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문제 정의
- 그러나 이 두 마크 간에 같은 분류군의 위치와 일부 분지군이 tree상에 일치하지 않은 점이 있었다. 이에 ITS1-5.8S-ITS2 부위서열을 이용한 왕대 속 식물 4개 분류군에 대한 유연관계를 실행하였으며 그 결과에 따라 형태학적으로 학명 부여에 대한 본 연구에서 토의를 하였다.
제안 방법
- DNA 서열에서 염기 치환이 같은 패턴으로 진화해왔다는 가설을 몬테-카를로 테스트(1,000 반복)로 검증하였다(Table 6). T에서 C로 치환이 14.
- PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected "p"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다[15].
- PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA 50 ng, 각 dNTP 100 uM, 시발체 각 0.2 uM, 1x enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 50 ul volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 94℃에서 90 sec간 변성한 후, 28 사이클로 94℃에서 30 sec, 42℃에서 60 sec, 72℃에서 60 sec간 실시하였고, 추가로 72℃에서 5분간 연장하였다.
- 각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였다 추출방법은 0.3 g의 신선한 잎을 액체질소로 마쇄한 다음 사용자의 지침서에 의거하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 에탄올 등 여액의 제거를 위해 진공 흡입기로 5분간 건조시킨 후 TE 100 ul에 용해하여 3일간 냉장보관하였다.
- 모든 염기 자리 당 불일치 지수(disparity index) 또는 불균등 지수를 산출하였다(Table 5). 0 보다 클 경우 서열 간 진화 분화의 차이가 우연에 의한 예상 값보다 염기 조성 편향에서 큰 차이를 나타내게 된다.
-
통계 분석
분류군간 유전적 거리(I)와 유전적 동질성(D)은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다[12]. PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected "p"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다[15].
- 57의 NEIGHBOR, neighbor-joining (NJ) 방법에 의해 구성하였다[5,14]. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 500회 반복법으로 실시하였다.
- 서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외하고 1,000회 반복으로 MEGA5로 실시하였다[17]. 타지마의 여러 통계치(M=number of sites, S=Number of segregating sites, ps=S/M, and π=nucleotide diversity, D=Tajima test statistic)를 산출하였다[16].
- )로 편집하였다. 왕대속 ITS 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA5와 Clustal X program으로 분석하였다[23]. 배당된 서열에서 gap의 부위는 missing data로 처리하였다.
- 추출된 DNA는 에탄올 등 여액의 제거를 위해 진공 흡입기로 5분간 건조시킨 후 TE 100 ul에 용해하여 3일간 냉장보관하였다. 용해된 시료는 DyNA 200 fluorometer(Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 이용하여 DNA 정량을 체크하였고 TE로 DNA 농도가 균질하게 조정하여 본 분석을 위해 사용하거나 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
- 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 증폭된 단편들은 bluescript vector로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다.
- 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 증폭된 단편들은 bluescript vector로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다. 각각의 종에서 최소 10개체 클론들을 분석하였다.
- 최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다[15]. 최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.
- 한편 앞서 inter-simple sequence repeats (ISSR) 마커에 의한 연구[6]와 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 마커에 의한 연구[7]를 본 연구인 핵 내 리보솜 서열(ITS) 연구 결과와 비교하였다. ISSR 마커에 의한 결과와 본 연구의 계통도는 거의 유사하였다.
- 전기영동 후 젤은 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다.
대상 데이터
- henonis (Bean) Stapf), 죽순대 또는 맹종죽(Phyllostachys pubescens Mazel)이다. 1,000 m2 이상 되는 유효집단을 유지하고 있는 재배지에서 직접 채집하여 사용하였다(Table 1).
- All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 751 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA5.
- 증폭된 단편들은 bluescript vector로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다. 각각의 종에서 최소 10개체 클론들을 분석하였다.
데이터처리
- 타지마의 여러 통계치(M=number of sites, S=Number of segregating sites, ps=S/M, and π=nucleotide diversity, D=Tajima test statistic)를 산출하였다[16].
이론/모형
- 핵산치환 모델 분석은 최적 치환 패턴에 대한 최소 Bayesian Information Criterion (BIC) 값을 고려하였다. 각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc) 값, Maximum Likelihood value (lnL), 척도의 수는 Nei와 Kumar[13]의 식에 의거하였다. 염기 자리 간 진화율에 대한 비균등성은 진화적으로 비변이 부분(+I)을 가진 Gamma 분포(+G)로 나타낸 모델을 사용하였다.
