[논문]분자생물학적 방법인 PCR-REBA를 이용한 대중목욕탕 수질 중 수인성병원성미생물 검출

송운흥; 최승구; 양병선; 이재상

doi:10.5762/kais.2011.12.8.3517

분자생물학적 방법인 PCR-REBA를 이용한 대중목욕탕 수질 중 수인성병원성미생물 검출
Detection of Waterborne Pathogens in Public Bath Houses by PCR-Reverse Blot Hybridization Assay (PCR-REBA) 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.12 no.8, 2011년, pp.3517 - 3522

송운흥 (신흥대학 임상병리과) , 최승구 (신흥대학 임상병리과) , 양병선 (진주보건대학 임상병리과) , 이재상 (동암의학연구소)

초록
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수인성 병원성 미생물에 의한 공중목욕탕의 오염은 질병발생의 원인이 된다. 본 연구에서는 공중목욕탕내에 존재하는 수인성 병원성미생물들을 확인하고자 하였다. 서울지역내의 30 곳 공중목욕탕에서 욕조수 시료를 채수하여 진행하였다. 수인성 병원성미생물의 검출은 0.45 ${\mu}m$의 여과막을 이용하여 전통적인 배양방법으로 분리 및 동정하였다. 분자생물학적 기법을 사용하기 위해 미생물학적인 배양을 하지 않고 핵산을 추출하여 16S rRNA유전자를 표적으로 polymerase chain reaction-reverse blot hybridization (PCR-REBA)을 실시하였다. 미생물학적 배양방법에서는 지표세균인 Escherichia coli와 Shigella spp.가 검출되었으며, 분자생물학적 기법인 PCR-REBA을 수행한 결과 E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp., Mycobacterium spp. 등의 수인성 병원성미생물이 7곳에서 검출되었다. 본 연구결과를 토대로 공중목욕탕의 욕조수내에 수인성병원성미생물에 의한 감염을 줄이기 위해 적절한 위생관리과 E. coli를 포함한 유해미생물을 선정하여 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Contamination of public bath water by waterborne pathogens can cause disease outbreaks and contribute to background rates of disease. The aim of this study is to determine the prevalence of waterborne pathogens in public baths. A total of 30 water samples were collected from 30 different public baths in seoul, Korea. Pathogens in water samples were concentrated by 0.45 ${\mu}m$ nitrocellulose membrane filter, analyzed by both cultivation and polymerase chain reaction-reverse blot hybridization (PCR-REBA) of partial 16S rRNA gene. Various microorganisms including Escherichia coli and Shigella spp. were identified by microbiological cultivation. E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp. and Mycobacterium spp. were identified by PCR-REBA. Our results suggest that appropriate hygiene practice and continuous monitoring is needed for reducing health risk associated with public bath houses.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

결론적으로 환경시료에서 마이코박테리아를 빠르고 정확하게 검출하기 위해 분자생물학적인 검출기법을 이용하여 안전한 목욕조와 목욕원수의 공급과 사용할 권리를 위한 수질기준 항목의 추가설정이 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 대중 목욕탕 물이 NTM에 의해 오염돼 있음을 증명한 것으로, 대중 목욕탕은 많은 사람이 이용하는 중요한 공공장소로서 보다 철저한 물 관리가 필요함을 시사한다. 그리고 목욕탕 물의 NTM 오염원인을 정확하게 규명하기 위하여 목욕탕 물 공급원수의 추가적인 조사가 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 서울시에 위치한 대중목욕탕의 시료에서 분자생물학적 기법인 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 및 역교잡법 (PCR-reverse blot hybridization, PCR-REBA)을 이용하여 지표미생물을 포함한 다양한 종류의 유해미생물을 파악하고 목욕탕 이용자들의 인체에 위해가능성을 파악하고자 하였다.

