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문제 정의
- 본 연구는 보양환오탕의 신경손상 모델에서의 재생반응성을 조사하기 위하여 좌골신경 압박손상 및 절단 후 재연결 기간 동안에 한약을 투여하여 나타나는 변화를 관찰하였다.
- 이러한 과정에서 Cdc2 단백질의 생성수준이 강하게 그러나 일시적으로 유도되며 이는 축삭의 재생과정에 관여함이 알려져 있다7). 본 연구에서는 말초신경 손상 부위에서 시간경과에 따른 Cdc2 단백질의 생성수준의 변화를 western blotting 실험을 통하여 조사하였다. 손상을 가하지 않은 대조군에서 단백질 생성은 전혀 검출되지 않은 반면, 식염수나 보양환오탕을 처리한 신경손상군에서 단백질 생성이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다.
- 슈반세포는 손상부위에서 활성화하고 축삭과의 상호작용을 통하여 축삭의 재성장을 촉진할 수 있다. 본 연구에서는 슈반세포 재생인자로 규명된 Cdc2 kinase의 생성수준의 변화를 분석하였다. Cdc2 kinase는 말초신경 손상 후 손상부위의 슈반세포에서 일시적으로 높은 수준의 생성을 나타내며 슈반세포의 이주활동의 촉진을 통하여 축삭재생 반응성에 기여함이 보고된 바 있다8).
- 좌골신경 손상 후 또는 말초신경의 절단 후 4주간 신경의 연결이 차단될 경우 이것이 후속적 재연결 반응성에서 축삭의 연결성 반응이 어떻게 나타날 것인지와 이러한 축삭의 재연결 반응시 한약 보양환오탕의 재생에 대한 효능성에 대하여 조사하였다.
- 손상 및 신경손상을 가한 좌골신경에서 Cdc2 단백질 생성분석에 대한 Western blot 결과. 하단의 Actin 단백질에 대한 western blotting 결과는 sample의 loading control의 목적으로 시행하였다.
제안 방법
- (i) Sciatic nerve transection 후 saline 5주 경구투여군 (ii) Sciatic nerve transection 후 보양환오탕 5주 경구투여 (iii) Sciatic nerve transection 후 saline 6주 경구투여군 (ii) Sciatic nerve transection 후 보양환오탕 6주 경구투여 실험군으로 나누어 진행하였다. 각 그룹의 실험동물은 transection 4주 후, 다시 접합하여 1주간~2주간 회복기간을 두었다.
- (i) Sciatic nerve 손상 후 saline 5주 경구투여군 (ii) Sciatic nerve 손상 후 보양환오탕 (400 mg/kg) 5주 경구투여군 (iii) Sciatic nerve 손상 후 saline 6주 경구투여군 (iv) Sciatic nerve 손상 후 보양환오탕 (400 mg/kg) 6주 경구투여군 실험군으로 나누어 진행하였다.
- NF-200에 의한 축삭과 S100β에 의한 슈반세포를 확인하였으며, 손상 근위부 및 원위부의 슈반세포를 포함한 비신경세포는 Hoechst 33258 핵염색에 의하여 확인하였다.
- (i) Sciatic nerve transection 후 saline 5주 경구투여군 (ii) Sciatic nerve transection 후 보양환오탕 5주 경구투여 (iii) Sciatic nerve transection 후 saline 6주 경구투여군 (ii) Sciatic nerve transection 후 보양환오탕 6주 경구투여 실험군으로 나누어 진행하였다. 각 그룹의 실험동물은 transection 4주 후, 다시 접합하여 1주간~2주간 회복기간을 두었다.
- 고형 사료와 물을 어떠한 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22-24℃, 습도는 50±10%가 유지되도록 하고, 조명은 밤낮주기 (12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다.
- 그 다음 각 sample에 대한 단백질을 정량하였으며, 그 중 10 μg 단백질을 western blot 분석에 사용하였다.
- 좌골신경 절단 4주 후, 신경을 재접합하여 1주 및 2주 동안 재성장을 유도하였다. 그 다음 좌골신경 조직에 대한 조직학적 및 생화학적 분석을 실시하였다.
- 5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰 하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 이미지를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 일차항체는 NF200 (1:400, sigma)와 S100β (1:1000, Dako) 이었다.
- 25% Hoechst 33258 염료를 함유한 PBST 용액으로 처리 후 다시 PBST 용액으로 세척하였다. 두 번째 antibody는 빛에 민감하기 때문에 반응 시간동안 반드시 암실에서 수행하였다. 모든 조직 sample은 형광현미경 (Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰되어지고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop(version 5.
- 두 번째로 말초신경의 절단 후 4주간 신경의 연결이 차단될 경우 이것이 후속적 재연결 반응성에서 축삭의 연결성 반응이 어떻게 나타날 것인지에 대하여 조사하였다. 이러한 축삭의 재연결 반응시 한약 보양환오탕의 재생에 대한 효능성에 대하여 조사하였다.
