하수오와 백하수오의 에탄올 추출물에 의한 B16/F10 Melanoma 세포주의 멜라닌 생성 억제효과 Inhibitory Effects of Ethanol Extracts from Polygoni multiflori radix and Cynanchi wilfordii radix on Melanogenesis in Melanoma Cells원문보기
멜라닌 색소는 피부를 보호하는 긍정적인 면을 갖고 있으나 이의 과잉생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 등을 유발하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인한 세포의 사멸 및 피부암 생성이 촉진되기도 한다. 이에 적하수오와 백하수오가 멜라닌 세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 각각의 에탄올 추출물이 tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 하수오와 백하수오의 총 폴리페놀 함량은 각각 17.31${\pm}$0.54 mg GA eq/g, 2.75${\pm}$0.22 mg GA eq/g로 나타났으며, 하수오와 백하수오의 총 플라보노이드 함량은 각각 6.38${\pm}$0.39 mg naringine eq/g, 1.34${\pm}$0.09 mg naringine eq/g로 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 백하수오보다 하수오에서 많은 것으로 나타났다. 하수오와 백하수오의 각각 농도별에 따른 ABTS radical 소거활성은 하수오 1 mg/mL 농도에서 96.89${\pm}$0.22%로 나타났으나, 백하수오는 1 mg/mL 농도에서 6.24${\pm}$0.33%로 하수오에 비하여 소거활성이 낮게 나타났다. 에탄올 추출물에 의한 세포 생존율은 최고 100 ${\mu}g/mL$ 처리 시 하수오와 백하수오 각각에서 93.2${\pm}$1.95%, 91.07${\pm}$4.05%로 두 가지 추출물에서 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다. 멜라닌 생성에 미치는 영향에 대하여 10 ${\mu}g/mL$ 농도에서는 각각 75.9${\pm}$2.23%, 60.77${\pm}$3.07%로 나타났으며, 100 ${\mu}g/mL$ 농도에서는 각각 42.93${\pm}$ 2.26%, 28.37${\pm}$3.05%로 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 점점 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로도 유의성이 관찰되었다. 이 결과는 하수오와 백하수오의 에탄올 추출물이 세포에 독성을 미치지 않으며 멜라닌 생성 저해에 효과적인 미백제로서의 가능성을 제시하였다.
멜라닌 색소는 피부를 보호하는 긍정적인 면을 갖고 있으나 이의 과잉생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 등을 유발하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인한 세포의 사멸 및 피부암 생성이 촉진되기도 한다. 이에 적하수오와 백하수오가 멜라닌 세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 각각의 에탄올 추출물이 tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 하수오와 백하수오의 총 폴리페놀 함량은 각각 17.31${\pm}$0.54 mg GA eq/g, 2.75${\pm}$0.22 mg GA eq/g로 나타났으며, 하수오와 백하수오의 총 플라보노이드 함량은 각각 6.38${\pm}$0.39 mg naringine eq/g, 1.34${\pm}$0.09 mg naringine eq/g로 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 백하수오보다 하수오에서 많은 것으로 나타났다. 하수오와 백하수오의 각각 농도별에 따른 ABTS radical 소거활성은 하수오 1 mg/mL 농도에서 96.89${\pm}$0.22%로 나타났으나, 백하수오는 1 mg/mL 농도에서 6.24${\pm}$0.33%로 하수오에 비하여 소거활성이 낮게 나타났다. 에탄올 추출물에 의한 세포 생존율은 최고 100 ${\mu}g/mL$ 처리 시 하수오와 백하수오 각각에서 93.2${\pm}$1.95%, 91.07${\pm}$4.05%로 두 가지 추출물에서 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다. 멜라닌 생성에 미치는 영향에 대하여 10 ${\mu}g/mL$ 농도에서는 각각 75.9${\pm}$2.23%, 60.77${\pm}$3.07%로 나타났으며, 100 ${\mu}g/mL$ 농도에서는 각각 42.93${\pm}$ 2.26%, 28.37${\pm}$3.05%로 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 점점 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로도 유의성이 관찰되었다. 이 결과는 하수오와 백하수오의 에탄올 추출물이 세포에 독성을 미치지 않으며 멜라닌 생성 저해에 효과적인 미백제로서의 가능성을 제시하였다.
Anti-oxidative activity and tyrosinase inhibitory activity of various ethanol extracts of Polygoni multiflori radix (PMR) and Cynanchi wilfordii radix (CWR) were compared to identify an anti-oxidant and whitening agent source from nature. We conducted an investigation into the anti-oxidant activitie...
