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문제 정의
- 본 연구에서는 탁도와 지표 미생물의 검출 및 바이러스의 검출 관계에 대해서도 알아보았다. 탁도는 콜로이드 입자와 대단히 미세한 입자에 의해 생겨나는 것으로, 본 연구 대상 시료의 탁도 범위는 최저 0.
- 이에 본 연구에서는 2003년 7월부터 2006년 1월까지 한국수자원공사 관할 정수장 중 일 정수량 5만 톤급 이상인 26개 정수장에서 사용하는 24지점의 취수 원수, 총 192건을 대상으로 총 대장균군 및 분원성 대장균이 수인성 장관계 바이러스의 지표 미생물로서 적합한가에 대하여 연구하였다.
제안 방법
- 90분간 접종 후 배지 10mL을 세포배양용기에 넣고 14일간 바이러스성 세포병변효과를 현미경으로 관찰하며 배양하였다. 1차와 2차 배양에서 모두 세포병변효과가 나타난 시료를 양성으로 판정하였고, 2차 배양에 서만 세포병변효과가 나타난 경우 음성대조군과 함께 3차 배양을 수행하여 2, 3차에서 모두 세포병변효과가 관찰된 시료를 양성으로 판정하였다. 최종 바이러스의 정 량은 미 환경 보호청 (United States Environmental Protection Agency, U.
- 시 료는 제 1 분할시 료와제 2분할시료로 나누어 두 차례 접종하였으며 , 세포는 계대배양 후 3~4일이 지난 것을 사용하였다. 90분간 접종 후 배지 10mL을 세포배양용기에 넣고 14일간 바이러스성 세포병변효과를 현미경으로 관찰하며 배양하였다. 1차와 2차 배양에서 모두 세포병변효과가 나타난 시료를 양성으로 판정하였고, 2차 배양에 서만 세포병변효과가 나타난 경우 음성대조군과 함께 3차 배양을 수행하여 2, 3차에서 모두 세포병변효과가 관찰된 시료를 양성으로 판정하였다.
- 바이러스의 채수는 정수처리에 관한 기준(환경부, 2002)에 명시된 방법에 의거하여, 200L의 원수를 1- MDS 양전하 필터 (CUNO, 미국)를 사용하여 채수하였다. 시료 채수시 수압이 2.
- 여부에 영향을 줄 수 있다. 수온과 탁도는 물에 존재하는 미생물에 많은 영향을 끼치는 환경 요인으로, 이들과 총 대장균군 및 분원성 대장균군, 그리고 수인성 장관계 바이러스와의 관계에 대해 알아보았다. 본 연구에서 검출된 미생물의 양이 최저값과 최고값 사이에 심한 차이를 보였으므로, 일부 낮고 높은 수치의 영향을 줄이고, 수온과 탁도와의 분석을 용이하게 하기 위해 평균값을 분석하였으며, 미생물분포차는 표준편차로 표현하였다.
- 15M 인산나트륨용액을 접종하였으며, 양성 대조군으로 폴리오바이러스 3형, 20 plaque forming units를 접 종하였다. 시 료는 제 1 분할시 료와제 2분할시료로 나누어 두 차례 접종하였으며 , 세포는 계대배양 후 3~4일이 지난 것을 사용하였다. 90분간 접종 후 배지 10mL을 세포배양용기에 넣고 14일간 바이러스성 세포병변효과를 현미경으로 관찰하며 배양하였다.
- 시료 채수시 수압이 2.11 X 10+Pa을 넘지 않도록 조절하였으며, 원수의 pH가 8.0 이상일 경우 0.1MHC1 로 pH가 6.5~7.5가 되도록 조절한 후 채수하였고, 최대 유량이 분당 1L4L가 넘지 않도록 조절하였다.
- 접종하였다. 음성 대조군으로 접종량에 해당되는 만큼의 0.15M 인산나트륨용액을 접종하였으며, 양성 대조군으로 폴리오바이러스 3형, 20 plaque forming units를 접 종하였다. 시 료는 제 1 분할시 료와제 2분할시료로 나누어 두 차례 접종하였으며 , 세포는 계대배양 후 3~4일이 지난 것을 사용하였다.