- 그 다음 membrane을 씻어내고 goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) 또는 anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase 를 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 처리 하고 다시 한 번 씻어냈다. 마지막으로 membrane에 부착된 단백질을 western blotting detection system을 이용하여 측정하였으며 Kodak Scientific Imaging Film (Eastman Kodak Co., USA)에 감광 하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody (1:4,000, Cell signaling), monoclonal anti-cdc2 (1:2,000, Santa Cruz), GAP43(1:2,000, Santa Cruz), Mouse-actin (1:10,000, MP bio) 등 이었다.
- 면역형광조직은 Nikon 형광현미경을 이용하여 분석한 후 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다. 중첩이미지는 Photoshop 프로그램 상의 image blend 모드를 이용하여 분석하였다.
- 두 번째 antibody는 빛에 민감하기 때문에 반응 시간동안 반드시 암실에서 수행하였다. 모든 조직 sample은 형광현미경 (Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰되어지고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop(version 5.5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰 하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 이미지를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다.
- 보양환오탕 (144 g)을 증류수 1,000 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치 (Rotary evaporator, Buchi B-480, Switzerland)로 농축하고, 이를 다시 동결 건조기 (Freeze dryer, Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동 (-84℃) 보관하면서 적당한 농도로 생리식염수로 희석하여 사용하였다. 수율은 보양환오탕 144 g으로부터 12.
- 본 실험에서 좌골신경의 절단 후 4주간 원위부신경을 분리시킴으로서 슈반세포를 비롯한 잠재적 재생보고인자들의 역할을 제한하는 방법에 적용하였으며, 이러한 조건하에 보양환오탕의 처리가 원위부로의 축삭의 성장 반응성에 어떠한 효과를 나타내는지 관찰하였다. 식염수를 처리한 손상의 대조군의 경우 약한 수준의 축삭 재성장의 반응성이 관찰되었다.
- 좌골신경손상 (sciatic nerve injury; SNI)을 가한 후 다음날부터 5주간 보양환오탕 (BYHOT)을 구강주입 하였으며, 신경조직에 대한 NF-200 및 S100β에 대해 면역형광염색 실시하였다. 신경조직의 핵은 Hoechst 33258을 이용하여 염색 후 파란색으로 확인하였다.
- 실험에 사용한 동물은 표준관리지침에 의거하여 관리하며, 사용 개체 수는 가급적 최소화하여 불필요한 동물희생을 막는 방식으로 진행하였다.
- 쥐의 sciatic nerve는 cryostat를 이용하여 20μm의 두께로 잘라 슬라이드에 부착시켰다. 이중 면역형광 염색법(double immunofluorescence staining)을 수행하기 위해, 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 혼합된 인산 완충용액 (phosphate buffered saline; PBS)에 45분 동안 슬라이드를 넣어 조직을 고정하였다. 비특이적 결합을 막기 위해 blocking buffer에 담근 후 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.
- 5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse (green)와 Rhodamine-goat anti-rabbit antibody (Molecular probes)를 1:100으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 이차항체 처리를 수행하였다. 이차항체 처리 후 3회에 걸쳐 PBST로 세척을 수행하였다. Hoechst 핵 염색을 수행하는 경우 2회 세척 후 0.
- 5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 1:500에 비율로 혼합하여 처리한 후 실온에서 4시간 동안 반응시킨다. 일차항체 반응이 끝난 후 PBST (PBS plus 0.1% triton X-100)로 조직을 씻어내고, 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse (green)와 Rhodamine-goat anti-rabbit antibody (Molecular probes)를 1:100으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 이차항체 처리를 수행하였다. 이차항체 처리 후 3회에 걸쳐 PBST로 세척을 수행하였다.
- 좌골신경 손상 후 또는 말초신경의 절단 후 4주간 신경의 연결이 차단될 경우 이것이 후속적 재연결 반응성에서 축삭의 연결성 반응이 어떻게 나타날 것인지와 이러한 축삭의 재연결 반응시 한약 보양환오탕의 재생에 대한 효능성에 대하여 조사하였다.
- 좌골신경을 절단 후 다음날부터 5주-6주 동안 보양환오탕을 구강투여하거나 식염수를 투여하였다. 좌골신경 절단 4주 후, 신경을 재접합하여 1주 및 2주 동안 재성장을 유도하였다. 그 다음 좌골신경 조직에 대한 조직학적 및 생화학적 분석을 실시하였다.
- 좌골신경 절생은 압좌손상과 동일부위에서 신경절단 후 분리신경 말단을 근육부위에 봉합 시술하였다. 지정된 날짜 경과 후 절단된 분리신경의 말단부위를 얇은 2개의 근막조직사이에 조심스럽게 연접 위치한 후 재접합을 하였다.
