본 연구는 LC-ESI-MS/MS를 이용하여 혈청 중의 피나스테라이드의 분석법을 확립하고, 밸리데이션을 통하여 분석방법의 타당도를 검증하였다. 혈청에 내부표준물질로 베클로메타손을 첨가한 후 methyl tert-butyl ether (MTBE)을 사용하여 액체상추출법(liquid-liquid extraction, LLE)으로 전처리하였다. LC-MS/MS의 양이온 모드에서 피나스테라이드와 베클로메타손의 MRM (multiple reaction monitoring) mass transition은 각각 m/z 373.2${\rightarrow}$305.2, m/z 409.3${\rightarrow}$391.2 이었으며, 머무름 시간은 각각 5.81분, 5.46분이었다. 피나스테라이드의 정량한계는 0.1 ng/mL로 나타났으며, 0.1~20.0 ng/mL의 농도 범위에서 검량선은 우수한 직선성($R^2$=0.9997)을 확인할 수 있었으며, 회수율은 80~83% 범위이었다. 피나스테라이드의 일내에 대한 정밀도는 6.3~10.6%, 정확도는 97.3~103.6% 범위이었으며, 연속 3일간 수행한 일간 정밀도는 0.8~5.2%, 정확도는 99.8~102.5%로 나타났다.
본 연구는 LC-ESI-MS/MS를 이용하여 혈청 중의 피나스테라이드의 분석법을 확립하고, 밸리데이션을 통하여 분석방법의 타당도를 검증하였다. 혈청에 내부표준물질로 베클로메타손을 첨가한 후 methyl tert-butyl ether (MTBE)을 사용하여 액체상추출법(liquid-liquid extraction, LLE)으로 전처리하였다. LC-MS/MS의 양이온 모드에서 피나스테라이드와 베클로메타손의 MRM (multiple reaction monitoring) mass transition은 각각 m/z 373.2${\rightarrow}$305.2, m/z 409.3${\rightarrow}$391.2 이었으며, 머무름 시간은 각각 5.81분, 5.46분이었다. 피나스테라이드의 정량한계는 0.1 ng/mL로 나타났으며, 0.1~20.0 ng/mL의 농도 범위에서 검량선은 우수한 직선성($R^2$=0.9997)을 확인할 수 있었으며, 회수율은 80~83% 범위이었다. 피나스테라이드의 일내에 대한 정밀도는 6.3~10.6%, 정확도는 97.3~103.6% 범위이었으며, 연속 3일간 수행한 일간 정밀도는 0.8~5.2%, 정확도는 99.8~102.5%로 나타났다.
A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI/MS/MS) method was developed and validated for the determination of finasteride in human serum. Beclomethasone was used as internal standard (IS) and liquid-liquid extraction (LLE) using methyl tert-butyl ether (MTBE) wa...
A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI/MS/MS) method was developed and validated for the determination of finasteride in human serum. Beclomethasone was used as internal standard (IS) and liquid-liquid extraction (LLE) using methyl tert-butyl ether (MTBE) was carried out to isolate analyte. The mass transitions monitored in multiple reaction monitoring (MRM) in positive ion mode were m/z 373.2${\rightarrow}$305.2 for finasteride and m/z 409.3${\rightarrow}$391.2 for IS. Retention times of finasteride and IS were 5.81 and 5.46 min, respectively. The limit of quantitation (LOQ) was 0.1 ng/mL and the calibration curve showed good linearity in the range of 0.1~20.0 ng/mL ($R^2$=0.9997). The intra-day assay precision and accuracy were in the range 6.3~10.6% and 97.3~103.6%, respectively, and the inter-day assay precision and accuracy were in the range 0.8~5.2% and 99.8~102.5%, respectively. The sample extract recovery of the method was 80~83%.