- 적정량을 희석한 원수 100mL를 멸균된 여과장치 (Millipore, 미국)를 이용하여 공극 0.45㎛, 지름 47 mm의 멸균된 여과막(Advantec MFS, Inc., 일본)을통해 여과한 후, 이것을 Difco m Endo agar LES (Becton, Dickinson and company) 배지 , 35 ± 0.5℃ 조건에서 24 ±2시간 배양하였다. 암적색의 금속광택을 띠는 집락(colony)의 수가 20-80 범위에 드는 것을 계수하여 100mL 중 총 대장균군 집락수(CFU/NO mL)로 나타내었다.
대상 데이터
- 바이 러스를 탈리하고 농축하기 위해 멸균한 1, 000 mL의 1.5% 소고기 엑스(beefextract, pH 9.5, 0.375% glycerin, Becton, Dickinson and Company, 미 국) 용액을 사용하였다. 소고기 엑스 용액에 압력을 가하여 채수한 필터가 들어있는 카트리지 하우징으로 흘러가도록 하였다.
- 바이러스의 검출을 위해 수인성 장관계 바이러스에 감수성 이 좋은 원숭이 신장세 포(Buffalo green monkey kidney cells, BGMK cells: 국립 환경 과학원 분양) 를 사용하였고, 5% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, 미국) 이 함유된 MEM/L-15 배지 (Gibco BRL) 에서 , 온도 36.5 ± 0.5℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 세포병변효과에 대한 양성 대조군으로 국립환경과학원에서 분양받은 약독화 폴리오바이러스 3형 (poliovirus type 3)을 사용하였다.
- 5℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 세포병변효과에 대한 양성 대조군으로 국립환경과학원에서 분양받은 약독화 폴리오바이러스 3형 (poliovirus type 3)을 사용하였다.
데이터처리
- 수온과 탁도는 물에 존재하는 미생물에 많은 영향을 끼치는 환경 요인으로, 이들과 총 대장균군 및 분원성 대장균군, 그리고 수인성 장관계 바이러스와의 관계에 대해 알아보았다. 본 연구에서 검출된 미생물의 양이 최저값과 최고값 사이에 심한 차이를 보였으므로, 일부 낮고 높은 수치의 영향을 줄이고, 수온과 탁도와의 분석을 용이하게 하기 위해 평균값을 분석하였으며, 미생물분포차는 표준편차로 표현하였다. Fig.
- 이는 정 등(2002)이 발표한 결과와 유사한 결과로, 총 대장균이나 분원성 대장균군이 높은 수온에 의해 증식을 하게 되어 수온이 낮았을 때보다 높게 검출된 것으로 사료된다. 지표 미생물과 수온 사이에 통계적으로 의미가 있는 상관관계에 있는지를 알아보기 위해 Pearson 상관분석 및 회귀분석을 SPSS (SPSS version 12.0)를 이용하여 실시하였다. Table 1 에서 보는 바와 같이 총 대장균군과 분원성 대장균군 모두 수온과 양의 상관관계에 있었으며 (총 대장균군, R ==0.
이론/모형
- 1차와 2차 배양에서 모두 세포병변효과가 나타난 시료를 양성으로 판정하였고, 2차 배양에 서만 세포병변효과가 나타난 경우 음성대조군과 함께 3차 배양을 수행하여 2, 3차에서 모두 세포병변효과가 관찰된 시료를 양성으로 판정하였다. 최종 바이러스의 정 량은 미 환경 보호청 (United States Environmental Protection Agency, U.S. EP A) 에서 제공하는 최적 확수 (most probable numbers, MPN) 계수 소프트웨 어 를이용하였다.
- 환경부의 정수처리에 관한 기준(2002)에 따라 바이러스 접종량을 계산하였고, 이에 해당하는 양의 바이 러스 농축액을 T25 세포배양용기 (Nalge Nunc, 미국)에 접종하였다. 음성 대조군으로 접종량에 해당되는 만큼의 0.
성능/효과
- 1. 총 시료 192건 중 63건(32.8%)의 시료에서 수인성 장관계 바이러스가 검출되었으며, 검출범위는 0~240MPN/100L, 평균 3.18MPN/100L였다. 총 대장균군은 O~5.
- 2. 탁도와 수온과의 상관관계를 살펴본 결과, 총대장균군과 분원성 대장균군 모두 탁도와 양의 상관관계에 있었으나 수인성 장관계 바이러스는 총 대장균군이나 분원성 대장균군과 달리 탁도나 수온과 상관관계를 보이지 않았다.
