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문제 정의
- 최근까지 갑상선기능저하증에 대하여 복합처방 및 약침, 그리고 溫裏藥 계통의 단일 약재 연구가 진행되었다. 그러나 증상이 陽氣不足, 腎陽虛의 양상을 보이는 측면이 있음에도 관련연구가 부족하였기에 補陽藥 중의 하나인 巴戟天의 투여가 갑상선기능저하증 모델 rat에 미치는 영향과 안전성을 알아보고자 하였다.
- 최근까지 갑상선기능저하증에 대하여 여러 복합 처방12,13과 藥鍼14,15, 그리고 傷寒 少陰病에 많이 사용되는 乾薑, 附子, 吳茱萸와 같은 溫裏藥 계통의 단일 약재가 미치는 영향에 대한 실험적 연구16-18가 진행되었으나, 갑상선기능저하증의 임상양상이 陽氣不足으로 해석할 수 있는 증상이 많음에도19 관련 실험적 연구가 부족하였기에 본 연구에서는 補陽藥의 하나인 巴戟天 단일 약재의 투여가 갑상선기능저하증 모델 rat에 미치는 영향과 안전성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- T3의 측정은 T3-antibody로 코팅된 microtiter wells에 준비된 샘플 50 ㎕씩과 standard T3 solution을 분주한 다음 100 ㎕ T3 HRP-conjugate, 100 ㎕ TBM color solution, 50 ㎕ 2N HCl stop solution을 각각 분주한 후 ELISA reader를 사용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 T3를 측정하였다. T4와 TSH 측정 역시 유사한 방법으로 T4-antibody와 TSH-antibody로 코팅된 microtiter wells에 준비된 샘플 100 ㎕ 씩과 standard T4 및 TSH solution을 분주한 다음 100 ㎕ T4 및 TSH enzyme conjugate, 100 ㎕ TBM color solution, 50㎕ 2N HCl stop solution을 각각 분주한 후 ELISA reader을 사용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 T4와 TSH를 측정하였다.
- 巴戟天 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 rat의 지질대사에 미치는 영향을 알아보기 위해 HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, total-cholesterol, Triglyceride를 분석하였다.
- 巴戟天(Morinda Officinalis)이 PTU로 유발한 rat의 갑상선기능저하증에 미치는 영향을 알아보기 위해 체중변화와 생화학검사를 통한 간과 신장에 미치는 영향, 그리고 혈청 중 T3, T4, TSH를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 巴戟天의 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 Rat의 갑상선 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 T3, T4, TSH를 측정하여 관찰하였다.
- 생후 2개월 된 200±20 g의 Sprague-Dawley系 male rat(중앙실험동물, Korea, 이하 rat)를 구입하여 12시간 씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하며 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며, 일반 사료와 물은 자유롭게 먹도록 하였다. 그 후 갑상선기능저하증 유발은 정상군을 제외한 모든 동물군에 6-Propyl, 2-thiouracil(water supplement(Ca# P3755, 10g, sigma, USA), 이하 PTU) 400 ㎎을 H2O 40 ㎖에 녹여 rat 체중 100 g당 0.2 ㎖/day씩 4주간 경피주사(100 g당 PTU 2 ㎎)하여 갑상선기능저하증을 유발시켰다.
- 정상군을 제외한 나머지 세 군에게는 총 4주간 PTU를 경피주사하여 갑상선기능저하증을 유발시켰으며, 巴戟天 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 巴戟天 추출물을 생리식염수에 현탁하여 500㎎/㎏의 용량으로 Zonde를 이용하여 1日 1回 2주간 경구로 투여하였다. 대조군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 巴戟天 투여군과 동량의 생리식염수를 경구로 투여하였고, T4 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 levothyroxine (CA# T2376, 1 g, sigma, USA)을 0.5N NaOH isotonic saline에 250 ㎎/500 ㎖의 농도로 희석하여 rat 체중 100 g당 0.1 ㎖/day의 용량(100 g당 levothyroxine 0.05 ㎎)으로 2주간 복강내 주사하였다(Table 1).
- 마지막 투약 다음날 체중을 측정하고 채혈 후 rat를 희생시켜 갑상선을 수술로 절제하였다. 채취된 갑상선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하고 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 다음 파라핀 용액에 담가 파라핀 블록을 만들었다.
- 실험은 rat 6마리씩을 normal group(이하 정상군), control group(이하 대조군), 巴戟天 500 ㎎/㎏ 투여군(이하 巴戟天 투여군) 및 양성대조군인 thyroxine 투여군(이하 T4 투여군)으로 나누어 진행하였다.