A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI/MS/MS) method was developed and validated for the determination of finasteride in human serum. Beclomethasone was used as internal standard (IS) and liquid-liquid extraction (LLE) using methyl tert-butyl ether (MTBE) was carried out to isolate analyte. The mass transitions monitored in multiple reaction monitoring (MRM) in positive ion mode were m/z 373.2${\rightarrow}$305.2 for finasteride and m/z 409.3${\rightarrow}$391.2 for IS. Retention times of finasteride and IS were 5.81 and 5.46 min, respectively. The limit of quantitation (LOQ) was 0.1 ng/mL and the calibration curve showed good linearity in the range of 0.1~20.0 ng/mL ($R^2$=0.9997). The intra-day assay precision and accuracy were in the range 6.3~10.6% and 97.3~103.6%, respectively, and the inter-day assay precision and accuracy were in the range 0.8~5.2% and 99.8~102.5%, respectively. The sample extract recovery of the method was 80~83%.
분무기체로 질소가스를 사용하였으며 온도는 300℃, ion spray voltage는 4500 V이었다. 기타 MS/MS 분석 파라미터는 declustering potential 48 V, entrance potential 10 V, collision energy 38 V, collision cell exit potential 12 V로 설정하여 분석하였다.
본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 피나스테라이드의 분석법을 확립하였으며, 이 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 그 결과, 정량한계는 0.
시료 분리를 위한 HPLC의 분석칼럼은 Unison UK-C18 column (2 mm i.d. × 75 mm length, 3 µm particle size)을 사용하였고, 이동상은 0.1% 개미산이 포함된 수용액과 아세토니트릴이었으며 기울기 용리법(gradient elution)으로 분석하였다.
시료 전처리 과정을 통해 추출, 농축, 정제를 마친 시료는 Table 1에서와 같은 기기분석 조건에서 LCMS/MS를 이용하여 분석하였다. 시료 분리를 위한 HPLC의 분석칼럼은 Unison UK-C18 column (2 mm i.
에 따라 밸리데이션을 수행하였다. 피나스테라이드 분석법의 신뢰성 검증을 위하여 검량선 작성용 표준시료액(0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0 ng/mL)을 시료전처리 방법과 동일하게 하여 하루에 5회 밸리데이션을 시행하였다. 피나스테라이드의 QC 시료는 검량선 작성 농도 범위를 기준으로 저농도(0.
피나스테라이드와 내부표준물질인 베클로메타손의 분자이온의 확인을 위하여 텐뎀 질량분석기에서 실린지 펌프를 이용하여 표준물질을 10 µL/ min의 유속으로 주입(Infusion)하는 방법을 이용하였고 manual tuning mode에서 분석대상물질의 m/z [M+H]+ 에 해당하는 피크를 확인한 후, 최적화(quantitative optimization) 과정을 수행하여 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)을 확인하였다.
0 ng/mL)을 시료전처리 방법과 동일하게 하여 하루에 5회 밸리데이션을 시행하였다. 피나스테라이드의 QC 시료는 검량선 작성 농도 범위를 기준으로 저농도(0.3 ng/mL), 중농도(8.0 ng/mL), 고농도(16.0 ng/mL)로 시료의 전처리 방법과 동일하게 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 구하고, 연속하여 3일간 실험을 행하여 일간 정밀도, 정확도를 구하여 타당도를 검증하였다.
대상 데이터
HPLC에 사용된 칼럼은 Imtakt Corporation사(Kyoto, Japan)의 Unison UK-C18 column (2 mm i.d. × 75 mm length, 3µm particle size)을 사용하였다.
Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 표준혈청(human serum)은 PAA Laboratories사(Cölbe, Germany)로부터 구입하였다. LC-MS/MS 분석을 위해 필요한 모든 용매는 HPLC급고순도 용매를 사용하였고, 아세토니트릴은 Merck사(Darmstadt, Germany), 메탄올 및 증류수와 개미산(formic acid)은 각각 J.T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였다. 액체상 추출법에서 사용된 methyl tert-butyl ether (MTBE) 및 탄산칼륨(K2CO3)는 각각 Sigma-Aldrich사(St.