제안 방법

목욕탕 욕조수내에 수인성 병원성미생물들은 분자생물학적 기법인 PCR-REBA waterborne ID® kit (M&D, Wonju, Korea)를 사용하여 확인하였다. DNA의 추출을 위하여 미생물학적인 배양을 하지 않고 시료를 막여과법으로 농축하였다. 시료를 통과시킨 여과지를 15㎖ conical tube에 넣고 phosphate buffered saline (PBS) 2 ㎖을 첨가한 후 vortex를 사용하여 부유하고 4000 × g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
kit의 제조사 술식에 따라 DNA를 분리하여 5㎕를 PCR template로 사용하고 제조사의 PCR 조건에 따라 시행하였다 (GeneAmp PCR®System2700). PCR 증폭산물은 2% TBE agarose gel로 전기영동하여 EtBr (0.5 ㎍/㎖)로 염색하여 UV transilluminator에서 반응산물을 확인하였다.
REBA를 위한 표적 DNA는 biotin을 표지한 primer를 사용하여 증폭하였다.
kit의 제조사 술식에 따라 DNA를 분리하여 5㎕를 PCR template로 사용하고 제조사의 PCR 조건에 따라 시행하였다 (GeneAmp PCR®System2700).
5) 1㎖씩 분주하고 dancer로 1분씩 1회 반복한다. 결합된 DNA에 표지된 biotin label를 검출하기 위해 NBT/BCIP staining solution 을 사용하여 발색반응을 수행하여 결과를 판독하였다.
)에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 단일 집락들을 확인하기 위해 6주 동안 매주 1회씩 관찰하여 확인하였다[11].
본 연구에서는 유해미생물의 검출을 전통적인 배양방법에 의존하지 않고 막여과법으로 농축한 후 PCR-REBA waterborne ID® kit (M&D, Wonju, Korea)를 이용하여 마이코박테리아를 포함한 4종의 수인성 병원성 미생물들을 확인하였다.
수인성 병원균을 검출하기 위해 PCR 증폭산물을 이용하여 PCR-REBA를 수행하였다. 16S rRNA primer로 증폭된 PCR 증폭산물이 모두 결합할 수 있는 positive control에 결합된 것을 확인하여 REBA의 성공적인 유무를 확인하였다.
시료 속에 존재하는 다양한 수인성 병원성미생물을 모두 증폭할 수 있도록 16S rRNA 유전자 부위 중 모든 세균의 동정에 사용될 수 있는 특정 부위를 대상으로 PCR amplification을 실시하였다. 그 결과 30곳 시료에서 모두 예상되는 PCR 증폭산물의 크기를 확인할 수 있었다.
총 30곳의 목욕탕에서 채수한 시료는 배양 및 분자생물학적 기법에 사용하기 위해 0.45 ㎛ pore size (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, U.S.A.)를 사용한 막여과법을 이용하여 미생물을 농축하였다. 농축된 여과지의 유해미생물을 배양하기 위해 고시된 선택배지들을 사용하였다.

대상 데이터

)를 사용한 막여과법을 이용하여 미생물을 농축하였다. 농축된 여과지의 유해미생물을 배양하기 위해 고시된 선택배지들을 사용하였다. 또한 마이코박테리아는 일반적인 다른 세균이나 곰팡이에 의해 성장 방해를 막기 위하여 탈오염과정 (decontamination step)을 실시하고 선택배지인 L-J 배지 (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, U.
본 연구는 2009년 10월 중순부터 11월 초순까지 서울시 강북구에 목욕업소로 등록된 목욕탕내의 수인성 병원성미생물의 유무 확인을 위해 고시된 방법에 따라 각각 1ℓ을 채수하였다[10]. 목욕탕의 종류는 소규모 목욕탕과 찜질방을 포함하여 총 30곳의 목욕탕에서 시료 채수 후, 4℃에서 냉장 보관하여 수송하였고 24시간 이내에 실험을 진행하였다.
본 연구는 2009년 10월 중순부터 11월 초순까지 서울시 강북구에 목욕업소로 등록된 목욕탕내의 수인성 병원성미생물의 유무 확인을 위해 고시된 방법에 따라 각각 1ℓ을 채수하였다[10]. 목욕탕의 종류는 소규모 목욕탕과 찜질방을 포함하여 총 30곳의 목욕탕에서 시료 채수 후, 4℃에서 냉장 보관하여 수송하였고 24시간 이내에 실험을 진행하였다.

이론/모형

목욕탕 욕조수내에 수인성 병원성미생물들은 분자생물학적 기법인 PCR-REBA waterborne ID® kit (M&D, Wonju, Korea)를 사용하여 확인하였다.