Anti-oxidative activity and tyrosinase inhibitory activity of various ethanol extracts of Polygoni multiflori radix (PMR) and Cynanchi wilfordii radix (CWR) were compared to identify an anti-oxidant and whitening agent source from nature. We conducted an investigation into the anti-oxidant activities of PMR and CWR ethanol extracts by measuring total polyphenol content, total flavonoid content, and ABTS radical capacity. The total polyphenol contents of PMR and CWR were 17.31${\pm}$0.54 mg GA/eq g, and 2.75${\pm}$0.22 mg GA/eq g, respectively. The total flavonoid contents of PMR and CWR were 6.38${\pm}$0.39 mg naringine/eq g, and 1.34${\pm}$0.09 mg naringine/eq g, respectively. The 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) radical decolorization of PMR and CWR were 96.89${\pm}$0.21% at 1 mg/mL and 93.49${\pm}$0.76% at 50 mg/mL. Melanoma cells were cultured with the PMR and CWR ethanol extracts for 48 hr, and total melanin content as a final product and the activity of tyrosinase, a key enzyme, in melanogenesis, were estimated. The PMR and CWR ethanol extracts increased melanin content and tyrosinase activity in a dose-dependent manner. These results suggest that PMR and CWR ethanol extracts could be useful as a skin whitening agent.
Anti-oxidative activity and tyrosinase inhibitory activity of various ethanol extracts of Polygoni multiflori radix (PMR) and Cynanchi wilfordii radix (CWR) were compared to identify an anti-oxidant and whitening agent source from nature. We conducted an investigation into the anti-oxidant activities of PMR and CWR ethanol extracts by measuring total polyphenol content, total flavonoid content, and ABTS radical capacity. The total polyphenol contents of PMR and CWR were 17.31${\pm}$0.54 mg GA/eq g, and 2.75${\pm}$0.22 mg GA/eq g, respectively. The total flavonoid contents of PMR and CWR were 6.38${\pm}$0.39 mg naringine/eq g, and 1.34${\pm}$0.09 mg naringine/eq g, respectively. The 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) radical decolorization of PMR and CWR were 96.89${\pm}$0.21% at 1 mg/mL and 93.49${\pm}$0.76% at 50 mg/mL. Melanoma cells were cultured with the PMR and CWR ethanol extracts for 48 hr, and total melanin content as a final product and the activity of tyrosinase, a key enzyme, in melanogenesis, were estimated. The PMR and CWR ethanol extracts increased melanin content and tyrosinase activity in a dose-dependent manner. These results suggest that PMR and CWR ethanol extracts could be useful as a skin whitening agent.
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문제 정의
멜라닌 색소는 피부를 보호하는 긍정적인 면을 갖고 있으나 이의 과잉생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 등을 유발하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인한 세포의 사멸 및 피부암 생성이 촉진되기도 한다. 이에 적하수오와 백하수오가 멜라닌 세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 각각의 에탄올 추출물이 tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 하수오와 백하수오의 총 폴리페놀 함량은 각각 17.
표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포에서 아미노산의 일종인 tyrosine이 tyrosinase 효소의 작용으로 여러 단계를 거쳐 멜라닌이 합성되어 멜라노좀이라는 과립을 형성하고, 생성된 멜라닌은 각질형성세포로 이동되어 자외선 등에 의한 피부의 노화나 일광각화증을 억제하여 피부를 보호하는 긍정적인 기능을 가지고 있는 반면에, 과잉생산에 의한 피부의 색소침착 및 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포사멸을 촉진하는 부정적인 기능을 동시에 가지고 있다(12-14). 현재까지 연구되어진 적하수오와 백하수오의 생리활성에 관한 연구가 부족하고 또한 멜라닌 세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 각각의 에탄올 추출물의 생리활성, tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazo lium bromide(MTT) 정량은 Mosmann(18)의 방법을 변형하여 실시하였다. 세포를 96 well plate에 48시간 배양한 후 상층액을 버리고, 당일 제조한 500 μg/mL MTT를 배양 용기당 1 mL씩 넣어 암실 조건하에 3시간 동안 배양시켰다.
ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성되는 ABTS radical이 샘플 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS)와 2.
B16/F10 melanoma 세포에 에탄올 추출물을 각각 1 μg/mL에서 100 μg/mL의 다양한 농도로 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다.
Tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 각각 1, 10, 100μg/mL이 되도록 녹인 후 세포에 투여하기 전 0.22 μm pore 여과지로 여과하여 농도를 조정한 다음 사용하였다.
농도별 추출물 250 μL에 증류수 2.5 mL과 5% NaNO2 75 μL를 가한 다음, 5분 후 10% AlCl3·6H2O 150 μL를 가하여 6분간 방치하고 1 N NaOH 500 μL를 가하였다.
멜라닌 양은 Hosoi 등(19)의 방법을 변형하여 사용하였다. 세포를 배양하여 PBS로 2회 세척한 후 원심분리 하여 세포 침전물을 만들었다.
