[논문]여정실 물 분획물이 인체 진피 섬유아세포의 증식에 미치는 영향

임난영; 김대성; 고경숙; 문연자; 우원홍

여정실 물 분획물이 인체 진피 섬유아세포의 증식에 미치는 영향
Effect of Fructus Ligustri Lucidi $H_2O$ Extract on Cell Proliferation in Hman Dermal Fibroblast 원문보기

경락경혈학회지= Korean journal of acupuncture, v.28 no.3, 2011년, pp.43 - 51

임난영 (원광대학교 뷰티디자인학과) , 김대성 (원광대학교 한의학전문대학원 한약자원개발학과) , 고경숙 (원광대학교 뷰티디자인학과) , 문연자 (원광대학교 한의과대학 해부학교실) , 우원홍 (원광대학교 한의과대학 해부학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : In this study, we investigated the effect of Fructus Ligustri Lucidi $H_2O$ fraction (FLLW) on cell proliferation, and the phosphorylation of ERKs and Akt in human dermal fibroblast neonatal (HDFn). Methods : After treatment of HDFn with FLLW, MTT assay was performed to quantitatively determine cellular viability. The ERK and Akt pathways were analyzed in vitro by Western blot in a HDFn. HDFn proliferation after FLLW and minoxidil treatment in the absence or presence of PD98059, a MEK inhibitor, LY294002, and a PI3K inhibitor, was examined by Western blot or MTT assay. Results : FLLW increased cell proliferation in a dose-dependent manner and minoxidil used as positive control also induced cell proliferation in HDFn. FLLW increased the phosphorylation of ERK and Akt. In addition, minoxidil, too, induced the phosphorylation of ERK and Akt in HDFn. PD98059 and LY294002 significantly attenuated FLLW-inducible p-ERK and p-Akt expression and proliferation in cultured HDFn. Conclusions : Our results suggest that FLLW stimulates the growth of fibroblast cells through ERK and Akt pathways. Therefore, FLLW is a potential agent for the inducer of fibroblast growth.

주제어

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문제 정의

또한 성장인자와 cytokine은 PI3K 경로를 통하여 Akt 활성을 자극하고, Akt는 세포 자멸사를 억제한다²¹⁾. 본 연구에서는 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물이 섬유아세포에서 Akt 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 실험 결과 여정자 H₂O 분획물 10 ㎍/㎖와 25 ㎍/㎖에서 대조군에 비하여 Akt 인산화가 2.
본 연구에서는 섬유아세포에 여정실 H₂O 분획물과 미녹시딜을 처리한 후 ERK 인산화가 증가하는지 확인 하였다. 실험 결과 여정자 H₂O 분획물 10 ㎍/㎖와 25 ㎍/㎖에서 대조군에 비하여 2.
본 연구에서는 여정실 H₂O 분획물과 미녹시딜을 인체 진피 섬유아세포에 처리하였을 때 세포증식에 미치는 영향과 ERK 및 Akt의 인산화에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
따라서 부작용이 적고 탈모를 개선시킬 수 있는 천연 약재에 대한 관심이 늘어나고 있는 실정이다. 본 연구에서는 여정실의 H₂O 분획물과 미녹시딜이 섬유아세포의 증식 및 신호전달 기전에 미치는 영향을 조사하였으며, 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

가설 설정

최근 보고에서 미녹시딜 1 uM을 human hair follicle culture model에 처리하였을 때 모발의 성장을 유도하였다고 하였다¹⁴⁾. 모유두 세포는 섬유아세포로부터 특수하게 분화된 세포이기 때문에 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물은 진피의 섬유아세포에서도 세포증식을 유도할 것이라고 가정하였다. 여정실 H₂O 분획물과 미녹시딜이 섬유아세포의 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 미녹시딜 0.
이러한 모유두세포의 증식에 관여하는 것으로 알려진 미녹시딜(minoxidil; 2,4-diamino-6-piperidinopyrimidine-3-oxide)은 피리미딘(pyrimidine) 유도체로서 1개월 이상 복용 시 전신적인 다모증 발생⁸⁾, 남성형 탈모증에서 모발의 재성장⁹⁾ 등의 효능이 보고되어 탈모 개선에 많이 사용되고 있다¹⁰⁾. 이와 같이 미녹시딜은 모유두세포의 증식과 탈모개선 효과가 있는 것으로 보고되어져 있는데, 모유두세포는 섬유아세포로부터 유래되었다고 볼 수 있으므로 섬유아세포의 증식에도 영향을 미칠 것이라고 가정하고 본 실험에 사용하였다.