- 실험종료일에 rat의 심장에서 10 cc씩 채혈을 시행하여 3,000 rpm에서 20분 간 원심분리한 다음 上淸液을 얻어 -40 ℃에 보관한 후 aspartate transaminase(이하 AST), alanine transaminase(이하 ALT), alkaline phosphatase(이하 ALP), blood urea nitrogen(이하 BUN), creatinine, glucose, albumin, total protein, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride의 생화학 분석을 시행하였다.
- 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 갑상선조직을 관상으로 절편하여 gelatin coated slide에 부착시켰다. 이렇게 만들어진 조직 절편들은 조직염색을 위해 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직은 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색하여 컴퓨터와 연결된 고해상도 카메라가 부착된 광학현미경(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan)이용하여 각각의 디지털 영상을 얻고, 400배 확대하여 비교하였다.
- 이렇게 만들어진 조직 절편들은 조직염색을 위해 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직은 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색하여 컴퓨터와 연결된 고해상도 카메라가 부착된 광학현미경(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan)이용하여 각각의 디지털 영상을 얻고, 400배 확대하여 비교하였다.
- 정상군을 제외한 나머지 세 군에게는 총 4주간 PTU를 경피주사하여 갑상선기능저하증을 유발시켰으며, 巴戟天 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 巴戟天 추출물을 생리식염수에 현탁하여 500㎎/㎏의 용량으로 Zonde를 이용하여 1日 1回 2주간 경구로 투여하였다. 대조군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 巴戟天 투여군과 동량의 생리식염수를 경구로 투여하였고, T4 투여군은 PTU 경피주사 개시 2주 후부터 levothyroxine (CA# T2376, 1 g, sigma, USA)을 0.
- 마지막 투약 다음날 체중을 측정하고 채혈 후 rat를 희생시켜 갑상선을 수술로 절제하였다. 채취된 갑상선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하고 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 다음 파라핀 용액에 담가 파라핀 블록을 만들었다. 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 갑상선조직을 관상으로 절편하여 gelatin coated slide에 부착시켰다.
- 체중측정은 실험 개시일에 최초 측정하고, 이후 실험종료일 마지막 sampling 전까지 매주 1회씩 총 5회 측정하였다.
- 측정방법은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea)을 이용하여 시행하였으며, 측정시에는 rat의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 rat을 올려놓은 후 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
- 파극천의 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 Rat의 갑상선 조직에 미친 영향을 알아보기 위해 갑상선을 추출하여 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색 후 광학현미경 하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 혈청 중 triiodothyronine(이하 T3), thyroxine(이하 T4)와 thyroid stimulating hormone(이하 TSH) 측정에는 각각 Rodent T3 ELISA(Enzyme-Linked Immuno- sorbent Assay) test kit(Endocrine technologies Inc., USA), Rodent T4 ELISA test kit (Endocrine technologies Inc., USA)와 Rodent TSH ELISA test kit (Endocrine technologies Inc., USA)를 사용하였다. 혈청은 실험종료일 채혈 후 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 上淸液을 얻어 -40℃에 보관하였다.
대상 데이터
- 巴戟天(Morinda Officinalis Radix, 이하 Morinda) 1,000 g을 경희의료원 약재과에서 구매하여 80% 에탄올 1,500 ㎖에 넣은 후 heating mantle를 이용하여 2시간 동안 가열 추출하고, 여과한 여액을 500 ㎖ 플라스크에 applicator를 이용하여 넣은 후 filter로 걸러내었다. 걸러진 여과액은 Rotary evaporator(Model NE-1, 東京理化學株式會社, Japan)로 건조 시키고, 동결 건조된 약제 1차 추출물 1g씩을 10 ㎖의 증류수로 용해시킨 후 95 ℃ 수조에서 2시간 동안 재차 가열 추출하였으며, 이들 추출물을 원심 분리용 시험관에 담아 14,000 rpm에서 20분 간 원심 분리하여 上淸液을 수거하였다.
- 생후 2개월 된 200±20 g의 Sprague-Dawley系 male rat(중앙실험동물, Korea, 이하 rat)를 구입하여 12시간 씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하며 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며, 일반 사료와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
데이터처리
- 각각의 수치는 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표시했으며, 양방 검정 유의도(two-tailed p value)는 p<0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.
