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문제 정의
- 본 연구는 사람의 미분화된 중간엽줄기세포를 효율적으로 냉동보존하기 위하여 인체에 부작용이 적은 ethylene glycol, Ficoll-70 및 sucrose로 이루어진 항동제를 규격화하고 이를 사용하여 vitrification 법으로 초급속으로 냉동시켜 보존하는 기술을 개발하고자 시행되었다.
제안 방법
- Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 방법으로 제대혈로부터 분리 배양된 단핵세포구를 10% FBS, L-glutamnie 및 antibiotics가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃/5% CO2 배양기에서 증식시켰다. 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특징을 관찰하였던 바, 그 모양은 방추형으로 가늘고 길게 뻗은 전형적인 중간엽줄기세포의 모양으로 관찰되었다(Fig 1A).
- 동결된 중간엽줄기세포를 해동한 다음 이들을 Low-glucose DMEM 배양액에 1 × 105 /ml의 세포 밀도로 60 mm 배양접시에 접종하고 5% CO2 배양기에 넣어 37℃에서 7일간 배양하여 이들의 증식율을 DMSO에 의한 완만동결법과 비교조사하였다.
- 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특징을 관찰하였던 바, 그 모양은 방추형으로 가늘고 길게 뻗은 전형적인 중간엽줄기세포의 모양으로 관찰되었다(Fig 1A). 또한, PAS염색을 실시하여 붉은색을 나타내는 줄기세포 양성반응을 확인하였다(Fig 1B).
- 이 배양된 세포들은 CD13, CD29, CD44, CD73, CD105(positive control) 및 CD34, CD45 (negative control) 등에 대한 antibodies와 immunolabelling한 다음, FACScan으로 검사하여 중간엽줄기세포임이 확인된 것을 시험에 공시하였다.
- 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특성을 확인한 다음, Periodic acid-Schiff's stain (PAS 염색)으로 줄기세포임을 확인하였고 아울러 FACScan을 이용한 flowcytometry로 줄기세포 특이 cytokines 의 발현을 확인하였다.
- 제대혈을 사용하여 Ficol density-gradient centrifugation 방법으로 단핵세포구를 분리하고, 이를 10% FBS, L-glutamnie 및 항생제가 첨가된 low-glucose DMEM 배양액으로 37℃/5% CO2 배양조건에서 계대배양으로 증식시키었다. 이 배양된 세포들은 위상차현미경으로 발달과 형태학적 특성을 확인한 다음, Periodic acid-Schiff's stain (PAS 염색)으로 줄기세포임을 확인하였고 아울러 FACScan을 이용한 flowcytometry로 줄기세포 특이 cytokines 의 발현을 확인하였다.
- 줄기세포의 냉동보존 후 생존율은 Trypan blue 염색법으로 확인하였다. 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산하여 생존율을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 시험에 사용된 시약과 재료 중, low-glucose Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), Trypsin은 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA) 제품을, DMSO, ethylene glycol, Ficoll-70, sucrose, Periodic acid-Schiff’s staining system는 Sigma (St. Louis, MI, USA) 제품을, Ficoll-paque plus는 Amersham Biosciences (Sweden) 제품을, FACScan기기는 Becxton & Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)제품을, freezing chamber는 Nalgene (Rochester, NY, USA)제품을 사용하였다.
- 태아의 제대로부터 채취된 제대혈액은 공여자의 허락을 득한 후 사용이 허가된 (IRB) 대학병원으로부터 공급받아 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 측정치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 군간의 유의성 검정은 SAS program을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 하였다. 유의성은 5% 수준에서 검증하였다.
- 본 실험에서 얻어진 측정치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 25 M sucrose/DPBS + FBS) 400 ×g에서 5분간 원심분리하여 pellet을 취하였다. 줄기세포의 냉동보존 후 생존율은 Trypan blue 염색법으로 확인하였다. 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산하여 생존율을 확인하였다.
성능/효과
- 49 배의 증식율을 보였다(Fig 3). 본 초자화동결법으로 냉동된 중간엽줄기세포는 해동 후에도 냉동하지 않은 대조군과 DMSO에 의한 완만동결법에 비하여 증식율에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 그러므로 초자화동결용액을 이용한 급속냉동기법은 줄기세포의 냉동보존에 충분한 활용성이 있다고 사료된다.
