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문제 정의
- 본 연구에서는 한약 전탕액의 약효 및 성분의 변화를 줄 수 있는 또 다른 인자인 자체 미생물의 변화에 대해서 연구하였다. 대표적인 소화기 질환 처방으로, 구성 한약재 수가 적고, 한의원 사용 빈도 8위인 평위산10) 전탕액을 대상으로 보관 온도 및 보관 기간에 따른 평위산 탕액의 주요 지표성분, 산도 및 미생물 군집의 변화를 측정하고, 이를 바탕으로 전탕액의 보관 방법 및 유통기한에 대한 기초자료를 제공하고자 한다.
- 이러한 연구를 위해서는 전탕액의 안정성과 유효성을 검정하는 것이 기본이나 전탕액이 한방 의료기관 내에서 전탕되고, 이러한 전탕시설과 공간이 무균상태도 아니므로 미생물에 대한 오염 또한 중요한 인자라고 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 한약의 최적 보관 방법과 기간을 알아보고자 평위산을 선정하여 8개월 동안 보관에 따른 주요성분 및 미생물 군집의 변화를 조사하였다.
- 본 연구에서는 한약 전탕액의 약효 및 성분의 변화를 줄 수 있는 또 다른 인자인 자체 미생물의 변화에 대해서 연구하였다. 대표적인 소화기 질환 처방으로, 구성 한약재 수가 적고, 한의원 사용 빈도 8위인 평위산10) 전탕액을 대상으로 보관 온도 및 보관 기간에 따른 평위산 탕액의 주요 지표성분, 산도 및 미생물 군집의 변화를 측정하고, 이를 바탕으로 전탕액의 보관 방법 및 유통기한에 대한 기초자료를 제공하고자 한다.
- 등의 감초, 지실, 인진 탕전액에 대한 보관 조건과 기간에 대한 안정성 연구가 있다. 이들 연구들은 한약의 약효에 영향을 주는 유효성과 안정성을 목적으로, 전탕액의 항균, 항염, 진통, 항부종 효과 실험과 지표성분의 변화를 관찰하였다.
- 한약의 최적 보관 방법과 기간을 알아보고자 평위산 탕액의 보관에 따른 지표 성분 및 미생물 군집의 변화를 조사하였다. 8개월 동안 평위산 탕액의 주요성분의 변화에서는 감초의 주요성분인 liquiritin 과 glycyrrhizin의 성분 함량은 큰 변화를 보이지 않았으나, 진피의 주요성분인 hesperidin은 냉장 보관에서는 함량이 약 18%, 상온 보관에서는 약 38% 감소한 것으로 나타났다.
제안 방법
- 0% agarose gel에서 전기영동 한후 DNA purification kit를 사용하여 정제한 후, 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA의 염기서열을 BLAST(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAS T)를 이용하여 GenBank에 있는 염기서열과 상동성을 비교 분석하였다. 계통수 작성은 Clustal X(version 1.
- PCR 산물을 1.0% agarose gel에서 전기영동 한후 DNA purification kit를 사용하여 정제한 후, 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA의 염기서열을 BLAST(http://www.
- 00ug/mL의 범위에서 검량선을 작성하였다. 검액은 조제된 평위산 전탕액을 0.2 um syringe filter(SmartPor, Woongki Science, Seoul. Korea)로 여과하여 검액으로 하였다.
- 배지에서 자라나는 세균 군집을 선택하여 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다.
- 미생물 군집 측정은 세균의 경우 시료 1mL씩을 멸균 후 45℃로 식힌 15mL의 카제인 대두 소화 한천배지(casein soybean digest agar)를 넣어 잘 혼합한 후 페트리접시에 부어 30-35℃에서 5일간 배양하여 평판당 300개 이하의 세균 집락을 최대치로 하여 세균 수를 측정하였다. 진균의 군집은 세균의 경우와 동일하나 배지 1L당 50mg의 클로람페니콜이 첨가된 사부로 포도당 한천배지(sabouraud dextrose agar)를 사용하여 배양온도 20-25℃에서 7-10일간 배양한 후 100개 이하의 세균 집락이 나타나는 평판을 세어 총 진균수를 측정하였다.
- 반응조건은 94℃에서 10분간 pre-heating한 후 94℃에서 1분 30초, 45℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로 30 cycle 증폭한 후 72℃에서 8분간 최종 extension하였다. 반응액을 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 1.5kb의 크기에 해당하는 DNA band 유무를 확인하였다.