- 3. 총 대장균군 및 분원성 대장균군 검출 농도와 수인성 장관계 바이러스의 검출 농도와 상관관계를 알아본 결과, 총 대장균군은 수인성 장관계 바이러스와 상관관계가 없었으며, 분원성 대장균군은 통계적으로 약한 상관관계가 있었다.
- 4. 한국내 지표수 26지점, 192건의 시료를 대상으로 한 연구에서 총 대장균과 분원성 대장균군이 수인성 장관계 바이러스에 대한 지표 미생물로서 부적합하다는 결론을 얻었다. 그러나 분원성 대장균군의 경우 상수 원수에 대한 바이러스 모니터링 지점이나 대상 지역을 판단하기 위한 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 검출된 미생물의 양이 최저값과 최고값 사이에 심한 차이를 보였으므로, 일부 낮고 높은 수치의 영향을 줄이고, 수온과 탁도와의 분석을 용이하게 하기 위해 평균값을 분석하였으며, 미생물분포차는 표준편차로 표현하였다. Fig. 1a에서 보는 바와 같이 총 대장균군이나 분원성 대장균군의 검출 양은 수온과 유사한 양상으로 증감함을 관찰할 수 있었다. 특히 수온이 높았던 7~9월의 경우 총 대장균군이 3.
- 0)를 이용하여 실시하였다. Table 1 에서 보는 바와 같이 총 대장균군과 분원성 대장균군 모두 수온과 양의 상관관계에 있었으며 (총 대장균군, R ==0.569, p = 0.054; 분원성 대장균군, R = 0.666, p = 0.018), 회귀분석에 의한 기여율(R2) 역시 각각 0.324와 0.444로 두 미생물이 수온과 양의 상관관계에 있음을 알 수 있었다. 수인성 장관계 바이러스와 수온과의 관계를 살펴본 결과, Fig.
- 힌.국 수계를 대상으로 한본 연구 결과에서도 총 대장균군 및 분원성 대장균군이 수인성 장관계 바이러스의 지표 미생물로서 부적합하다는 결론을 얻었다. 최근 분자생물학적 기술이 발달함에 따라 중합효소연쇄 반응법 (polymerase chain reaction, PCR), Real-Time PCR, nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) 분석 , DNA microarray 등 다양한 바이러스 검출법이 보고되었다 (Fuhrman et al.
- 넷짜I , 소독제나 환경요인에 의해 영향을 받거나 내성을 갖는 등 특성이 유사하여야 한다. 다섯째, 지표 미생물은 비병원성이어야 하고, 쉽게 정량할 수 있어야 한다. 여섯째, 지표 미생물만을 검출해 낼 수 있는 방법이 있어야 하고, 위양성 반응이 없거나 적은 방법이어야 한다.
- 첫째, 지표 미생물이 존재 할 때 예측하고자 하는 병원성 미 생물이 존재해야 하고, 지표 미생물이 존재하지 않을 경우 병원성 미생물 역시 존재하지 않아야 한다. 둘째, 지표 미생물과 예측하고자 하는 병원성 미생물의 성장 특성은 동일한 환경 조건하에서 유사하여야 한다. 셋째 , 지표 미생물과 예측하고자 하는 미생물의 검출되는 양 사이에 일정한 비율이 있어야 하며 , 이는 통계적으로 유의하여야 한다.
- 따라서 총 대장균군과 분원성 대장균군의 경우 수온과 탁도와 양의 상관관계에 있었으나, 바이러스가 이들과 달리 수온과 탁도와 뚜렷한 상관관계를 보이지 않았으므로, 이들이 수인성 장관계 바이러스에 대한 지표 미생물로 사용되기에 부적합하다고 판단되었다.
- 3). 상관분석과 회귀분석을 실시한 결과, 총 대장균군은 수인성 장관계 바이 러스와 약한 양의 상관관계에 있었으나 통계적으로 의미가 없었고 (R=0.242, R2= 0.0'59, p = 0.448), 분원성 대장균군의 경우 비교적 양의 상관관계에 있었으나 통계적으로 의미가 약했다(R=0.537, R2 = 0.289, p = 0.072). 총 대장균군과 분원성 대장균군 모두 수인성 장관계 바이러스와 통계적으로 의미있는 상관관계가 없었으므로, 이들이 수인성 장관계 바이러스에 대한 지표 미생물로서는 부적합하다고 판단되었다.
