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문제 정의
- 이러한 점들과 관련하여 본 연구에서는 팽이버섯을 가장 많이 육종, 생산, 이용하고 있는 한국, 일본, 중국의 야생 팽이버섯들과 상업용 육종 팽이버섯 등의 유전적 변이를 ITS 및 다양하게 개발된 primer들을 이용한 RAPD 방법으로 분석하여 지역 간 혹은 상업용 품종간의 유전적 유사도와 그 특성을 밝히고자 하였다. 또한 새로운 품종 개발에 활용할 수 있고 유전적 정보와 분자 유전마커로서의 가능성을 평가하고자 하였다.
- 이러한 점들과 관련하여 본 연구에서는 팽이버섯을 가장 많이 육종, 생산, 이용하고 있는 한국, 일본, 중국의 야생 팽이버섯들과 상업용 육종 팽이버섯 등의 유전적 변이를 ITS 및 다양하게 개발된 primer들을 이용한 RAPD 방법으로 분석하여 지역 간 혹은 상업용 품종간의 유전적 유사도와 그 특성을 밝히고자 하였다. 또한 새로운 품종 개발에 활용할 수 있고 유전적 정보와 분자 유전마커로서의 가능성을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- DNA함량을 측정하기 위해 DNA를 100배 희석하여 spectrophotometer-(Shimadzu UV-VIS1201, Japan)로 260 nm와 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 농도를 계산하고, PCR을 위한 template DNA로 사용하였다.
- Genomic DNA의 추출을 위해 PDA 배지에서 20일에서 23일간 배양한 균사를 사용하였으며, DNA 추출법은 Lee 등[15]의 방법을 약간 변형하여 사용하였다.
- ITS I 영역의 PCR 산물은 전기영동하여 나타나는 DNA band를 확인한 후, QIA-quick PCR purification kit (Qiagen Inc., USA)를 이용하여 정제하였다.
- ITSP 1과 2와 PCR 반응 조건은 template DNA 변형을 위해 94℃에서 30초간 denature, 50℃에서 30초 annealing, 72℃에서 extension을 1분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다. ITSP3과 ITSP4 primer를 이용한 PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성시키고, 50℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다.
- RAPD를 수행한 PCR product는 5 ng/100 ml의 농도로 ethidium bromide를 첨가한 1.2% agarose gel (SIGMA, USA)에서 1x TAE buffer에서 50 mV로 전기영동 하였으며, UV상에서 나타나는 DNA band를 확인하였다.
- 본 실험의 RAPD 증폭반응은 MJ Reserch PTC 150 minicycler에서 thermal cycle의 program은 Park 등[18]의 방법에 따라 수행하였다. Template DNA 변형을 위해 94℃에서 3분간 predenaturation 한 다음, 94℃ 30초간 denaturation, 40℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 elongation을 5분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 Cycle로 하였으며, 이 실험에서는 45 cycle로 수행하였다. DNA 증폭이 끝난 후 최종적인 합성을 위해 72℃에서 5분간 안정화한 다음, 4℃에서 보관 사용하였다.
- 또한 Nei [17]의 유전적 거리지수를 다소 변형한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다. 도출된 자료행렬에 따라 산출된 유전적 유사도를 기초로 하여 neighbour joining tree (NJ)를 작성하였다[20]. 그리고 종간의 유전적 유사도 계수(similarity coefficient)는 Sneath와 Sokal [21]의 방법에 따라 구하였다.
- RAPD 결과, 반응이 나타난 16개의 primer에서 다형성이 인정되는 3,030개의 band를 발견하였다. 먼저 각 band를 하나의 형질로 취급하여 코드화하였으며[20,22], 그리고 전체 코드화한 자료를 바탕으로 자료행렬을 작성하였다. 분지도는 UPGMA (unweighted pair-group method, arithmetic average method) 방법을 사용하였고, phylogenetic analysis에서 PAUP 4.
- 증폭은 Bioneer PCR kit를 사용하였다. 본 실험은 MJ Research PTC 150 minicycler에서 수행하였으며 thermal cycle의 program은 primer ITSP 1과 2, ITSP3과 ITSP4를 달리하여 사용하여 반응시켰다.