10% DMSO가 첨가된 1 N NaOH 200 μL 첨가하고 80℃에서 1시간 동안 용해하였으며, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌(Sigma Co.)을 사용하여 검량선을 작성하였고, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다.
살아있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 불용성 formazan 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 10% DMSO를 200 μL씩 넣고 15분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader로 571 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
시료 200 μL에 Folin-Ciacalteu's phenol reagent 200 μL를 넣고 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 2% Na2CO3 용액 200 μL을 가하여 혼합한 후 실온에서 1시간 방치시키고 SUNRISE(A5082, Tecan Genios, Grodig, Austria)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
생체에서의 멜라닌 합성은 기질인 tyrosine이 tyrosinase에 의해 quinone과 indolquinone 화합물들의 여러 중간체를 거쳐 멜라닌이 생성된다(28). 에탄올 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접적으로 확인하기 위하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. B16/F10 melanoma 세포에 에탄올 추출물을 각각 1 μg/mL에서 100 μg/mL의 다양한 농도로 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다.
02% EDTA 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리수거하였다. 이 분리수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.02 mL와 동량의 0.4%(w/v) trypan blue를 잘 섞은 다음 hemocytometer에 넣고 광학현미경을 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 살아 있는 세포수를 측정하였다.
적하수오와 백하수오 각각 300 g을 분쇄한 뒤 실온에서 ethanol로 24시간 3회 추출한 다음, 이 추출액을 여지로 여과한 후, 감압농축하고 동결건조 시켜 시료를 얻었다. Tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 각각 1, 10, 100μg/mL이 되도록 녹인 후 세포에 투여하기 전 0.
시료 200 μL에 Folin-Ciacalteu's phenol reagent 200 μL를 넣고 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 2% Na2CO3 용액 200 μL을 가하여 혼합한 후 실온에서 1시간 방치시키고 SUNRISE(A5082, Tecan Genios, Grodig, Austria)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량분석하기 위해 표준물질인 gallic acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하였다. 검량선을 작성한 후 폴리페놀 함량은 시료 mg 중의 mg gallic acid로 나타내었다.
하수오 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Zia 등(16)의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별 추출물 250 μL에 증류수 2.
하수오와 백하수오의 에탄올 추출물이 B16/F10 melanoma 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 에탄올 추출물을 1 μg/mL에서 100 μg/mL까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 배양한 후에 MTT방법으로 세포의 생존율을 관찰한 결과는 Fig. 3과 같다.
희석된 ABTS radical 용액 950 μL에 농도별 시료 50 μL를 가하여 혼합 후 흡광도의 변화를 위해 10분 후에 측정하였으며 표준물질로 ascorbic acid를 동량 첨가하였다.
대상 데이터
B16/F10 melanoma 세포는 CO2 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 10% fetal bovine serum(Sigma Chemical Co.)이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 penicillin streptomycin(Sigma Chemical Co.
10분 후, 반응액의 흡광도 값을 415 nm에서 측정하였다. 표준물질로 naringine(Sigma Chemical Co.)을 사용하였다. 검량선을 작성한 후 시료의 총 플라보노이드 함량은 g 중의 mg naringine로 나타내었다.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 통계 package program(version 18.0, Statistical Package Social Science)을 이용하여 분석하였으며 각 시료에 대하여 평균±표준편차로 나타내었다.
시료간의 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 p＜0.05 수준에서 유의차 검정을 실시하였다.
이론/모형
Tyrosinase 활성도는 Matinez-Esparza(20)의 방법에 의하여 측정하였다. 각 well의 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 만들고, 100 μL의 lysis buffer(1% Triton X-100, 10 mM sodium phosphate, 0.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(15)에 따라 적하수오, 백하수오의 폴리페놀 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 시료 200 μL에 Folin-Ciacalteu's phenol reagent 200 μL를 넣고 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 2% Na2CO3 용액 200 μL을 가하여 혼합한 후 실온에서 1시간 방치시키고 SUNRISE(A5082, Tecan Genios, Grodig, Austria)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
10 μg/mL 농도부터는 하수오의 경우 처리농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성도는 무처리군에 비하여 농도 의존적으로 통계적인 유의성을 얻을 수 있었으나, 백하수오의 경우 농도의존적인 유의성을 얻을 수 없었다.
그 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 하수오와 백하수오 에탄올 추출물의 첨가량이 1.0 μg/mL까지는 각각 90.43±2.6%, 91.33±2.11%로 멜라닌 생성이 대조군인 96.07±1.02%에 비하여 비슷하거나 약간 감소되는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다.
그러나 10 μg/mL 농도에서는 75.9±2.23%, 60.77±3.07%로 나타났으며, 100 μg/mL 농도에서는 42.93±2.26%, 28.37±3.05%로 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 점점 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로도 유의성이 관찰되었다.
