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문제 정의
- 이에 대한 한의학적 접근은 매우 부족하다. 그러므로 본 연구에서는 보양환오탕이 뇌허혈 손상과 뇌신경세포 손상에 유효한 효과를 나타낸다는 이전 연구 결과에 근거하여, 뇌출혈 손상과 그에 따른 뇌부종에 미치는 영향을 관찰해보고자 하였다. 흰쥐의 대뇌 선조체에 콜라겐분해효소 (collagenase)를 주입하여 뇌출혈과 뇌부종을 유발시키고 보양환오탕 물추출물을 3일간 경구투여한 다음 뇌출혈 크기 및 뇌부종 비율을 관찰하였으며, 뇌출혈 주변부의 염증소견에서 나타나는 호중구 침윤과 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 신경세포 손상에서 나타나는 c-Fos, Bax 및 heat shock protein (HSP) 72 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한바 유의한 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
- 중풍에 대한 한의학의 치법과 한약물의 효능을 관찰한 기존의 실험연구들은 주로 허혈성 뇌경색에 대한 접근들이 많았으며 뇌출혈에 대한 자료는 매우 부족하다. 그러므로 본 연구에서는 중풍과 반신불수에 사용되는 처방 중 기존 연구를 통하여 뇌허혈 손상과 뇌신경세포 손상에 대해 보호효능이 있는 것으로 보고된 보양환오탕을3,7,8) 선정하여 뇌출혈에 대한 효능을 관찰하였다.
- 그러므로 뇌조직 손상에서 호중구 침윤을 억제하는 것이 뇌부종과 뇌신경세포의 손상을 억제하는 중요한 기전이 된다26,27). 본 연구에서는 뇌출혈 유도 후 출혈주변조직의 호중구 활성을 확인하기 위해 MPO 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다. MPO는 H2O2와 반응하여 강력한 살균작용을 발휘하며28,29) 주로 호중구에서 발현되므로 호중구의 면역염색 표식자로 활용되고 있다.
- 그러므로 본 연구에서는 보양환오탕이 뇌허혈 손상과 뇌신경세포 손상에 유효한 효과를 나타낸다는 이전 연구 결과에 근거하여, 뇌출혈 손상과 그에 따른 뇌부종에 미치는 영향을 관찰해보고자 하였다. 흰쥐의 대뇌 선조체에 콜라겐분해효소 (collagenase)를 주입하여 뇌출혈과 뇌부종을 유발시키고 보양환오탕 물추출물을 3일간 경구투여한 다음 뇌출혈 크기 및 뇌부종 비율을 관찰하였으며, 뇌출혈 주변부의 염증소견에서 나타나는 호중구 침윤과 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 신경세포 손상에서 나타나는 c-Fos, Bax 및 heat shock protein (HSP) 72 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한바 유의한 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 보양환오탕 10첩 분량 700 g에 5,000 ml의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 79.5 g의 추출물을 얻어 수율은 11.4% 이었으며, 1000 mg/kg을 실험동물의 1회 투여량으로 하여 뇌출혈 유발 3시간 후부터 1일 1회 3일간 경구투여 하였다.
- 면역조직화학법으로 염색된 iNOS, c-Fos, Bax 및 HSP72발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, MPO의 면역형광염색된 뇌조직은 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였다. 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석 시스템에 저장하고, ImageJ software (ver.
- 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 뇌조직 절편을 면역조직화학염색 과정과 동일하게 처리하였으며, 호중구를 관찰하기 위해서 호중구 표식자인 myeloperoxidase (MPO)에 대해서 1차 항체는 anti-MPO (1:250, A-0398, DAKO, USA)를, 2차항체는 Cy5-conjugated goat anti-rabbit (1:200, ab6564, Abcam, UK)를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다.
- 뇌출혈 유발 3일 후 실험동물을 pentobarbital의 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담궈 침전시켰다.
- 뇌출혈 유발 3일 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 1 mm 두께의 뇌 절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software (ver.
- 뇌출혈 유발을 위한 수술과정은 electronic temperature controller (CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온 (37±0. 5℃)이 유지되는 상태에서, 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas의 흡입마취 하에서 이루어졌으며, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium (50 mg/kg)을 복강주사 하였다.