제안 방법

1, 1 μM을 처리하여 2일, 3일, 4일 배양하였으며, 대조군에는 dimethylsulfoxide(DMSO)를 처리 하였다. 0.05% MTT 용액을 넣어 3시간, 37℃에서 배양한 다음 상층액을 제거하고 formazan 침전물에 1 ㎖의 DMSO를 가하여 15분간 실온에서 녹인 후 96well plate에 200 ㎕씩 분주하여 570 nm의 파장에서 ELASA reader로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.
24 well plate에 섬유아세포를 0.2×104 cell/㎖, 0.4×104 cell/㎖, 0.6×104 cell/㎖로 200 ㎕씩 분주하여 24시간 배양 한 후 여정실 H20 분획물 5, 10, 25 ㎍/㎖과 미녹시딜 0.1, 1 μM을 처리하여 2일, 3일, 4일 배양하였으며, 대조군에는 dimethylsulfoxide(DMSO)를 처리 하였다.
실험에 사용된 여정실(Fructus Ligustri Lucidi)은 제주도에서 생산된 자연산을 제천약초를 통해 구입하여 사용하였다. 건조시료 중량의 10배의 메탄올을 가하여 추출하였고, 각 용매별 분획은 메탄올 추출물에 증류수 0.7 L를 첨가하고 증류수와 같은 양의 헥산을 더해 용출되도록 방치한 후 용매층을 감압농축하고 동결건조 하여 헥산 분획물을 얻었다. 남은 수용액에 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(n-butanol)을 넣고 동일한 방법으로 추출하였으며, 본 실험에 사용된 여정실 H₂0 분획물은 부탄올 추출물을 얻고 난 나머지를 감압 농축 후 동결 건조 후 -20 ℃에 보관하여 사용하였다.
단백질은 Bio-Rad Protein Assay 시약을 이용하여 정량하였고, 30 ㎍ 단백질과 2×sample buffer(1 ㎖ glycerol, 0.5 ㎖ β- mercaptoethanol, 3 ㎖ 10% SDS, 1.25 ㎖ 1 M Tris-HCl, 1～2 ㎍ bromophenol blue)를 동량으로 혼합한 후 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다.
섬유아세포(0.8×104cell/㎖)를 10 ㎝배양용기에 하루 동안 배양한 뒤 serum-free media로 교체하고 1일 배양한 후 여정자 H2O 분획물 10, 25 ㎍/㎖와 미녹시딜을 0.1 μM을 처리하였다.
여정실 H2O 분획물과 미녹시딜이 섬유아세포의 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 미녹시딜 0.1, 1 μM과 여정실 H2O 분획물 5, 10, 25 ㎍/㎖로 각각 처리하여 2일, 3일, 4일간 배양하였다.
이러한 결과가 섬유아세포의 증식과 연관이 있는지 알아보기 위하여 PD98059와 LY294002를 1시간 전처리 후 미녹시딜과 여정자 H2O 분획물을 처리하고 72시간 배양하여 MTT assay를 시행하였다.