멜라닌 생성에 미치는 영향에 대하여 10 μg/mL 농도에서는 각각 75.9±2.23%, 60.77±3.07%로 나타났으며, 100 μg/mL 농도에서는 각각 42.93±2.26%, 28.37±3.05%로 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 점점 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로도 유의성이 관찰되었다.
에탄올 추출물에 의한 세포 생존율은 최고 100 μg/mL 처리 시 하수오와 백하수오 각각에서 93.2±1.95%, 91.07±4.05%로 두 가지 추출물에서 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다.
05%로 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 점점 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로도 유의성이 관찰되었다. 이 결과는 하수오와 백하수오의 에탄올 추출물이 세포에 독성을 미치지 않으며 멜라닌 생성 저해에 효과적인 미백제로서의 가능성을 제시하였다.
05%로 두 가지 추출물에서 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다. 이 결과를 다시 확인하기 위하여 trypan blue 방법으로 에탄올 추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 결과도 MTT 방법의 결과와 마찬가지로 농도가 증가해도 유의할만한 변화를 나타내지 않았다(data not shown). 이상의 결과를 종합해 볼 때 사용한 에탄올 추출물의 농도 범위는 세포증식이나 독성이 없는 것으로 사료된다.
이 결과를 다시 확인하기 위하여 trypan blue 방법으로 에탄올 추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 결과도 MTT 방법의 결과와 마찬가지로 농도가 증가해도 유의할만한 변화를 나타내지 않았다(data not shown). 이상의 결과를 종합해 볼 때 사용한 에탄올 추출물의 농도 범위는 세포증식이나 독성이 없는 것으로 사료된다.
하수오와 백하수오의 각각 농도별에 따른 ABTS radical 소거활성은 하수오 1 mg/mL 농도에서 96.89±0.22%로 나타났으나, 백하수오는 1 mg/mL 농도에서 6.24±0.33%로 하수오에 비하여 소거활성이 낮게 나타났다.
하수오와 백하수오의 총 폴리페놀 함량은 각각 17.31±0.54 mg GA eq/g, 2.75±0.22 mg GA eq/g로 나타났으며, 하수오와 백하수오의 총 플라보노이드 함량은 각각 6.38±0.39 mg naringine eq/g, 1.34±0.09 mg naringine eq/g로 나타나 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 하수오에서 더 높은 것으로 나타났다.
하수오와 백하수오의 총 폴리페놀 함량은 각각 17.31±0.54 mg GA eq/g, 2.75±0.22 mg GA eq/g로 나타났으며, 하수오와 백하수오의 총 플라보노이드 함량은 각각 6.38±0.39 mg naringine eq/g, 1.34±0.09 mg naringine eq/g로 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 백하수오보다 하수오에서 많은 것으로 나타났다.
하수오의 농도별에 따른 ABTS radical 소거활성은 62.5μg/mL 농도에서는 17.45±0.75%, 250 μg/mL 농도에서는 85.17±0.36%, 1 mg/mL 농도에서는 96.89±0.22%로 농도의존적으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
백하수오의 원산지는?
) Hemsl. 등의 덩이뿌리로(1) 한국이 원산지이며, 적하수오는 P okygonum multiflorum Thunberg(마디풀과 P olygonaceae)의 덩이뿌리로서 중국이 원산지이다. 적하수오와 백하수오는 기원식물이 다르고 유기성분계도 적하수오는 anthraquinone 유도체 및 stilbene 유도체로 백하수오와는 전혀 다른 것이다(2,3).
적하수오란?
) Hemsl. 등의 덩이뿌리로(1) 한국이 원산지이며, 적하수오는 P okygonum multiflorum Thunberg(마디풀과 P olygonaceae)의 덩이뿌리로서 중국이 원산지이다. 적하수오와 백하수오는 기원식물이 다르고 유기성분계도 적하수오는 anthraquinone 유도체 및 stilbene 유도체로 백하수오와는 전혀 다른 것이다(2,3).
적하수오와 백하수오에 함유된 성분은 각각 어떠한가?
백하수오의 성분으로는 phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl inositol 등과 steroidal glycoside로써 wilfoside 등과 이들의 aglycone으로 sarcostin, deacylcynanchogenin, deacylmetaplexigenin, hidjoranin, caudatin, penupogenin, wilforinr 등이 있으며 이들의 sugar로써 wilforbiose, d- and l-cymarose 등이 포함되어 있다. 이들의 steroidal glycoside를 cynanchotoxin이라고도 하며, cinnamin acid, cynanchol, benzophenine 등이 포함되어 있다.
적하수오의 성분으로는 anthraquinone 화합물인 emodin, chrysophanol, rhein, physcion 및 이들의 배당체와 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene, 2-ο-β-D-glucopyranoside 및 2''-ο-monogalloyl ester, 3''-monogalloyl ester, 3''-ο-monogalloyl ester 등이 있다(4-8).
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