- 다음 0.05% 3,3′-diamino-benzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- 1차항체는 anti-iNOS (1:200, 610297, BD, USA), anti-c-Fos (1:500, ab7963, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-Bax (1:250, sc-7480, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 anti-HSP72 (1:200, HSP01, Calbiochem, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody (1:200, Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어낸 후 avidin-biotin immuno-peroxidase의 방법에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 0.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
- 뇌출혈에 대한 보양환오탕의 효능을 관찰하기 위하여 실험군은 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 Sham군과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈을 유발시킨 대조군 (Control군) 및 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 3일간 보양환오탕 물추출물을 경구투여한 보양환오탕투여군 (Sample군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 12마리씩으로 구성되었고, Sham군의 조직은 염색과정 등에서 정상군으로 사용하였으며, 그 자료는 실험결과로 제시하지 않았다.
- 면역조직화학법으로 염색된 iNOS, c-Fos, Bax 및 HSP72발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, MPO의 면역형광염색된 뇌조직은 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였다. 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다.
- 보양환오탕이 뇌출혈 손상과 그에 따른 뇌부종에 미치는 영향을 관찰하기 위해 흰쥐의 선조체에 콜라겐분해효소를 주입하여 뇌출혈과 뇌부종을 유발시키고 보양환오탕 물추출물을 3일간 경구투여한 다음 뇌출혈 크기와 뇌부종 비율을 관찰하였으며, 뇌출혈 주변부에서 MPO 양성반응의 호중구 침윤과 iNOS, c-Fos, Bax 및 HSP72 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석 시스템에 저장하고, ImageJ software (ver. 1.41, NIH, USA)를 사용하여 뇌출혈 주변부에서 양성반응 세포 수를 측정한 다음 일정면적 (105 μm2)으로 보정하여 자료로 사용하였다.
- 뇌출혈 유발 3일 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 1 mm 두께의 뇌 절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software (ver. 1.41, NIH)를 사용하여 각 뇌 절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구 (intact hemisphere)와 출혈 측 대뇌반구 (hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다.
- 이어서 뇌출혈 주변조직에서 신경세포 사멸에 대한 보양환오탕의 작용을 관찰하기 위하여 c-Fos와 Bax에 양성반응을 나타내는 세포들을 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. c-Fos 는 immediate early genes (IEGs)에 의하여 발현되는 전사인자 단백질들의 하나로 여러 가지 자극에 대해 중추신경계에서 c-Fos가 발현된다31).
대상 데이터
- 이후 3회 씻어 낸 후 1차항체를 처리하였다. 1차항체는 anti-iNOS (1:200, 610297, BD, USA), anti-c-Fos (1:500, ab7963, Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-Bax (1:250, sc-7480, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 anti-HSP72 (1:200, HSP01, Calbiochem, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody (1:200, Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어낸 후 avidin-biotin immuno-peroxidase의 방법에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다.
- 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 Sham군과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈을 유발시킨 대조군 (Control군) 및 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 3일간 보양환오탕 물추출물을 경구투여한 보양환오탕투여군 (Sample군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 12마리씩으로 구성되었고, Sham군의 조직은 염색과정 등에서 정상군으로 사용하였으며, 그 자료는 실험결과로 제시하지 않았다.
- 41, NIH)를 사용하여 각 뇌 절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구 (intact hemisphere)와 출혈 측 대뇌반구 (hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 한약물은 보양환오탕 (Boyanghwano-tang, BYT)으로 처방 구성약물은 Table 1과 같으며, 각 한약재는 (주)허브메디에서 구입하였다. 보양환오탕 10첩 분량 700 g에 5,000 ml의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다.
- 실험동물은 샘타코 (Samtako, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도 (21-23℃), 습도 (40-60%), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 측정된 모든 자료는 Student's t-test를 사용하여 대조군과 보양환오탕투여군 사이에서 p <0.05, p <0.01 및 p <0.001의 유의수준으로 검정하였다.
성능/효과
- 보양환오탕은 뇌출혈 크기를 대조군에 비해서 유의하게 감소시켰으며, 뇌출혈에 의한 뇌부종 또한 대조군에 비해서 유의하게 감소시켰다. 뇌출혈 주변부에서 보양환오탕은 MPO 양성반응 호중구 침윤을 유의하게 억제하였으며, iNOS 발현을 감소시켰다. 이외에도 보양환오탕은 뇌출혈 주변부와 대뇌피질의 c-Fos 양성반응 세포 증가를 유의하게 억제하였으며, 뇌출혈 주변부에서 Bax 양성반응과 HSP72 양성반응 세포 증가를 대조군에 비해서 유의하게 억제하였다.
- 뇌출혈 주변조직에서 Bax 발현의 변화를 관찰하기 위해 동일한 일정면적의 조직에서 Bax의 면역조직화학염색에 양성반응을 보이는 세포 수를 측정한 결과, Control군은 24.0±2.3 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 보양환오탕을 투여한 Sample군은 14.5±2.1 개가 관찰되어 유의성 (p <0.01) 있는 감소를 나타내었다(Fig. 7-A, 7-B).