대상 데이터

PVDF membrane으로 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 하였다. 1차 항체는 anti-p-Akt, antitotal Akt, anti-p-ERK, anti-total ERK를 사용하였다.
FBS와 DMEM은 Gibco(USA)사 제품을 사용하였으며, phospho-p44/42 MAP kinase(Thr202/Tyr204) antibody와 p44/42 MAP kinase antibody그리고 p-Akt(S473) rabbit antibody와 Akt rabbit antibody, goat anti-rabbit IgG(H+L)는 cell signaling사 제품을 사용하였다. western blotting detection reagent는 amersham biosciences(Buckinghanshire, England)사 제품을, non-fat skim milk는 Becton(Le Pont de Claix, France)사 제품을, dimethylsulfoxide(DMSO), bovine serum albumin(BSA), phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), leupeptin, aprotinin, sodium fluoride(NaF), sodium orthovanadate(Na₃VO₄), N,N,N,N′-tetrametylethylenediamine(TEMED), 미녹시딜(minoxidil), 3-(4,5-dimethylithylithiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), trizma base는 Sigma사 제품을, PD98059, LY294002는 CALBIOCHEM사 제품을, protein assay는 Bio-Rad(CA, USA)사 제품을, glycine은 Biotechnology사 제품을 사용하였다.
western blotting detection reagent는 amersham biosciences(Buckinghanshire, England)사 제품을, non-fat skim milk는 Becton(Le Pont de Claix, France)사 제품을, dimethylsulfoxide(DMSO), bovine serum albumin(BSA), phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), leupeptin, aprotinin, sodium fluoride(NaF), sodium orthovanadate(Na3VO4), N,N,N,N′-tetrametylethylenediamine(TEMED), 미녹시딜(minoxidil), 3-(4,5-dimethylithylithiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), trizma base는 Sigma사 제품을, PD98059, LY294002는 CALBIOCHEM사 제품을, protein assay는 Bio-Rad(CA, USA)사 제품을, glycine은 Biotechnology사 제품을 사용하였다.
미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물에 의한 섬유아세포주의 세포증식 효과가 ERK와 Akt 경로와 관련이 있는지 알아보기 위하여 ERK 경로 억제제인 PD98059와 Akt 경로 억제제인 LY294002를 사용하였다. 최근 보고에서 FGF2와 VEGF로 유도된 artery endothelial 세포의 세포증식은 MEF/ERK경로와 PI3K/AKT 경로를 통한 것이며, PD98059 20 uM과 LY294002 10 uM까지 농도별로 처리 하였을 때 세포 증식이 억제되었다고 하였다²³⁾.
실험에 사용된 여정실(Fructus Ligustri Lucidi)은 제주도에서 생산된 자연산을 제천약초를 통해 구입하여 사용하였다. 건조시료 중량의 10배의 메탄올을 가하여 추출하였고, 각 용매별 분획은 메탄올 추출물에 증류수 0.
원심분리기(centrifuge HA-12, micro 17TR centrifuge), clean bench, CO₂ incubator는 한일기기(Inchun, Korea)사 제품을, ELISA reader는 Bio-TEK(Winooski, USA)사 제품을, electrophoresis power supply는 Amersham(Buckinghanshire, England)사 제품을, ChemiDoc image analysis는(Bio-Rad, CA, USA)사 제품을 사용하였다.
인체 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblast cells)를 Cascade Biologics에서 분양받아 10% fetal bovine serum(FBS)과 항생제(Antibiotic antimycotic)가 포함된 Dulbecco's Modified Eangle's medium(DMEM)과 함께 Culture dish에 seeding하여 37℃, 5% CO2가 포함된 배양기(incubator)에서 배양하였다.

데이터처리

D로 표시하였다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 one-way ANOVA test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다. p<0.