- ,USA)를 이용하여 PRISM Dye Dideoxi Terminator Cycle Sequencing로 분석하였다[7,8,20]. 얻어진 염기서열을 Gene Bank 데이터베이스에 등록된 것들과 상동성을 비교하였다.
- 염기서열은 Sequencher (Gene codes Co., USA), Clustal X를 이용하여 alignment 시킨 후, 최종 세부 정열은 수작업으로 보정하였다.
- DNA 증폭이 끝난 후 최종적인 합성을 위해 72℃에서 5분간 안정화한 다음, 4℃에서 보관 사용하였다. 이때 각각의 primer에 대한 상기의 PCR 과정을 통한 screening을 실시하여, 선택된 primer 별로 3회 이상의 반복실험을 수행하여 재현성이 뚜렸한 것만을 유용한 primer로 결정하였다.
- 02b version [21]을 사용하여 parsimony analysis를 실시하였으며, 분석방법으로는 Heurestic search를 이용하였다. 이에 따른 option으로 ACCTRAN, MULPARS 및 TBR을 이용하였다. 또한 Nei [17]의 유전적 거리지수를 다소 변형한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다.
- 정제된 PCR산물을 이용하여 Perkin-Elmer applied biosystems ABI 377A (Perkin-Elmer Co.,USA)를 이용하여 PRISM Dye Dideoxi Terminator Cycle Sequencing로 분석하였다[7,8,20]. 얻어진 염기서열을 Gene Bank 데이터베이스에 등록된 것들과 상동성을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 팽이버섯(Flammulina velutipes) 균주 29종은 한국, 일본, 중국의 야생 갈색 균주(한국 10종, 일본 2종, 중국 2종)와 이미 육종된 백색균주(한국 2종, 일본 8종, 중국 5종)등 총 29종의 균주를 각각 인천대학교, (주)그린피스, 농업기술원에서 분양받아 ITS와 PCR-RAPD 분석을 위한 실험 재료로 사용되었다(Table 1).
- 8S ribosomal DNA 및 partial 28S ribosomal DNA였다. 증폭을 위해 ITSP1, ITSP2, ITSP3, ITSP4 primer들을 사용하였다(Fig. 1). 증폭은 Bioneer PCR kit를 사용하였다.
이론/모형
- 도출된 자료행렬에 따라 산출된 유전적 유사도를 기초로 하여 neighbour joining tree (NJ)를 작성하였다[20]. 그리고 종간의 유전적 유사도 계수(similarity coefficient)는 Sneath와 Sokal [21]의 방법에 따라 구하였다. 또한 각 분계도의 지지정도는 jack-knifing [5], bootstrap [6]을 이용하여 분석하였다.
- 이에 따른 option으로 ACCTRAN, MULPARS 및 TBR을 이용하였다. 또한 Nei [17]의 유전적 거리지수를 다소 변형한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다. 도출된 자료행렬에 따라 산출된 유전적 유사도를 기초로 하여 neighbour joining tree (NJ)를 작성하였다[20].
- 그리고 종간의 유전적 유사도 계수(similarity coefficient)는 Sneath와 Sokal [21]의 방법에 따라 구하였다. 또한 각 분계도의 지지정도는 jack-knifing [5], bootstrap [6]을 이용하여 분석하였다. 이러한 분석방법은 1,000회 반복 실시하였다.
- 본 실험의 RAPD 증폭반응은 MJ Reserch PTC 150 minicycler에서 thermal cycle의 program은 Park 등[18]의 방법에 따라 수행하였다. Template DNA 변형을 위해 94℃에서 3분간 predenaturation 한 다음, 94℃ 30초간 denaturation, 40℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 elongation을 5분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 Cycle로 하였으며, 이 실험에서는 45 cycle로 수행하였다.
- 본 연구의 PCR 실험 시 RAPD를 위해 사용한 primer는 식물과 버섯들에 대한 유전적 다양성 및 유연관계 분석에 활용되는 상업용 kti primer (OPA 01~20, OPB 01~20) (Operon Technologies, USA)를 사용하였다. code name과 sequence (5' to 3')는 Table 2 에 나타내었으며, G+C의 함량은 60-70%이었다.