- 좌골신경손상 (sciatic nerve injury; SNI)을 가한 후 다음날부터 5주간 보양환오탕 (BYHOT)을 구강주입 하였으며, 신경조직에 대한 NF-200 및 S100β에 대해 면역형광염색 실시하였다.
- 좌골신경손상 (sciatic nerve injury; SNI)을 가한 후 다음날부터 6주간 보양환오탕 (BYHOT)을 구강주입 하였으며, 신경조직에 대한 NF-200 및 S100β에 대해 면역형광염색을 실시하였다.
- 좌골신경에 압좌손상을 가한 후 5주간 보양환오탕을 투여 후 식염수를 처리한 대조군과 축삭재생 반응성을 비교분석하였다. 손상 근위부와 손상 부위 그리고 원위부를 포함하는 좌골신경의종단 section에 대한 면역형광연색 결과가 Fig.
- 좌골신경을 절단 후 다음날부터 5주-6주 동안 보양환오탕을 구강투여하거나 식염수를 투여하였다. 좌골신경 절단 4주 후, 신경을 재접합하여 1주 및 2주 동안 재성장을 유도하였다.
- 좌골신경의 손상은 Rat의 대퇴중앙부에서 신경 노출 후 핀셋으로 30초간 2회 압박손상을 주어 유도하였다.
- 좌골신경 절생은 압좌손상과 동일부위에서 신경절단 후 분리신경 말단을 근육부위에 봉합 시술하였다. 지정된 날짜 경과 후 절단된 분리신경의 말단부위를 얇은 2개의 근막조직사이에 조심스럽게 연접 위치한 후 재접합을 하였다.
- 첫 번째로 좌골신경에 압좌손상을 가한 후 4주의 기간에 걸쳐 보양환오탕 추출물을 경구투입 한 결과를 조사하였다. 일반적으로 말초신경은 손상후 상당 수준 축삭의 자생적 재생이 진행되기 때문에 손상 부위 및 손상 후 원위부에서는 식염수를 주입한 대조군과의 재생수준의 변화를 확인할 수 없었다.
대상 데이터
- 7주 Sprague-Dawley(SD) 수컷 흰쥐 (대한바이오링크 회사에서 구입)를 실험 대상으로 하였다. 고형 사료와 물을 어떠한 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22-24℃, 습도는 50±10%가 유지되도록 하고, 조명은 밤낮주기 (12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다.
- , USA)에 감광 하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody (1:4,000, Cell signaling), monoclonal anti-cdc2 (1:2,000, Santa Cruz), GAP43(1:2,000, Santa Cruz), Mouse-actin (1:10,000, MP bio) 등 이었다.
- 본 실험에 사용한 일차항체는 NF200 (1:400, sigma)와 S100β (1:1000, Dako) 이었다.
데이터처리
- 면역형광조직은 Nikon 형광현미경을 이용하여 분석한 후 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다. 중첩이미지는 Photoshop 프로그램 상의 image blend 모드를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 신경 손상 후 5-6주 후 축삭재생과정에서 슈반세포에서 유도 생성되는 것으로 알려진 Cdc2 kinase 단백질의 생성수준을 western blotting 방법을 통하여 조사하였다. Fig.
- 축삭재생 반응성에 대한 생체인자의 생성수준의 변화를 조사하기 위하여 손상 후 슈반세포에서 생성이 증가하는 것으로 알려진 Cdc2 kinase 단백질의 생성변화를 western blotting에 의하여 분석하였다. Fig.
성능/효과
- 4주 신경손상 분리기간과 재접합 2주 동안 보양환오탕을 구강투여 한 결과 재생축삭은 상당수준 손상 원위부로 확장되고 있음을 나타내었다(Fig. 6A). 영역내에 Hoechst 33258에 의한 비신경세포의 핵염색을 실시한 결과 세포들이 높은 밀도로 유입되었음을 나타내고 있다.
- S100β 염색은 두 집단간 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며, Hoechst 핵염색은 보양환오탕 처리군에서 대조군보다 많은 숫자의 핵염색 수치를 나타내었다 (Fig. 2).
- 일반적으로 말초신경은 손상후 상당 수준 축삭의 자생적 재생이 진행되기 때문에 손상 부위 및 손상 후 원위부에서는 식염수를 주입한 대조군과의 재생수준의 변화를 확인할 수 없었다. 그러나 손상 6주 후 보다 원위부에서 재생 반응성을 조사한 결과 식염수 대조군에 비하여 축삭의 재생이 보다 뚜렷하게 진행됨됨을 확인 할 수 있었다.