- 통계학적 비교분석에는 GraphPad PRISM statistical package(ver 5.00, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하여 각 군 간의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 이어 Tukey’s post-hoc test로 사후 검증하였다.
성능/효과
- 1. 巴戟天 투여군에서는 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 체중변화가 없었다.
- 2. 巴戟天 투여군에서는 대조군에 비해 간기능, 신장기능에 통계학적으로 유의한 변화를 일으키지 않았다.
- 3. 巴戟天 투여군에서는 대조군에 비해 혈당, 단백질 및 지질대사에 통계학적으로 유의한 변화를 일으키지 않았다.
- 4. 巴戟天 투여군에서는 대조군에 비해 T3는 차이가 없었으나, 통계학적으로 유의한 T4의 증가와 TSH의 감소를 유발하였다.
- 이는 PTU의 작용기전이 말초로 방출된 T4로부터 T3로의 전환을 억제하는 것임을 고려할 때 본 실험에서 PTU 투여 후 T4뿐 아니라 T3의 감소가 충분히 이루어져 갑상선 기능저하증이 동물모델에서 충분히 유발되었음을 알 수 있다. T4는 巴戟天 투여군에서 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 보였고, 혈청 TSH의 측정에서는 상당히 주목할 만한 결과가 보여졌는데 巴戟天 투여군에서 T4 투여군에 비해서는 그 감소폭이 뚜렷하지는 않았으나, 대조군에 비해 유의한 감소를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군에서 thyroxine의 투여로 TSH가 정상화되고, T4가 증가했음에도 T3는 차이가 없었던 이유는 PTU의 영향으로 T4가 T3로 전환되는 과정도 억제되었기 때문으로 보인다.
- Triglyceride의 경우 대조군(43.3±12.66㎎/㎗)이 정상군(85.5±35.21 ㎎/㎗)에 비해 통계학적으로 유의하게 감소한 것을 관찰할 수 있었으나(p<0.05), 巴戟天 투여군과 대조군 사이에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Table 6).
- 巴戟天 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 rat의 간기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 AST, ALT, ALP 수치를 분석한 결과 정상군과 대조군 간에서 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았고, 巴戟天 투여군과 대조군에서도 전 항목에서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 4).
- 巴戟天 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 rat의 생화학지표에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 total protein, albumin, glucose 수치를 분석한 결과 모든 지표에서 각 군간 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다(Table 3).
- 巴戟天 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 rat의 신기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 BUN과 creatinine을 분석한 결과 BUN은 각 군간 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았지만, creatinine의 경우 T4 투여군에서 대조군과 비교했을 때 통계학적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.05) (Table 5).
- 巴戟天 투여가 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 rat의 체중변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 각군별 체중 변화를 관찰한 결과 4주간의 연구 후 대조군의 체중(291.8±37.04 g)이 정상군(347.5±41.05 g)에 비해 통계학적으로 유의한 감소를 보였으나(p<0.05), 巴戟天 투여군과 대조군 사이에서는 통계학적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다(Table 2).
- 대조군(Fig. 2, Control)에서는 여포간의 결합조직이 위축되고 PTU에 의한 갑상선 호르몬의 형성이 억제되어 여포의 모양을 유지하지 못하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 여포내부의 thyroglobulin과 결합한 colloid가 모두 비어있었으며, 여포사이의 간격도 좁아져있었다.
- 그러나 앞서 연구했던 附子, 乾薑, 吳茱萸의 溫裏藥 투여연구17-19에 비해 용량대비 T4 증가효과가 크지 않았으므로, 溫裏藥 처방에 巴戟天을 함께 사용했을 때의 효과를 검증할 필요가 있다. 또한 附子17와 乾薑18투여시에는 용량에 비례한 T4의 증가는 뚜렸했었지만 TSH의 변화는 거의 없었고, 吳茱萸19투여시에는 T4의 증가와 TSH의 감소를 유발하는 것을 볼 때 附子, 乾薑, 吳茱萸, 巴戟天을 함께 사용한다면 임상에서도 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 2, LT4)에서는 여포간 결합조직이 정상군에 비해서는 위축되어있으나, 대조군에 비해 여포강 내 콜로이드의 생성으로 불균일하게나마 여포를 유지하고 있는 것을 관찰할 수 있다. 또한갑상선 epithelial cell은의 증가 및 비후가 대조군에 비해 억제되어 있는 양상이 관찰되었다.