성능/효과

1. 여정실 H2O 분획물과 미녹시딜은 세포증식을 촉진하였고, 여정실의 경우 3일 배양군 10 ㎍/㎖에서 124.2±4.18%로 대조군에 비해 약 24% 증가시켰다.
2. ERK 1/2 인산화를 조사한 결과 여정실 H₂O 분획물 10 ㎍/㎖ 처리 군은 대조군에 비하여 2.65배 증가되었고, 25 ㎍/㎖ 처리 군은 2.45배 증가되었다. 미녹시딜 0.
3. Akt 인산화를 조사한 결과 여정실 H2O 분획물 10, 25 ㎍/㎖의 경우 대조군에 비하여 2.29, 2.28배 증가되었고, 미녹시딜 0.1 μM 처리 군의 경우 약 2.73배 증가되었다.
4. PD98059와 LY294002는 여정실과 미녹시딜에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 차단하였고, 세포증식 또한 억제하였다.
5A). LY294002 단일 처리군은 대조군에 비해 81.59%로 세포증식이 억제되었으며, 미녹시딜과 LY294002 병행 처리군은 103.08%에서 76.9%로, 여정실 H₂O 분획물 10, 25 ㎍/㎖과 LY294002 병행 처리군은 각각 115.98%에서 76.26%, 112.78%에서 89.04%로 세포증식이 유의성 있게 억제되었다(Fig. 5B).
또한 NIH3T3 세포에서 ERK 경로 차단 시 증가되는 AKT의 인산화가 PI3K 억제제인 LY294002를 20 uM 처리할 경우 AKT의 인산화가 차단된다고 하였다²⁴⁾. PD98059를 1시간 전처리 후 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물을 처리하고 ERK의 활성을 조사한 결과 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물에 의해 활성화 되었던 ERK가 PD98059에 의해 억제되었다(Fig. 4A). 또한 LY294002를 1시간 전처리 후 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물을 처리한 경우 Akt의 활성이 차단되었다(Fig.
미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물에 의해 활성화되었던 ERK와 Akt가 PD98059와 LY294002에 의해 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과가 섬유아세포의 증식과 연관이 있는지 알아보기 위하여 PD98059와 LY294002를 1시간 전처리 후 미녹시딜과 여정자 H₂O 분획물을 처리하고 72시간 배양하여 MTT assay를 시행하였다.
이러한 결과가 섬유아세포의 증식과 연관이 있는지 알아보기 위하여 PD98059와 LY294002를 1시간 전처리 후 미녹시딜과 여정자 H₂O 분획물을 처리하고 72시간 배양하여 MTT assay를 시행하였다. 실험 결과 PD98059 처리군은 대조군에 비해 92.36%로 세포증식이 감소되었으며, 미녹시딜과 PD98059 병행 처리군은 미녹시딜 처리군 109.08%보다 낮은 92.91%로, 여정실 H₂O 분획물 10, 25 ㎍/㎖과 PD98059 병행 처리군은 각각 109.3%에서 92.47%, 108.75%에서 96.23%로 세포증식이 억제되었다(Fig. 5A). LY294002 단일 처리군은 대조군에 비해 81.
실험 결과 미녹시딜은 2일 처리 군에서 대조군에 비하여 106 ± 6.41, 109 ± 7.64%로, 3일 처리 군에서 112.1 ± 6.89, 123.5 ± 3.51%로, 4일 처리 군에서 108.1 ± 6.11, 113.6 ± 5.37%로 세포증식을 증가시켰다(Fig. 1A).
O 분획물과 미녹시딜을 처리한 후 ERK 인산화가 증가하는지 확인 하였다. 실험 결과 여정자 H₂O 분획물 10 ㎍/㎖와 25 ㎍/㎖에서 대조군에 비하여 2.65배, 2.45배로 유의성 있게 증가하였고, 미녹시딜은 대조군에 비하여 2.4배가 증가되었다(Fig. 2). 이러한 결과로 볼 때 여정실과 미녹시딜의 세포증식 효과는 ERK 경로를 통한 것일 가능성이 있다.
본 연구에서는 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물이 섬유아세포에서 Akt 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 실험 결과 여정자 H₂O 분획물 10 ㎍/㎖와 25 ㎍/㎖에서 대조군에 비하여 Akt 인산화가 2.29, 2.28배 증가하였으며, 미녹시딜은 대조군에 비하여 2.73배 증가되었다(Fig. 3). 이러한 결과는 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물이 섬유아세포의 세포사멸을 억제하고 생존기간을 연장시키는데 관여하고 있음을 보여준 것이다.