본 연구에서 표준물질로 사용된 피나스테라이드(98%)와 내부표준물질로 사용된 베클로메타손(99%, Fig. 1b)은 모두 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 표준혈청(human serum)은 PAA Laboratories사(Cölbe, Germany)로부터 구입하였다.
본 연구의 시료분석을 위해서 사용된 LC-MS/MS는 Agilent사(Palo Alto, CA, USA)의 Agilent 1200 Series HPLC와 triple quadruple 텐뎀질량분석기(API 4000, Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. HPLC에 사용된 칼럼은 Imtakt Corporation사(Kyoto, Japan)의 Unison UK-C18 column (2 mm i.
검출을 위한 MS/MS 분석조건은 전기분무이온화 (electrospray ionization, ESI) 방식을 선택하였고 양이온(+) 모드에서 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였다. 분무기체로 질소가스를 사용하였으며 온도는 300℃, ion spray voltage는 4500 V이었다. 기타 MS/MS 분석 파라미터는 declustering potential 48 V, entrance potential 10 V, collision energy 38 V, collision cell exit potential 12 V로 설정하여 분석하였다.
Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였다. 액체상 추출법에서 사용된 methyl tert-butyl ether (MTBE) 및 탄산칼륨(K2CO3)는 각각 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA), Wako사(Junyaku, Japan) 제품을 사용하였다.
인체시료인 혈청 중의 피나스테라이드를 분석하기 위하여 LC-MS/MS를 사용하였고, 분석조건은 Table 1에 나타내었다. 피나스테라이드와 내부표준물질인 베클로메타손의 분자이온의 확인을 위하여 텐뎀 질량분석기에서 실린지 펌프를 이용하여 표준물질을 10 µL/ min의 유속으로 주입(Infusion)하는 방법을 이용하였고 manual tuning mode에서 분석대상물질의 m/z [M+H]+ 에 해당하는 피크를 확인한 후, 최적화(quantitative optimization) 과정을 수행하여 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)을 확인하였다.
이론/모형
검출을 위한 MS/MS 분석조건은 전기분무이온화 (electrospray ionization, ESI) 방식을 선택하였고 양이온(+) 모드에서 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였다. 분무기체로 질소가스를 사용하였으며 온도는 300℃, ion spray voltage는 4500 V이었다.
분석방법의 신뢰성 확보를 위하여 생체시료분석법 밸리데이션20 및 Bioanalytical Method Validation21에 따라 밸리데이션을 수행하였다. 피나스테라이드 분석법의 신뢰성 검증을 위하여 검량선 작성용 표준시료액(0.
시료의 전처리는 액체상 추출법을 이용하였으며, 원심분리기는 Beckman Coulter사(Fullerton, CA, USA)의 Allegra 6R을 사용하였고, vortex-mixer는 Scientific Industries사(Bohemia, NY, USA)의 Vortex-Genie 2를 사용하였다. Shaker는 IKA Labortechnik사(Staufen, Germany)의 HS 250 basic을 사용하였고, 질소농축기는 Zymark사(CA, USA)의 Turbovap® LV evaporator 를 사용하였다.
성능/효과
본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 피나스테라이드의 분석법을 확립하였으며, 이 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 그 결과, 정량한계는 0.1 ng/ mL이고, 0.1~20.0 ng/mL의 농도범위에서 검량선은 우수한 직선성(R2=0.9997)을 나타내었고 회수율은 80~83% 이었다. 이러한 결과는 기존의 LC-MS 혹은 LC-MS/MS 분석법들과 비교하여 정량한계는 2배에서 10배까지 낮은 수준이었다.
따라서 본 연구에서 확립된 LC-MS/MS 분석법은 혈청 내의 피나스테라이드의 정량과 확인에 이용할 수 있는 높은 감도와 선택성, 직선성, 정밀도와 정확도를 가지고 있는 것으로 사료된다.