- 진정세균 영역(Eubacteria domain)에 속하는 세균 16SrDNA의 공통적인 서열을 인지하는 프라이머인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3')와 1492R (5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 반응용액은 3차 증류수 33.5uL, 10X PCR 완충용액 5uL, dNTP(2.5mM) 4uL, 각 프라이머 2uL(10pM), Taq DNA polymerase(5unit/uL) 0.5uL 및 주형 DNA 3uL 순으로 최종 부피가 50uL 가 되도록 제조하였다. 반응조건은 94℃에서 10분간 pre-heating한 후 94℃에서 1분 30초, 45℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로 30 cycle 증폭한 후 72℃에서 8분간 최종 extension하였다.
- 배지에서 자라나는 세균 군집을 선택하여 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다.
- 상온, 냉장 온도 및 냉동 온도에서 보관 중인 한약 탕액 팩을 일정시간 간격으로 꺼내어 탕액의 산도와 미생물 군집을 조사하였다. 최초 탕액의 산도는 pH 5.
- 미생물 군집 측정은 세균의 경우 시료 1mL씩을 멸균 후 45℃로 식힌 15mL의 카제인 대두 소화 한천배지(casein soybean digest agar)를 넣어 잘 혼합한 후 페트리접시에 부어 30-35℃에서 5일간 배양하여 평판당 300개 이하의 세균 집락을 최대치로 하여 세균 수를 측정하였다. 진균의 군집은 세균의 경우와 동일하나 배지 1L당 50mg의 클로람페니콜이 첨가된 사부로 포도당 한천배지(sabouraud dextrose agar)를 사용하여 배양온도 20-25℃에서 7-10일간 배양한 후 100개 이하의 세균 집락이 나타나는 평판을 세어 총 진균수를 측정하였다.
- 진정세균 영역(Eubacteria domain)에 속하는 세균 16SrDNA의 공통적인 서열을 인지하는 프라이머인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3')와 1492R (5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.
- 575 kg)을 약재 무게의 10배수에 해당하는 약 15 L의 증류수로 105℃에서 2시간 증기를 배출하지 않은 가압식 방법으로 전탕하였다. 평위산 1첩의 함량은 Table 1과 같으며, 전탕액 팩을 상온 (25℃), 냉장 (4℃) 및 냉동(-20℃)에 보관하면서 1개월 간격으로 꺼내어 분석하였다. 대조군으로는 조제한 직후의 전탕액 팩을 사용하였다.
- 평위산 내 주요성분인 liquiritin, hesperidin 및 glycyrrhizin의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템(Kyoto, Japan)을 사용하여 측정하였다. 분석에 사용 된 칼럼은 SunFire C18(5um, 4.
- 평위산 전탕액은 평위산 3제 분량 (1.575 kg)을 약재 무게의 10배수에 해당하는 약 15 L의 증류수로 105℃에서 2시간 증기를 배출하지 않은 가압식 방법으로 전탕하였다. 평위산 1첩의 함량은 Table 1과 같으며, 전탕액 팩을 상온 (25℃), 냉장 (4℃) 및 냉동(-20℃)에 보관하면서 1개월 간격으로 꺼내어 분석하였다.
대상 데이터
- (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 98% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 특급시약으로 Junsei(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 평위산 1첩의 함량은 Table 1과 같으며, 전탕액 팩을 상온 (25℃), 냉장 (4℃) 및 냉동(-20℃)에 보관하면서 1개월 간격으로 꺼내어 분석하였다. 대조군으로는 조제한 직후의 전탕액 팩을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 평위산의 구성 원료 한약재인 진피(Citri Unshius Pericarpium), 생강(Zingiberis Rhizoma) 및 대조(Zizyphi Fructus)는 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서 구입하였으며, 창출(Atractylodis Rhizoma), 후박 (Magnoliae Cortex) 및 감초(Glycyrrhizae Radix)는 (주)HMAX(Chungbuk, Korea)에서 각각 구입하였다.
- 분석에 사용 된 칼럼은 SunFire C18(5um, 4.6×250 mm, Waters Co., Milfore, MA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다.
- 표준물질인 liquiritin과 glycyrrhizin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 98% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.
- 함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고, 시스템은 pump (LC-20AT), on-line degasser(DGU-20A3), column oven(CTO-20A), autosampler(SIL-20AC) 및 PDA detector(SPD-M20A)로 구성되어 있다. 분석 data는 LCsolution software(Version 1.
데이터처리
- gov/BLAS T)를 이용하여 GenBank에 있는 염기서열과 상동성을 비교 분석하였다. 계통수 작성은 Clustal X(version 1.81) 프로그램으로 multiple sequence alignment한 후, neighbor-joining method를 이용하여 계통분류학적 유연관계를 추론하였으며, Bootstrap 값은 1,000회로 하였다.