이러한 결과로 미녹시딜과 여정실 H2O 분획물은 섬유아세포의 증식을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 미녹시딜 3일 처리군 중 1 μM 처리 군과 여정실 H2O 분획물 3일 처리군 중 10 ㎍/㎖ 처리 군에서 세포증식 효과가 가장 좋았다.
O 분획물은 섬유아세포의 세포증식을 유도하고, ERK와 Akt의 인산화를 유도하였다. 이러한 효과는 ERK와 Akt 경로를 억제하는 PD98059와 LY294002에 의해 인산화가 억제되고 세포증식 또한 감소되었다. 따라서 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물의 세포증식 효과는 ERK와 Akt 경로를 통해 나타나는 것으로 사료된다.
이상의 연구결과로 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물은 섬유아세포의 증식을 촉진하였으며, 이러한 결과는 ERK와 Akt 신호전달 경로가 관여하고 있는 것으로 사료된다.
이상의 연구결과를 종합해보면 미녹시딜과 여정실 H₂O 분획물은 섬유아세포의 세포증식을 유도하고, ERK와 Akt의 인산화를 유도하였다. 이러한 효과는 ERK와 Akt 경로를 억제하는 PD98059와 LY294002에 의해 인산화가 억제되고 세포증식 또한 감소되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	상처치유는 어떤 반응을 말하는가?	상처치유는 진피 섬유아세포와 표피 각질세포의 분화, 이동, 증식과 같은 여러 가지 세포의 특징과 관련된 복합적인 생리학적 반응이다1,2). 창상의 정상적인 상처치유과정은 지혈단계, 염증단계, 증식단계, 상처 수축의 단계를 거치고 다양한 성장인자, cytokine, integrin, 세포외 기질의 생성 등 모든 과정이 균형을 이루면 조절되어야 한다.
	창상의 정상적인 상처치유과정은 어떤 단계를 거치는가?	상처치유는 진피 섬유아세포와 표피 각질세포의 분화, 이동, 증식과 같은 여러 가지 세포의 특징과 관련된 복합적인 생리학적 반응이다1,2). 창상의 정상적인 상처치유과정은 지혈단계, 염증단계, 증식단계, 상처 수축의 단계를 거치고 다양한 성장인자, cytokine, integrin, 세포외 기질의 생성 등 모든 과정이 균형을 이루면 조절되어야 한다. 그러나 창상의 정도가 심하거나 각 단계와 여러 인자들이 균형을 이루지 못하는 경우 상처치유가 늦어지거나 흉터가 남게 된다3-5).
	본 연구에서 여정실 H2O 분획물과 미녹시딜을 인체 진피 섬유아세포에 처리하였을 때 조사하여 얻은 결론은?	1. 여정실 H2O 분획물과 미녹시딜은 세포증식을 촉진하였고, 여정실의 경우 3일 배양군 10 ㎍/㎖에서 124.2±4.18%로 대조군에 비해 약 24% 증가시켰다. 2. ERK 1/2 인산화를 조사한 결과 여정실 H2O 분획물 10 ㎍/㎖ 처리 군은 대조군에 비하여 2.65배 증가되었고, 25 ㎍/㎖ 처리 군은 2.45배 증가되었다. 미녹시딜 0.1 μM의 경우 2.4배 증가되었다. 3. Akt 인산화를 조사한 결과 여정실 H2O 분획물 10, 25 ㎍/㎖의 경우 대조군에 비하여 2.29, 2.28배 증가되었고, 미녹시딜 0.1 μM 처리 군의 경우 약 2.73배 증가되었다. 4. PD98059와 LY294002는 여정실과 미녹시딜에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 차단하였고, 세포증식 또한 억제하였다.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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여정실 물 분획물이 인체 진피 섬유아세포의 증식에 미치는 영향 Effect of Fructus Ligustri Lucidi $H_2O$ Extract on Cell Proliferation in Hman Dermal Fibroblast 원문보기

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