성능/효과

수인성 병원균을 검출하기 위해 PCR 증폭산물을 이용하여 PCR-REBA를 수행하였다. 16S rRNA primer로 증폭된 PCR 증폭산물이 모두 결합할 수 있는 positive control에 결합된 것을 확인하여 REBA의 성공적인 유무를 확인하였다. 총 30 곳의 시료 중 10곳의 시료에서 Pseudomonas aeruginosa, E.
시료 속에 존재하는 다양한 수인성 병원성미생물을 모두 증폭할 수 있도록 16S rRNA 유전자 부위 중 모든 세균의 동정에 사용될 수 있는 특정 부위를 대상으로 PCR amplification을 실시하였다. 그 결과 30곳 시료에서 모두 예상되는 PCR 증폭산물의 크기를 확인할 수 있었다.
의 수인성 미생물의 존재를 확인할 수 있었다. 나머지 곳들의 시료에서는 gram negative, positive control에서 결함된 것으로 보아 미생물의 존재는 확인되었으나 kit에 포함된 수인성 병원성 미생물이 존재하지는 않는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 각 세균의 특징적인 유전자 정보를 기초로 하는 분자 진단학적 동정법을 이용하여 수도권 내에 위치한 대중목욕탕 중 30% 이상에서 병원성 미생물이 존재한다는 것을 확인하였다. 동정된 세균들 중 Pseudomonas aeruginosa는 일명 녹농균이라 부르며 사람에게는 오염된 물을 통하여 상처에 감염되거나 병원 등에서 환자의 호흡기나 눈에 감염하여 병원감염성 폐렴의 주원인으로 알려져 있어 수영장이나 병원 등에서 녹농균은 주요 감시대상이 되고 있다[3].

후속연구

결론적으로 환경시료에서 마이코박테리아를 빠르고 정확하게 검출하기 위해 분자생물학적인 검출기법을 이용하여 안전한 목욕조와 목욕원수의 공급과 사용할 권리를 위한 수질기준 항목의 추가설정이 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 대중 목욕탕 물이 NTM에 의해 오염돼 있음을 증명한 것으로, 대중 목욕탕은 많은 사람이 이용하는 중요한 공공장소로서 보다 철저한 물 관리가 필요함을 시사한다.
본 연구에서는 대중 목욕탕 물이 NTM에 의해 오염돼 있음을 증명한 것으로, 대중 목욕탕은 많은 사람이 이용하는 중요한 공공장소로서 보다 철저한 물 관리가 필요함을 시사한다. 그리고 목욕탕 물의 NTM 오염원인을 정확하게 규명하기 위하여 목욕탕 물 공급원수의 추가적인 조사가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	공중목욕탕에서의 무엇에 의한 오염이 질병발생의 원인이 되는가?	수인성 병원성 미생물에 의한 공중목욕탕의 오염은 질병발생의 원인이 된다. 본 연구에서는 공중목욕탕내에 존재하는 수인성 병원성미생물들을 확인하고자 하였다.
	비결핵성 마이코박테리아는 토양, 음식, 에어로졸을 포함하는 모든 자연 생태계에 공통적인 부생 생물인데, 그 특징은 무엇인가?	비결핵성 마이코박테리아는 토양, 음식, 에어로졸을 포함하는 모든 자연 생태계에 공통적인 부생 생물 (saprophyte)이다[5-8]. NTM은 지표수, 지하수를 포함한 광범위한 수계에 분포하며, 마이코박테리아의 세포벽은 두꺼운 지방질로 구성되어 있고 소수성 표면을 가지고 있어서 여러 화학 소독제에 대하여 높은 저항성을 나타내고 넓은 범위의 pH와 온도에서 견딜 수 있어 오랜 기간 동안 살아남을 수 있다[7-9].
	수인성 병원성 미생물은 엄밀한 개념으로 무엇을 말하는 것인가?	대중이 많이 이용하는 공중이용시설에서는 오염도에 따라 전염병 등의 질병 발생 가능성이 있어, 병원성세균의 존재 등 위생 상태 파악에 대한 위험성을 알리는 연구들이 이루어지고 있다[2]. 수인성 병원성 미생물 (waterborne pathogens)은 엄밀한 개념으로 오염된 물을 마시거나 오염된 물로 씻은 음식물의 섭취를 통하여 감염되어 장 관계 질병을 일으킬 가능성을 갖는 미생물을 말한다. 또한 감염의 매개체로서 물에 의하여 감염되어 발생하는 전염병을 수인성 전염병으로 총칭한다.

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원문보기 상세보기
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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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