성능/효과
- 한약의 최적 보관 방법과 기간을 알아보고자 평위산 탕액의 보관에 따른 지표 성분 및 미생물 군집의 변화를 조사하였다. 8개월 동안 평위산 탕액의 주요성분의 변화에서는 감초의 주요성분인 liquiritin 과 glycyrrhizin의 성분 함량은 큰 변화를 보이지 않았으나, 진피의 주요성분인 hesperidin은 냉장 보관에서는 함량이 약 18%, 상온 보관에서는 약 38% 감소한 것으로 나타났다. 미생물 군집 변화의 경우 4개월째 상온에서 43.
- Liquiritin, glycyrrhizin 및 hesperidin의 양과 peak 면적에 대한 상관관계는 상관계수(r2 )가 0.9999 이상인 정상관이었으며, 이를 이용한 지표 성분에 대한 분석결과 평위산 탕액에는 liquiritin이 0.57∼0.66mg/g, glycyrrhizin 이 0.67∼0.82 mg/g, hesperidin이 1.35∼2.7mg/g 함유되어 있었다.
- 보관기간 및 보관온도에 따른 지표 물질의 함량변화를 살펴본 결과, liquiritin 은 보관방법 및 기간에 따라 성분 함량이 큰 변화를 보이지 않았으며, glycyrrhizin은 상온에서 보관하였을 경우 오차 범위 내에서 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 hesperidin은 냉동 보관에서는 함량의 변화가 거의 없는 반면에 냉장 보관에서는 함량이 약 18% 정도 감소되었으며, 상온 보관에서는 함량이 약 38% 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 8CFU로 급격하게 군집 수가 감소하였다. 냉장 온도와 상온의 경우도 유사한 양상을 보였으며 군집 수는 4개월 후 각각 17.3 및 43.0CFU/mL로 상온에서 보관한 시료에서 가장 많은 군집이 나타났으며, 6개월 이후에는 세균이 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 4).
- 8개월 동안 평위산 탕액의 주요성분의 변화에서는 감초의 주요성분인 liquiritin 과 glycyrrhizin의 성분 함량은 큰 변화를 보이지 않았으나, 진피의 주요성분인 hesperidin은 냉장 보관에서는 함량이 약 18%, 상온 보관에서는 약 38% 감소한 것으로 나타났다. 미생물 군집 변화의 경우 4개월째 상온에서 43.0CFU/mL, 냉장에서 43.0CFU/mL 및 냉동에서 25.16CFU/mL의 최대치로 나타났으나, 이는 식품의약품안전청 허가 기준인 105 CFU/mL 이하 (세균) 및 102 CFU/mL 이하(진균)보다 현저히 낮은 수치로 나타났다. 본 연구 결과 주요성분의 변화량과 미생물 군집의 변화와는 상관관계를 찾아 볼 수 없었으며, 향후 다양한 조건과 더불어 세포 및 동물 실험에 대한 효능 연구가 한약 전탕 파우치의 보관 방법과 기간 설정에 중요한 요소라고 판단된다.
- 4). 미생물 군집의 변화는 냉동 온도에서 보관한 시료의 경우 초기에는 미생물 군집이 검출한계 이하였으나 보관한지 3개월 된 시료에서 1mL 당 23.17 CFU가 관찰되었으며, 4개월 후 최대치인 25.16 CFU가 나타난 후 5개월 째 3.8CFU로 급격하게 군집 수가 감소하였다. 냉장 온도와 상온의 경우도 유사한 양상을 보였으며 군집 수는 4개월 후 각각 17.
- 7mg/g 함유되어 있었다. 보관기간 및 보관온도에 따른 지표 물질의 함량변화를 살펴본 결과, liquiritin 은 보관방법 및 기간에 따라 성분 함량이 큰 변화를 보이지 않았으며, glycyrrhizin은 상온에서 보관하였을 경우 오차 범위 내에서 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 hesperidin은 냉동 보관에서는 함량의 변화가 거의 없는 반면에 냉장 보관에서는 함량이 약 18% 정도 감소되었으며, 상온 보관에서는 함량이 약 38% 감소하는 것으로 나타났다(Fig.
- 본 실험에서 제조한 10개의 탕액을 무작위로 선택하여 조산한 결과, 진균은 전혀 검출되지 않았으며, 순수 분리된 세균은 1종 (strain OM21)으로 그람양성이었으며, 간균(bacillus)이었다. 확인된 간균을 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 세균을 동정한 결과, 예측한 바와 같이 Bacillus licheniformis의 16S rDNA 유전자염기서열과 98% 유사도 (1086/1098 bp)를 보였으며, 이를 근거로 분리된 세균을 B.
- 1A and 1B). 본 실험에서 제조한 평위산 탕액 시료를 동일한 조건으로 분석한 결과, 표준물질의 retention time에서 peak가 나타나 liquiritin, glycyrrhizin 및 hesperidin 이 존재함을 알 수 있었다(Fig. 1C and 1D). Liquiritin, glycyrrhizin 및 hesperidin의 양과 peak 면적에 대한 상관관계는 상관계수(r2 )가 0.