- 본 실험에서 total-cholesterol 등 지질 수치의 상승인 대조군에서 정상군에 비해 증가하는 양상이 관찰되어 일반적인 갑상선 기능저하증의 특성이 관찰되었으나, 중성지방의 경우 오히려 감소하는 결과가 관찰되었음. 이는 PTU의 지속적인 피하주사로 인한 실험동물의 스트레스로 인한 사료 섭취량의 감소로 인한 것으로 사료된다.
- 갑상선기능 검사에서 T3의 경우 정상군과 비교하여 대조군, T4, 巴戟天 투여군 모두에서 통계학적으로 유의하게 낮게 관찰되었다. 이는 PTU의 작용기전이 말초로 방출된 T4로부터 T3로의 전환을 억제하는 것임을 고려할 때 본 실험에서 PTU 투여 후 T4뿐 아니라 T3의 감소가 충분히 이루어져 갑상선 기능저하증이 동물모델에서 충분히 유발되었음을 알 수 있다. T4는 巴戟天 투여군에서 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 보였고, 혈청 TSH의 측정에서는 상당히 주목할 만한 결과가 보여졌는데 巴戟天 투여군에서 T4 투여군에 비해서는 그 감소폭이 뚜렷하지는 않았으나, 대조군에 비해 유의한 감소를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과에서 巴戟天은 갑상선호르몬의 합성을 증가시키고 뇌하수체-갑상선 축에 영향을 주어 TSH의 감소를 가져왔다고 볼 수 있다. 그러나 앞서 연구했던 附子, 乾薑, 吳茱萸의 溫裏藥 투여연구17-19에 비해 용량대비 T4 증가효과가 크지 않았으므로, 溫裏藥 처방에 巴戟天을 함께 사용했을 때의 효과를 검증할 필요가 있다.
- 5%이지만 10년 전과 비교했을때 불현성 갑상선기능저하증의 경우 현저한 증가를 보였다고 밝히고 있다22. 이상의 내용을 정리해보면 일차성이 95% 이상을 차지하고, 유병율은 현성 갑상선기능저하증이 0.1-2%정도이며, 혈중 TSH만 증가한 불현성 갑상선기능저하증의 유병율은 5-10%정도로 추정되나 최근 증가 추세이다3-7,22.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면 溫裏藥이 아닌 補陽藥 중의 하나인 巴戟天을 갑상선기능저하증에 사용하였을 때 갑상선호르몬 합성을 촉진시키고, 혈당, 단백질대사와 지질대사에 큰 영향을 미치지 않으며, 간과 신장에 독성도 없으므로 갑상선기능저하증의 치료에서 안전하게 사용할 수 있는 효과적인 치료제로 기대된다. 아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 장기간의 투약 연구와 巴戟天 용량별 효과, 溫裏藥과 병용 투여시의 효과, 그리고 巴戟天의 갑상선기능보호에 대한 분자생물학적 기전 연구 등이 추가로 연구되어야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합해보면 溫裏藥이 아닌 補陽藥 중의 하나인 巴戟天을 갑상선기능저하증에 사용하였을 때 갑상선호르몬 합성을 촉진시키고, 혈당, 단백질대사와 지질대사에 큰 영향을 미치지 않으며, 간과 신장에 독성도 없으므로 갑상선기능저하증의 치료에서 안전하게 사용할 수 있는 효과적인 치료제로 기대된다. 아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 장기간의 투약 연구와 巴戟天 용량별 효과, 溫裏藥과 병용 투여시의 효과, 그리고 巴戟天의 갑상선기능보호에 대한 분자생물학적 기전 연구 등이 추가로 연구되어야 할 것으로 생각된다.
- 巴戟天 투여군에서는 대조군에 비해 위축된 조직학적 변화를 야기하였다. 이상의 실험결과를 종합해 볼 때, 巴戟天은 갑상선호르몬의 합성을 촉진시키고, 巴戟天 투여로 인한 체내 혈당, 단백질대사, 지질대사, 간기능, 신장 기능에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으므로, 갑상선기능저하증의 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 본 실험결과를 바탕으로 巴戟天의 갑상선조직에 대한 작용기전 연구 및 임상 연구 등이 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 실험결과를 종합해 볼 때, 巴戟天은 갑상선호르몬의 합성을 촉진시키고, 巴戟天 투여로 인한 체내 혈당, 단백질대사, 지질대사, 간기능, 신장 기능에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으므로, 갑상선기능저하증의 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 본 실험결과를 바탕으로 巴戟天의 갑상선조직에 대한 작용기전 연구 및 임상 연구 등이 필요할 것으로 사료된다.
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