- 둘째, 지표 미생물과 예측하고자 하는 병원성 미생물의 성장 특성은 동일한 환경 조건하에서 유사하여야 한다. 셋째 , 지표 미생물과 예측하고자 하는 미생물의 검출되는 양 사이에 일정한 비율이 있어야 하며 , 이는 통계적으로 유의하여야 한다. 넷짜I , 소독제나 환경요인에 의해 영향을 받거나 내성을 갖는 등 특성이 유사하여야 한다.
- 수인성 장관계 바이러스는 총 시료 192건 중 63건 (32.8%)의 시료에서 검출되었고, 검출범위는0~240 MPN/100L, 평균 3.18MPN/100L였다. 총대장균군은 0-5.
- 444로 두 미생물이 수온과 양의 상관관계에 있음을 알 수 있었다. 수인성 장관계 바이러스와 수온과의 관계를 살펴본 결과, Fig. 1b에서 보는 바와 같이 겨울철 온도가 낮았을 경우 바이러스가 많이 검출된 경우를 제외하고 온도와 상관관계가 있는 것처럼 관찰되었으나, 통계적으로는 의미가 없었다 (R=0.041, R2 = 0.002, p = 0.900). 이는 한국의 경우 바이러스가 수온이 낮을 경우 많이 검출된다는 점과 수온이 높은 7~9월이 계절상 우기에 해당하므로, 탁도가 증가함에 따라 바이러스가 다량 검출되었던 것 에 의한 결과라고 판단된다.
- 다섯째, 지표 미생물은 비병원성이어야 하고, 쉽게 정량할 수 있어야 한다. 여섯째, 지표 미생물만을 검출해 낼 수 있는 방법이 있어야 하고, 위양성 반응이 없거나 적은 방법이어야 한다. 현재까지 수인성 장관계 바이러스 등 분원성 미생물의 오염에 대한 지표 미생물로 총 대장균군, 분원성 대장균군, 분원성 연쇄상구균, bacteriophages, coliphages 등이 연구되 어 왔으나.
- 218). 이상의 결과로 총 대장균군과 분원성 대장균군은.탁도와 밀접한 양의 상관관계에 있고, 수인성 장관계 바이러스는 상관관계가 없음을 알 수 있었다.
- 이상적인 지표 미생물이란 다음과 같은 조건을 충족시켜야 한다<Goyal, 1983). 첫째, 지표 미생물이 존재 할 때 예측하고자 하는 병원성 미 생물이 존재해야 하고, 지표 미생물이 존재하지 않을 경우 병원성 미생물 역시 존재하지 않아야 한다. 둘째, 지표 미생물과 예측하고자 하는 병원성 미생물의 성장 특성은 동일한 환경 조건하에서 유사하여야 한다.
- 072). 총 대장균군과 분원성 대장균군 모두 수인성 장관계 바이러스와 통계적으로 의미있는 상관관계가 없었으므로, 이들이 수인성 장관계 바이러스에 대한 지표 미생물로서는 부적합하다고 판단되었다. 다른 연구자들도 총 대장균군, 분원성 대장균군, 분원성 연쇄상구균, bacteriophages, coliphages 등이 수인성 장관계 바이러스 등 분원성 미생물의 오염지표로서 적합한지에 대해 연구하여 왔으나, 이러한 지표 미생물들이 실제로 병원성 미생물의 존재를 간접적으로 나타내는지에 대해 부정적 연구결과들이 발표되었으며 (Steder, 1984, Gantzer et al.
- 총 대장균군과 분원성 대장균군의 검출이 수인 성장 관계 바이러스의 검출과 직접적인 상관관계에 있는지 알아본 결과, 수온이 낮았던 11~1월을 제외하고 총 대장균군과 분원성 대장균군 모두 수인성 장관계 바이러스와 유사한 양상으로 검출되고 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 3). 상관분석과 회귀분석을 실시한 결과, 총 대장균군은 수인성 장관계 바이 러스와 약한 양의 상관관계에 있었으나 통계적으로 의미가 없었고 (R=0.
- 9%)에 비해 비교적 낮게 검출되었으나, 이는 조사 대상 지역의 차이에서 비롯된 것으로 사료된다. 총 대장균군과 분원성 대장균군의 경우도 기존에 보고된 연구 결과와 유사하거나 일부 차이가 있는 것으로 나타났다. 한강 수계를 대상으로 한 이 등(2005) 의 경우 총 대장균군과 분원성 대장균군의 검출농도가 연도별로 차이가 있었으며 (총 대장균군의 2000년 기하평균 3.