- 분리 배양한 줄기세포를 DMSO를 사용한 완만동결법과 초자화동결법으로 급속냉동 시킨 다음 이들을 융해시키고 줄기세포 수를 혈구계산기로 계산한 다음 Trypan blue 염색법으로 생존율을 확인하였던 바(Fig 2), Table 1에 나타난 바와 같이 DMSO에 의한 완만동결법에서는 86.65 ± 3.0%의 생존율을 보였으며, 초자화동결법(vitrification)에 의한 급속냉동법에서는 83.24 ± 0.80%의 생존율을 보였다.
- 액체질소에서 동결보존된 후 융해된 세포를 low glucose DMEM 배양액에서 7일간 배양하여 증식능력을 확인한 결과, 냉동하지 않았던 줄기세포에서는 3.44 ± 0.39배의 증식율을 보인 반면, DMSO에 의한 완만동결법에서는 2.21 ± 0.19배로 증식이 되었고, 초자화동결법에서는 2.30 ± 0.49 배의 증식율을 보였다(Fig 3).
- 제대혈 유래 중간엽줄기세포를 40% ethyelene glycol, 20% Ficoll-70 및 0.3 M sucrose의 혼합으로 이루어진 초자화동결용액을 이용한 초급속동결기법으로 냉동보존하고 이를 융해하여 생존율과 7일간 배양하여 증식율을 조사하였던 바, 미분화된 중간엽줄기세포의 냉동보존에 있어서는 이들 물질로 이루어진 초자화동결법과 DMSO 용액을 이용한 완만동결법 간에 유의적 차이 없이 83.24%의 높은 생존율과 2.30배의 증식율을 나타내었다. 그러므로 ethyelene glycol, Ficoll-70 및 sucrose의 혼합으로 이루어진 초자화동결용액을 이용한 초급속동결기법은 줄기세포의 안정적이며 장기간 보존에 활용할 수 있을 것이며 또한 이 초자화동결용액은 DMSO 용액보다 적은 부작용이 기대되므로 생체 내에 직접 이식에 활용이 가능할 것으로 본다.
- 초자화동결법에 의한 생존율은 완만동결법에 의한 생존율에 비하여 낮았으나 유의적(P < 0.05) 차이를 나타내지 않았고, 80% 이상의 높은 생존율을 보였다.
후속연구
- 30배의 증식율을 나타내었다. 그러므로 ethyelene glycol, Ficoll-70 및 sucrose의 혼합으로 이루어진 초자화동결용액을 이용한 초급속동결기법은 줄기세포의 안정적이며 장기간 보존에 활용할 수 있을 것이며 또한 이 초자화동결용액은 DMSO 용액보다 적은 부작용이 기대되므로 생체 내에 직접 이식에 활용이 가능할 것으로 본다.
- 앞으로 제대혈, 조혈모세포 및 분화된 줄기세포의 장기간 보존을 위한 이 기술의 개발이 더 수행되어져야 한다고 본다. 또한 ethylene glycol, Ficoll 및 sucrose 등의 혼합으로 조성된 항동제를 사용하여 초자화동결기법으로 냉동된 MSC를 융해 후 직접 생채 내에 이식하고 이들의 생존과 항동제의 생체에 미치는 영향에 관한 연구가 더 필요하다고 본다.
- 또한 최근 보고에서 냉동 보관되어 있던 제대혈의 경우 해동시켜 조혈모세포의 활성을 살펴보았을 때 그들의 생리적 생존율이 상당히 낮음을 보고한 바가 있다(18). 앞으로 제대혈, 조혈모세포 및 분화된 줄기세포의 장기간 보존을 위한 이 기술의 개발이 더 수행되어져야 한다고 본다. 또한 ethylene glycol, Ficoll 및 sucrose 등의 혼합으로 조성된 항동제를 사용하여 초자화동결기법으로 냉동된 MSC를 융해 후 직접 생채 내에 이식하고 이들의 생존과 항동제의 생체에 미치는 영향에 관한 연구가 더 필요하다고 본다.
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