- 먼저 각 band를 하나의 형질로 취급하여 코드화하였으며[20,22], 그리고 전체 코드화한 자료를 바탕으로 자료행렬을 작성하였다. 분지도는 UPGMA (unweighted pair-group method, arithmetic average method) 방법을 사용하였고, phylogenetic analysis에서 PAUP 4.02b version [21]을 사용하여 parsimony analysis를 실시하였으며, 분석방법으로는 Heurestic search를 이용하였다. 이에 따른 option으로 ACCTRAN, MULPARS 및 TBR을 이용하였다.
성능/효과
- 29개의 팽이품종들을 40개의 primer를 이용하여 RAPD 분석을 한결과 모든 품종에 반응들이 나타내었고 3번의 반복실험을 통하여 재현성이 확인된 것은 전체 40개 중 16종류의 primer였다(Table 2). 그 중 특히 polymeric band의 빈도가 높아 유전적 다양성을 잘 나타낸 primer들은 OPA-2,4,3,9,10,20이었다.
- Primer ITS 1, 2, 3, 4를 이용한 ITS 염기서열 분석한 결과 전체 720개의 염기서열을 확인하였다(Table 3). 29개의 품종 모두 동일하였으며, 이는 Genebank에 수록된 것[24]과 동일하였다.
- 또한 교배 육종 시에 단핵균주를 사용해야 하고 단핵균주들의 분자 유전적 특성이 다르다는 점[14]을 고려할 때 본 연구결과에 사용한 균주들은 이핵균주들이므로 육종을 위해서 단포자 균사의 RAPD 분석이 요구된다. 그리고 일본산 백색종(JW), 중국산 백색종(CW), 중국산 야생종(CB) 간의 band 의 패턴은 거의 유사하게 나타났다. 또한 중국 인공백색팽이(CW)의 경우 일본산 인공백색팽이(JW)와 유전적 변이도는 3~20% 차이가 났다.
- 3). 또한 RAPD band 를 바탕으로 팽이버섯 형태 특징과 비교할 때 일본, 중국, 한국 백색팽이버섯(JW, CW, KW) 그룹은 갓, 대의 형태가 일률적인 반면 특히 한국산 야생팽이(KB) 그룹은 형태가 다양하였다(Table 1). 이는 RAPD band 분석에서 일본, 중국, 한국 백색팽이 그룹 band의 분포 범위가 좁고, 비슷한 양상을 띄었으며, 한국 야생팽이 그룹의 경우 band 분포 범위가 보다 넓고 다양하게 표현되었다(Fig.
- 일본산 백색팽이(JW)와 한국산 야생종(KB)과는 30~45%의 유전적 변이도를 보였다. 또한 중국산 야생팽이(CB)와 20~28%의 변이도를 보였으며, 일본의 백색팽이는 한국과는 유전적으로 많이 차이가 나 그들만의 독자적인 팽이를 육종한 것으로 보인다.
- KB-1~10 한국산 야생종의 경우 band의 패턴 분석 결과 매우 다양한 패턴으로 전개되는 것으로 보아 자연상태에서 유전적 변이가 상당히 이루어져 온 것으로 보인다. 이는 팽이육종의 근간이 되는 야생종 특히 한국 고유종의 팽이를 육종할경우 다른 국가와 차별화될 수 있는 팽이를 육종할 가능성이 높을 것으로 판단된다.
- 일본산 백색팽이(JW)는 종내 비유사도지수는 4~20%로 나타났고, 일본산 백색팽이(JW)와 중국산 백색팽이(CW)들 간의 비유사도지수는 4~20%로 나타났다. 특히 CW-2~5와 JW-7~8간의 비유사도가 4~10%로 국가별 품종간의 가장 낮은 유전적 변이도가 나타났다.
- 3~45%로 나타났다. 종내 가장 낮은 변이는 CB-1, CB-2 중국산 야생품종들로 행렬도에 나타난 비유사도지수는 3.3%였으며, 가장 높은 변이는 KB-10와 JW-6로 45%였다.