- 최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining (NJ) 방법에 의해 구성하였다[5,14]. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 500회 반복법으로 실시하였다.
- 44로 높았다. 또한 치환에 대한 24 핵산 치환 모델을 적용하였다(Table 7). 베이시안 정보 기준은 키무라 척도 5266.
- 각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc) 값, Maximum Likelihood value (lnL), 척도의 수는 Nei와 Kumar[13]의 식에 의거하였다. 염기 자리 간 진화율에 대한 비균등성은 진화적으로 비변이 부분(+I)을 가진 Gamma 분포(+G)로 나타낸 모델을 사용하였다. 염기치환의 전이/전형의 비율에 대한 평가(R) 역시 이 모델에 근거하여 산출하였다.
- 엽록체의 ITS 부위는 White 등[18]이 고안한 시발체(primer)로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다(Table 2).
- 최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다[15]. 최우법(maximum likelihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다.
- 핵산치환 모델 분석은 최적 치환 패턴에 대한 최소 Bayesian Information Criterion (BIC) 값을 고려하였다. 각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc) 값, Maximum Likelihood value (lnL), 척도의 수는 Nei와 Kumar[13]의 식에 의거하였다.
성능/효과
- 이 세 tree의 일치하는 것으로 오죽과 분죽이 더 유연관계가 근연함을 나타내었다. 결론적으로 맹종죽이나 왕대에서 오죽과 분죽이 분지되어 노온 것으로 판단된다. 맹종죽과 왕대 중에서는 어느 것이 더 조상형에 근연한지는 계통도에 따라 다르므로 본 결과만으로는 판단할 수 없었다.
- 물론 오죽에서 분화하여 널리 확산되었다고 추론할 수 있지만 그 반대로 분죽의 일부 분포지에서 어떤 원인(예를 들면 색소를 발현하는 유전자에 돌연변이가 발생)으로 검은색 오죽이 분화되어 그 색의 특이성으로 여러 사람들이 선호하여 우리나라로 도입되었을 가능성이 높다. 셋째, 두 번째와 관련이 있는 것으로 대나무에 흑색이라는 특이성으로 우리나라로 도입되었음에도 불구하고 분죽이 더 많이 분포하고 있다는 것은 오죽을 도입할 당시 이미 분죽이 분포되어 있었을 것이다. 따라서 분죽에서 오죽이 분화되었다면 변종을 오죽으로 취급해야 보다 정확한 계통 분류를 반영한 것으로 볼 수 있다.
- 왕대속 4개 분류군에 대한 ITS 부위의 profiles는 100 bp ladder DNA marker로 크기를 비교한 결과 평균 671 nucleotides (bp)의 크기를 가지고 있었다. 이들 밴드를 purification 하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 왕대속 식물은 653-751 bp이었다.
- 특히 우리나라가 아열대 기후로 접어들면 대나무 생육이 크게 증대되어 강변 산책로, 가로수 등 우리 주변의 사계절 녹지와 산소배출에 크게 기여할 것이다. 이런 관점에서 가장 기본적인 종 분류에 ITS에 의한 결과가 형태학적 분류와 매우 일치하는 것과 다양성 측정에 매우 정보적으로 본 연구결과에서 입증되었다.
- 440으로 높았다(Table 8). 중립설의 검증 결과는 0.5보다 큰 값을 나타내므로 유전적 변이를 증가시키는 힘이 자연도태 즉, 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이설보다는 도태에 의한 중립가설로 설명된다(D=1.349)
- 첫째, 분죽은 성숙되어도 줄기와 가지, 잎 등 어느 부위에도 검은색을 가진 형질이 나타나지 않는데 흑색을 의미하는 ‘nigra’가 종소명으로 들어가 있다.
- 이 결과는 형태학적 관점에서 오죽이 분죽이 수고, 색소 등이 맹종죽보다 더 유사하므로 부합하지 않는다. 한편 RAPD 마커에 의한 다양도(genetic diversity=0.044), ISSR 마커에 의한 다양도(0.098), ITS의 결과에서 얻은 다양도(0.440)가 더 높았는데 이는 exon 보다는 intron 부위에서 서열 간 변이가 많고 보다 긴 서열을 분석하여 다양도가 높게 나타난 것으로 판단된다.
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