7%로 생체시료분석법 밸리데이션 가이던스인 80~120%에 만족하였다(Table 2). 또한 피나스테라이드 분석 시 실시한 정밀도는 3가지 농도 수준(저농도 0.3 ng/mL, 중농도 8.0 ng/mL, 고농도 16.0 ng/mL)에서 각각 5회 반복하여 실시한 결과 CV는 6.3~10.6%로 나타났으며, 정확도는 97.3~103.6%범위이었다(Table 3). 연속 3일간의 수행한 일간에서도 3가지 농도 수준(저농도 0.
6%범위이었다(Table 3). 연속 3일간의 수행한 일간에서도 3가지 농도 수준(저농도 0.3 ng/ mL, 중농도 8.0 ng/mL, 고농도 16.0 ng/mL)에서 CV는 0.8~5.2%으로 나타났으며, 정확도는 99.8~102.5%이었다(Table 3). 이상의 결과로 본 연구의 피나스테라이드에 대한 LC-MS/MS 분석법은 사람의 혈청을 이용한 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀도와 정확도를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
5%이었다(Table 3). 이상의 결과로 본 연구의 피나스테라이드에 대한 LC-MS/MS 분석법은 사람의 혈청을 이용한 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀도와 정확도를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
피나스테라이드 0.1~20 ng/mL 농도범위에서 일내 정밀도는 변동계수(coefficient of variation, C.V.)가 1.7~9.5%로 나타나 생체시료분석법 밸리데이션 가이던스인 15%이내였으며, 정확도는 88.4~102.7%로 생체시료분석법 밸리데이션 가이던스인 80~120%에 만족하였다(Table 2). 또한 피나스테라이드 분석 시 실시한 정밀도는 3가지 농도 수준(저농도 0.
혈청 중에서 농도가 0.1~20.0 ng/mL의 범위가 되도록 표준물질을 첨가하여 전처리 과정을 거친 후 검량선을 작성하였으며, y=0.0323x + 0.0002, 상관계수(R2)가 0.9997로 우수한 직선성을 확인하였다(Fig. 5).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피나스테라이드란?
피나스테라이드(finasteride, Fig. 1a)는 테스토스테론에서 강력한 남성 호르몬인 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone, DHT)으로의 전환을 촉진시키는 5-α-reductase 효소의 활성을 억제하는 4-아자스테로이드(azasteroid)계 합성화합물이다.2-4 피나스테라이드는 프로스카(Proscar)라는 이름으로 1992년에 미국 식품의약국(FDA)에서 전립선 비대증 치료제로 승인되었으며, 피나스테라이드의 처리는 전립선과 DHT 수치의 뚜렷한 감소로 결과되었다.
전립선비대증은 어떤 현상인가?
전립선비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH)은 여러 가지 원인에 의해 전립선이 비정상적으로 커져 배뇨 장애 및 성기능 장애를 일으키게 되는 현상으로 50대 이상의 남성들에게서 흔히 발생하는 증상이다.1 최근우리나라도 서구식 생활화 및 고령화로 인해 전립선 비대증 및 전립선암 환자가 증가하고 있는 추세이다.
임신 중이거나 임신 가능성이 있는 여성에게 피나스테라이드의 사용이 금지되는 이유는?
그러나 강력한 남성호르몬인 DHT로의 전환을 저해하기 때문에 피나스테라이드에 노출된 산모의 남자태아는 외부 생식기 이상의 선천적 장애가 발생할 수 있으며, 현재까지 소아와 여성들에 있어서 안전성이 확립되어 있지 않은 실정이다. 따라서 임신 중이거나 임신 가능성이 있는 여성에게 피나스테라이드의 사용은 금하고 있으며, 피나스테라이드 성분의 약물을 투여 받고 1개월이 경과하지 아니한 사람은 채혈 금지 대상자로 선정되어 있다.
참고문헌 (21)
H. A. Guess, H. M. Arrighi, E. J. Metter and J. L. Fozard, Prostate, 17, 241-246 (1990).
F. Q. Guo, L. F. Huang, K. P. Wong, Y. H. Dai, Y. W. Li, Y. Z. Liang, K. L. Huang, K. J. Zhong and M. J. Wu, J. Pharm. Biomed. Anal, 43, 1507-1513 (2007).
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