- 일본산 백색팽이(JW)는 종내 비유사도지수는 4~20%로 나타났고, 일본산 백색팽이(JW)와 중국산 백색팽이(CW)들 간의 비유사도지수는 4~20%로 나타났다. 특히 CW-2~5와 JW-7~8간의 비유사도가 4~10%로 국가별 품종간의 가장 낮은 유전적 변이도가 나타났다.
- PCR에 의하여 증폭된 band들은 400 bp에서 2,000 bp 사이의 구간에 분포하고 있었으며 primer에 따라서 8~16개의 band들이 나타내었다. 특히 primer OPA 3과 20을 이용한 RAPD 분석결과를 보면 일본과 중국품종의 JW1~7과 CB 1-2, CW 1-5에서 band들이 500~1,600 bp 사이에 유사하게 나타나지만 한국의 야생종 KB 1~10들은 200~2,000 bp에서 매우 다양하게 나타냈다(Fig. 2). 그러나 OPA-2, 9, 10과 OPB-7들을 이용한 경우 band 분포가 모든 품종간에 다양성이 매우 컸다(Fig.
- 품종간 가장 높은 변이는 한국야생종 KB-10과 일본 백색종 JW-6로 45%로 인위적인 육종으로 인해 종내의 변이를 넘어 종분화의 수준에 이르렀음을 보여 주었다.
- 6%로 나타났다. 한국산 야생팽이(KB)를 기준으로 일본산 야생팽이(JB), 일본산 백색팽이(JW)의 비유사도지수는 각각 23~42%, 30~45%로 나타났으며, 중국산 야생팽이(CB)와 백색팽이(CW)는 각각 25~38%, 27~43%여서 한국산 야생팽이나 일본산 백색팽이는 품종에 따라 다른 종에 가까울 정도로 분화되었음을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 교배 육종 시에 단핵균주를 사용해야 하고 단핵균주들의 분자 유전적 특성이 다르다는 점[14]을 고려할 때 본 연구결과에 사용한 균주들은 이핵균주들이므로 육종을 위해서 단포자 균사의 RAPD 분석이 요구된다. 그리고 일본산 백색종(JW), 중국산 백색종(CW), 중국산 야생종(CB) 간의 band 의 패턴은 거의 유사하게 나타났다.
- 이상의 결과들로 RAPD 분석결과를 통하여 분자 유전적으로 교배 육종의 과정, 신품종 평가를 위한 분자 유전적 기준 등으로의 활용이 가능하다고 본다. 또한 형태 생리적인 변이와 특성들과 연관된 RAPD 특이성, 각 품종들의 단핵균주의 RAPD 양상 등의 추가적 연구가 이루어진다면 품종개발의 자료로 활용 될 수 있다고 본다. KB-1~10 한국산 야생종의 경우 band 패턴 분석 결과 매우 다양한 패턴으로 전개되는 것으로 보아 자연상태에서 유전적 변이가 상당히 이루어져 온 것으로 보인다.
- 본 연구결과 ITS 염기서열은 품종간의 유의적인 차이가 없어 품종을 구별 할 수 있는분자 지표나 팽이 품종간의 유연관계 분석을 위한 자료로서는 모두 적합하지 않다고 생각된다. 그러나 능이버섯이나 민자주방망이 버섯의 경우 본 연구에서와 같이 동일 ITS 서열을 분석한 결과 민자주방망이 버섯은 지역간 품종의 비유사도가 1.
- KB-1~10 한국산 야생종의 경우 band의 패턴 분석 결과 매우 다양한 패턴으로 전개되는 것으로 보아 자연상태에서 유전적 변이가 상당히 이루어져 온 것으로 보인다. 이는 팽이육종의 근간이 되는 야생종 특히 한국 고유종의 팽이를 육종할경우 다른 국가와 차별화될 수 있는 팽이를 육종할 가능성이 높을 것으로 판단된다.
- 이상의 결과들로 RAPD 분석결과를 통하여 분자 유전적으로 교배 육종의 과정, 신품종 평가를 위한 분자 유전적 기준 등으로의 활용이 가능하다고 본다. 또한 형태 생리적인 변이와 특성들과 연관된 RAPD 특이성, 각 품종들의 단핵균주의 RAPD 양상 등의 추가적 연구가 이루어진다면 품종개발의 자료로 활용 될 수 있다고 본다.
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