- 뇌출혈 주변조직에서 HSP-72 발현의 변화를 관찰하기 위해 동일한 일정면적의(10⁵µm²) 조직에서 HSP-72의 면역조직화학 염색에 양성반응을 보이는 세포 수를 측정한 결과, Control군은 21.3±1.2개가 관찰되었으며, 이에 비하여 보양환오탕을 투여한 군은 12.0±1.5개가 관찰되어 유의성 (p <0.001) 있는 감소를 나타내었다(Fig. 8-A, 8-B).
- Bax가 과도하게 발현될 경우 미토콘드리아로부터 cytochrome C를 분비하게 하여 세포자연사가 유발되므로35) 신경세포의 사멸을 판별할 수 있는 중요한 지표로 사용된다. 뇌출혈 주변조직에서 이러한 c-Fos와 Bax 양성반응 세포에 대한 영향을 관찰한바, 보양환오탕을 투여한 군은 Control군에 비하여 c-Fos 발현이 매우 유의하게 감소하였으며, 뇌출혈이 유발된 대뇌반구의 선조체 주변 대뇌피질에서도 c-Fos 양성반응 세포가 유의하게 감소하였다. 또한 보양환오탕을 투여한 군의 뇌출혈 주변조직에서 Bax 양성반응 세포 역시 유의하게 억제하였다.
- 뇌출혈 주변조직에서 호중구 침윤을 관찰하기 위해 동일한 일정면적의 조직에서 MPO의 형광염색에 양성반응을 보이는 세포 수를 측정한 결과, Control군은 64.3±7.2 개가 관찰되었으며 이에 비하여 보양환오탕 투여군은 45.2±4.9개가 관찰되어 호중구 침윤이 유의성 (p <0.05) 있게 감소하였다(Fig. 4).
- 뇌출혈을 유발한 흰쥐에 보양환오탕을 투여한 후 뇌출혈 크기를 측정한 결과, Control군은 30.2±1.5 mm3이었으며, 이에 비하여 보양환오탕투여군은 24.0±1.4 mm3로 뇌출혈 크기가 유의하게 (p <0.01) 감소하였다(Fig. 1, 2).
- 뇌출혈을 유발한 흰쥐에 보양환오탕을 투여한 후 정상측 대뇌반구와 출혈측 대뇌반구의 면적 (Table 2에 제시)으로부터 뇌부종 비율을 측정한 결과, Control군은 117.3±1.3%로 증가하였으며, 이에 비하여 보양환오탕을 투여한 군은 112.7±1.8%로 증가하여 뇌부종 비율이 유의성 (p <0.05) 있게 감소하였다(Table 2, Fig. 3).
- 뇌출혈을 유발한 흰쥐에 보양환오탕을 투여한 후 출혈측 대뇌반구 뇌출혈 주변부 일정면적에서 c-Fos 면역염색에 양성반응을 나타낸 세포 수를 측정한 결과 Control군은 42.5±4.1 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 보양환오탕을 투여한 군은 20.2±2.2개가 관찰되어 매우 유의성 (p <0.001) 있는 감소를 나타내었다 (Fig. 6-A-1, 6-A-2, 6-B).
- 뇌출혈을 유발한 흰쥐에 보양환오탕을 투여한 후 출혈측 대뇌반구에서 iNOS 발현을 관찰한 결과, Control군은 선조체내 collagenase 주입에 의하여 조직이 손상되고 출혈이 일어난 부위에서 높은 강도의 iNOS 발현이 관찰되었으며 (Fig. 5-1), 보양환오탕을 투여한 군은 Control군에 비해 iNOS 발현 면적이 감소한 경향을 나타내었으나 염색강도는 변화가 없었다(Fig. 5-2).
- 보양환오탕은 뇌출혈 크기를 대조군에 비해서 유의하게 감소시켰으며, 뇌출혈에 의한 뇌부종 또한 대조군에 비해서 유의하게 감소시켰다. 뇌출혈 주변부에서 보양환오탕은 MPO 양성반응 호중구 침윤을 유의하게 억제하였으며, iNOS 발현을 감소시켰다.
- 또한 뇌출혈 후 바로 발생하는 뇌부종은 뇌압을 증가시키고 뇌조직의 herniation을 유발하여 사망을 초래할 수 있다22). 보양환오탕이 뇌출혈에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 관찰한 바 Control군에 비해 뇌부종 비율이 유의성 있게 감소하였다. 이러한 결과들을보건대 보양환오탕이 뇌출혈에 의한 직접적인 손상과 BBB 파괴로 인한 뇌부종을 억제하는 효능이 있다고 사료된다.