- 상온, 냉장 온도 및 냉동 온도에서 보관 중인 한약 탕액 팩을 일정시간 간격으로 꺼내어 탕액의 산도와 미생물 군집을 조사하였다. 최초 탕액의 산도는 pH 5.0 정도였으나 보관 시기에 따라 점차 산도가 감소하여 4개월 후에 모든 보관 온도에서 pH 4.4-4.5로 급격하게 감소하였으며, 그 후 점차 증가하여 최종적으로는 상온보관 탕액은 pH 4.7, 냉동및 냉장보관 탕액은 pH 4.9-5.0으로 나타났다(Fig. 4). 미생물 군집의 변화는 냉동 온도에서 보관한 시료의 경우 초기에는 미생물 군집이 검출한계 이하였으나 보관한지 3개월 된 시료에서 1mL 당 23.
- 평위산의 구성 약재 중 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin, 진피의 주요성분인 hesperidin의 표준물질을 대상으로 HPLC를 수행한 결과, retention time이 각각 11.4분(liquiritin), 13.8분(hesperidin) 및 31.8분(glycyrrhizin)으로 나타났다 (Fig. 1A and 1B). 본 실험에서 제조한 평위산 탕액 시료를 동일한 조건으로 분석한 결과, 표준물질의 retention time에서 peak가 나타나 liquiritin, glycyrrhizin 및 hesperidin 이 존재함을 알 수 있었다(Fig.
- 평위산의 주요성분의 분석 결과, 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin은 보관방법 및 기간에 따라 성분 함량이 큰 변화를 보이지 않았으나 진피의 주요성분인 hesperidin은 냉장 보관에서는 함량이 약 18%, 상온 보관에서는 약 38% 감소하였다. 이는 손9) 등이 감초, 지실, 인진의 지표성분을 8주 동안 관찰한 결과, glycyrrhizin이 상온과 냉장에서 함량이 각각 10% 및 23.
- 본 실험에서 제조한 10개의 탕액을 무작위로 선택하여 조산한 결과, 진균은 전혀 검출되지 않았으며, 순수 분리된 세균은 1종 (strain OM21)으로 그람양성이었으며, 간균(bacillus)이었다. 확인된 간균을 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 세균을 동정한 결과, 예측한 바와 같이 Bacillus licheniformis의 16S rDNA 유전자염기서열과 98% 유사도 (1086/1098 bp)를 보였으며, 이를 근거로 분리된 세균을 B. licheniformis 로 동정하였다(Fig. 3).
후속연구
- 주로 여러 가지 식품, 특히 유제품에 많이 오염되어 식품의 부패를 일으키며 위장에 감염하여 식중독을 일으키는 병원균으로 알려져 있는 Bacillus licheniformis로 동정되었다15). 따라서 B. licheniformis가 검출 제한 세균의 범주에 속하지는 않지만 한약 탕액의 철저한 멸균 및 관리를 통해 반드시 제거해야 할 것으로 판단된다. 이러한 미생물의 군집은 4개월째 최대치를 보였으며, 이 시기에 탕액의 pH도 4.
- 등의 지표성분 연구 결과는 8주를 제시하였으나, 동물을 이용한 유효성 실험에서는 10일 이하를 제시하고 있어 보관기간에 너무나 다양한 결과를 볼 수 있다. 따라서 향 후 보관 방법 및 기간별 약효실험연구가 한약 전탕액의 보관 유통기간을 정하는데 중요한 연구라고 사료된다.
- 16CFU/mL의 최대치로 나타났으나, 이는 식품의약품안전청 허가 기준인 105 CFU/mL 이하 (세균) 및 102 CFU/mL 이하(진균)보다 현저히 낮은 수치로 나타났다. 본 연구 결과 주요성분의 변화량과 미생물 군집의 변화와는 상관관계를 찾아 볼 수 없었으며, 향후 다양한 조건과 더불어 세포 및 동물 실험에 대한 효능 연구가 한약 전탕 파우치의 보관 방법과 기간 설정에 중요한 요소라고 판단된다.
- licheniformis가 검출 제한 세균의 범주에 속하지는 않지만 한약 탕액의 철저한 멸균 및 관리를 통해 반드시 제거해야 할 것으로 판단된다. 이러한 미생물의 군집은 4개월째 최대치를 보였으며, 이 시기에 탕액의 pH도 4.4-4.5로 감소한 것으로 미루어보아 보관 중에 일련의 미생물 대사가 일어났음을 추정할 수 있으며, 이는 세균에 의한 발효의 결과로 여러 가지 유기산이 생성되고 이러한 유기산의 영향으로 탕액 내의 산도가 감소한 것으로 추정되며, 차후 유기산의 존재 유무 및 종류, 함량에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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