdo)에서 참억새와 쇠무릎 및 돌피를 채취하였고, 서도(Seodo)에서 갯별꽃과 율무쑥을 채취 하였다(Table 1). 본 연구는 독도에 서식하는 식물의 뿌리로부터 분리한 내생진균을 사용하였고, 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 Gibberella fujikuroi (KCCM 12329) 균주를 control로 사용하였으며, 식물생장촉진활성 검정인 bioassay 시험을 위하여 식물시료는 난장이벼(waito-c)를 사용하였다.
데이터처리
, Germany)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하였으며, 생산된 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 분석하였다[14]. 그리고 분석된 내생진균 종들 간에 계통분석은 MEGA 4.1프로그램 Neighbor-Joining (1000 bootstrap replicates)방법을 수행하여 분석하였다[6-9,14].
통계처리는 실험으로부터 얻은 결과를 SPSS version 19.0을 이용하여 각 실험에 대하여 평균±표준편차로 표시하였으며, p<0.05 수준에서 T-test로 비교 분석하였다.
성능/효과
독도에 서식하고 있는 식물인 참억새에서 4종, 쇠무릎에서 4종, 돌피에서 8 종, 갯별꽃에서 3종 그리고 율무쑥에서 2종으로 모두 21종의 내생진균을 분리하였다. 동도에 자생하는 참억새에서는 Penicillium sp.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
독도의 토양은 어떠한가?
4%를 이루고 있어 급경사가 많은 지역이다[2,3]. 그리고 독도의 토양은 화산활동에 의해 형성되었으며, 매우 건조하고 염분함량이 높으며 유기영양분과 광조건이 상당히 부족하다[14,16]. 그리고 독도는 내륙과 격리되어 있으며, 온난 다습한 기후로 인하여 한반도와는 다른 특수한 식물상 및 식물군락을 형성하고 있다.
독도는 무엇인가?
독도는 북서태평양 연해인 동해의 남부와 울릉분지 북쪽 경계에 위치(E 131°52′07″, N 37°14′12″)하고 있는 해양성 화산도이다. 한류와 난류가 만나 완대류를 형성하고 있으며 연평균 12℃의 기온을 나타내고 눈과 비가 오는 날이 많으며, 급경사 지역이 대부분을 차지하고 있고 강한 바람의 영향으로 식물이 서식하기에는 악조건이다.
독도는 한반도와는 다른 특수한 식물상 및 식물군락을 형성하고 있는데 미생물에 관한 연구에 있어서 어떠한 지역으로 알려져 있는가?
독도의 미생물에 관한 연구는 식물근권세균(PGPR) 및 새로운 미생물종이 발견될 가능성이 상당히 높은 지역으로 알려져 있다[2,4,17].
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