- 본 실험의 결과들을 종합하면, 보양환오탕은 콜라겐분해효소에 의한 뇌출혈과 그에 따른 뇌부종을 억제하는 효능이 있었으며, 호중구의 활성을 감소시켜 뇌출혈로 인한 염증반응을 억제하며 c-Fos와 Bax 및 HSP72 발현을 억제하여 뇌출혈에 따른 주변조직의 신경세포 사멸을 억제하는 효능이 있는 것으로 사료된다.
- 뇌부종과 iNOS와의 직접적인 상관관계는 아직 밝혀 지지 않았으나 iNOS는 nitric oxide (NO)를 합성하는데 필요한 효소이며 이때 생성된 NO는 peroxynitrite를 생성하여 세포독성으로 작용함과 동시에 호중구의 MPO 작용을 통하여 reactive oxidant를 생성하여 염증반응의 촉진과 조직손상에 관여한다30). 본 연구에서 뇌출혈 부위와 그 주변부의 iNOS 발현을 관찰한 결과, 보양환오탕을 투여한 군은 Control군에 비해 염색강도는 변화가 없었으나 iNOS 발현 면적은 감소한 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 보건데 보양환오탕이 뇌출혈 부위뿐만 아니라 출혈이 발생한 조직의 호중구나 다른 염증세포의 활동을 억제하는 작용이 있는 것으로 사료된다.
- 동물실험상 뇌경색이 발생한 주변부에서 HSP72 mRNA와 단백질 발현이 증가하여 신경세포의 스트레스 손상을 판별하는 지표로 사용된다39,40). 이러한 HSP72 양성반응 세포를 면역조직화학염색으로 뇌출혈 주변조직에서 관찰한 결과, 보양환오탕을 투여한 군은 Control군에 비하여 매우 유의성 있는 감소를 나타내어 보양환오탕이 뇌출혈에 의한 신경세포 손상을 억제하는 효능이 있음을 유추할 수 있었다.
- MPO는 H2O2와 반응하여 강력한 살균작용을 발휘하며28,29) 주로 호중구에서 발현되므로 호중구의 면역염색 표식자로 활용되고 있다. 이러한 MPO에 양성반응을 나타내는 호중구의 침윤을 뇌출혈 주변조직에서 관찰한 결과, 보양환오탕은 호중구의 침윤을 유의하게 감소시켰다. 보양환오탕이 뇌출혈 주변조직에서 MPO 활성을 억제하는 항염증 작용이 뇌출혈에 따른 뇌부종을 억제하는 작용기전으로 사료된다.
- 보양환오탕이 뇌출혈에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 관찰한 바 Control군에 비해 뇌부종 비율이 유의성 있게 감소하였다. 이러한 결과들을보건대 보양환오탕이 뇌출혈에 의한 직접적인 손상과 BBB 파괴로 인한 뇌부종을 억제하는 효능이 있다고 사료된다.
- 이러한 결과로 보아, 보양환오탕은 뇌출혈과 그에 따른 뇌부종을 감소시키는 효능이 있으며, 이는 뇌출혈 주변부의 호중구 침윤 억제를 통한 항염증 작용과 세포자연사 억제를 통한 신경세포 보호 기전에 의한 것으로 사료된다.
- 콜라겐분해효소는 세포외기질과 혈관의 기저막을 분해하므로 혈관이 파열되어 뇌조직 출혈이 일어남과 동시에 출혈 주변부의 BBB를 파괴하고 뇌부종을 유발한다19). 이러한 콜라겐분해효소에 의한 뇌출혈 유발 후 3일간 보양환오탕을 투여하고 뇌출혈 크기를 측정한 결과, 보양환오탕을 투여한 군은 Control군에 비해 뇌출혈 크기가 유의성 있게 감소하였다. 또한 뇌출혈 후 바로 발생하는 뇌부종은 뇌압을 증가시키고 뇌조직의 herniation을 유발하여 사망을 초래할 수 있다22).
- 뇌출혈 주변부에서 보양환오탕은 MPO 양성반응 호중구 침윤을 유의하게 억제하였으며, iNOS 발현을 감소시켰다. 이외에도 보양환오탕은 뇌출혈 주변부와 대뇌피질의 c-Fos 양성반응 세포 증가를 유의하게 억제하였으며, 뇌출혈 주변부에서 Bax 양성반응과 HSP72 양성반응 세포 증가를 대조군에 비해서 유의하게 억제하였다.
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