- 18MPN/100L였다. 총 대장균군은 O~5.3 X 104CFU/100mL, 분원성 대장균군은 0~5.0 X HPcFU/lOOmL의 범위에서 검출되었다.
- OONTU였다. 탁도가 높았던 7~9 월 사이 총 대장균군과 분원성 대장균군, 그리고 수인성 장관계 바이러스 모두 탁도와 밀접한 관계가 있음을 관찰할 수 있었으나(Fig. 2 ), 바이러스의 경우 탁도가 낮은 겨울철에도 많은 양이 검출되어 지표 미생물과는 다른 양상을 보였다((Fig.2b). 미 환경보호청에 따르면 온대성 기후 지역은 수인성 장관계 바이러스의 검출이 늦여름에서 초가을에 최대치를 나타낸다고 하였다.
- 이상의 결과로 총 대장균군과 분원성 대장균군은.탁도와 밀접한 양의 상관관계에 있고, 수인성 장관계 바이러스는 상관관계가 없음을 알 수 있었다.
- 이는 수인성 장관계 바이러스의 검출 빈도를 분석해 본 경우에도 관찰되었던 양상으로 탁도가 높았을 경우 바이 러스의 검출빈도가 높았으나, 온도가 낮은 겨울철에도 역시 바이러스가 높은 빈도로 검출되고 있음을 관찰할 수 있었다(data not shown). 통계적인 상관관계를 알아보기 위해 Pearson 상관분석 및 회귀분석을 실시한 결과(Table 1), 총 대장균군과 분원성 대장균의 경우 탁도와 매우 밀접한 상관 관계를 보였으나(총 대장균군, R=0.948, R2 = 0.899,p = 0.000; 분원성 대장균군. R=0.679, R2 = 0.462, p = 0.015), 수인성 장관계 바이러스의 경우 비교적 약한 양의 상관관계를 보였으며, 통계적으로 의미가 없었다(R=0.170, R2 = 0.029, p = 0.218). 이상의 결과로 총 대장균군과 분원성 대장균군은.
- 1a에서 보는 바와 같이 총 대장균군이나 분원성 대장균군의 검출 양은 수온과 유사한 양상으로 증감함을 관찰할 수 있었다. 특히 수온이 높았던 7~9월의 경우 총 대장균군이 3.03 X lO'CFU/lOOmL로 비교적 많이 검출되었으며, 분원성 대장균군도 5.09 X lecFU/IOOmL로수온이 낮을 경우에 비해 비교적 높게 검출되었다 (Fig. la). 이는 정 등(2002)이 발표한 결과와 유사한 결과로, 총 대장균이나 분원성 대장균군이 높은 수온에 의해 증식을 하게 되어 수온이 낮았을 때보다 높게 검출된 것으로 사료된다.
후속연구
- , 2005), 이를 대체할 수 있는 enterococci, bacteriophage, F-specific RNA coliphages, 또는 coliphages 등 다양한 지표 미생물에 대한 연구가 진행되 었다(Steder, 1984, Horman etal, 2004). 그러 나 지표 미생물과 대상 미생물과의 관계는 기후, 지리적으로 매우 독특한 특성을 보이므로, 많은 시료와 다양한 지역을 대상으로 한 대대적인 연구가 필요하다.
- 한국내 지표수 26지점, 192건의 시료를 대상으로 한 연구에서 총 대장균과 분원성 대장균군이 수인성 장관계 바이러스에 대한 지표 미생물로서 부적합하다는 결론을 얻었다. 그러나 분원성 대장균군의 경우 상수 원수에 대한 바이러스 모니터링 지점이나 대상 지역을 판단하기 위한 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. .
- , 2004), 이에 대해 많은 논란이 있었다(Hejkaletal, 1981, Grabow, 1996). 그러나 분원성 대장균군의 경우 통계적 의미가 비록 약하긴 했지만 수인성 장관계 바이러스의 검출농도와 양의 상관관계 (R = 0.537)를 보였으므로(Table 1), 상수 원수에 대한 바이러스 모니터링 시점이나 조사대상 지역을 판단할 때 현재까지 축적된 분원성 대장균군의 결과를 참고 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- , 2005). 그러므로 다양한 지표 미생물을 이용하여 수인성 장관계 바이러스의 오염을 예측하기 위한 연구 못지않게, 낮은 농도로 존재하는 수인성 바이러스를 보다 빠르고 민감하면서도 간편하게 검출할 수 있는 방법에 대한 연구도 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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