- 1 에 나타나 있다. 두 실험군에 대한 NF-200 단백질에 대한 면역형관염색에 의한 축삭의 재성장을 비교한 결과 손상 원위부 1 cm 거리까지 재생이 충분이 이루어 졌으며, 뚜렷한 차이점은 관찰되지 않았다. 마찬가지로 신경조직상에 존재하는 슈반세포의 지표단백질인 S100β에 대한 염색결과와 핵염색 (Hoechst 33259 염색)은 두 실험군간에 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다.
- Cdc2 kinase는 말초신경 손상 후 손상부위의 슈반세포에서 일시적으로 높은 수준의 생성을 나타내며 슈반세포의 이주활동의 촉진을 통하여 축삭재생 반응성에 기여함이 보고된 바 있다8). 본 연구에서 손상좌골신경 조직에서 Cdc2의 생성수준은 식염수 척리한 손상대조군에 비하여 뚜렷한 양적 변화를 나타내지 않았다. 이는 손상 후 일정기간 경과 후에는 슈반세포에서의 재생관련 역할이 보양환오탕의 처리에 의하여 조절을 받고 있지 않음을 시사한다.
- 7에 나타난 바와 같이 손상을 가하지 않은 신경조직에서는 Cdc2 단백질은 전혀 생성되지 않았으나 손상을 가한 조직에서는뚜렷한 생성을 나타내었다. 손상 6주후 생리용액투입 대조군에서 증가된 생성을 나타내었으며, 약재처리군은 낮은 수준의 생성을 나타내었다.
- 영역내에 Hoechst 33258에 의한 비신경세포의 핵염색을 실시한 결과 세포들이 높은 밀도로 유입되었음을 나타내고 있다. 손상 인접원위부에서 축삭의 재성장은 뚜렷이 관찰되었으며 슈반세포 역시 유사한 분포로 신경조직이 존재하는 것이 확인되었다 (Fig. 6B).
- 본 연구에서는 말초신경 손상 부위에서 시간경과에 따른 Cdc2 단백질의 생성수준의 변화를 western blotting 실험을 통하여 조사하였다. 손상을 가하지 않은 대조군에서 단백질 생성은 전혀 검출되지 않은 반면, 식염수나 보양환오탕을 처리한 신경손상군에서 단백질 생성이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 식염수 처리군과 비교하여 보양환오탕 처리군은 단백질 생성수준에서 차이를 나타내지 않았다.
- 슈반세포의 표지단백질인 S100β는 NF-100에의한 축삭신호의 분포와 유사한 양상을 나타내었으며 비신경세포의 핵 수치는 손상 원위부에서 다소 증가하는 것으로 확인되었다 (Fig. 4).
- 좌골신경에 압좌 손상을 가하고 6주간 보양환오탕을 투여한 결과 손상 원위부 2 cm 거리까지축삭재생이 상당 수준 진행됨을 확인하였다. 식염수 대조군에 비하여 보양환오탕 처리군이 보다 뚜렷한 신경섬유의 연결성을 관찰할 수 있었다. S100β 염색은 두 집단간 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며, Hoechst 핵염색은 보양환오탕 처리군에서 대조군보다 많은 숫자의 핵염색 수치를 나타내었다 (Fig.
- 3에 나타낸 바와 같이 아무런 처리를 하지 않은 신경조직에서는 생성되지 않았으나 손상 조직에서는 뚜렷한 생성을 나타내었다. 이 결과로 보아 손상 5주 및 6주의 장기간 경과 후에는 약재의 효능성은 자생적 축삭재생의 진행에 의하여 작용 특이성을 구분하는 것이 분명하지 않은 것으로 생각된다.
- 그러나 식염수 처리군과 비교하여 보양환오탕 처리군은 단백질 생성수준에서 차이를 나타내지 않았다. 이상의 결과로 보아 손상 5주 및 6주의 장기간 경과 후에는 약재의 효능성은 자생적 축삭재생의 진행에 의하여 작용특이성을 구분하는 것이 분명하지 않은 것으로 판단된다.
- 식염수를 처리한 손상의 대조군의 경우 약한 수준의 축삭 재성장의 반응성이 관찰되었다. 이후 보양환오탕의 처리는 축삭재성장에 양성적 요인으로 작용함을 관찰할 수 있었다.
- 좌골신경에 압좌 손상을 가하고 6주간 보양환오탕을 투여한 결과 손상 원위부 2 cm 거리까지축삭재생이 상당 수준 진행됨을 확인하였다. 식염수 대조군에 비하여 보양환오탕 처리군이 보다 뚜렷한 신경섬유의 연결성을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 보양환오탕이 어떠한 기전적 근거하에 축삭의 재성장을 촉진할 수 있는가에 대해서는 후속연구가 필요하겠으나 손상 원위부의 슈반세포의 활성화를 잠재적 인자로 고려할 수 있을 것이다. 슈반세포는 손상부위에서 활성화하고 축삭과의 상호작용을 통하여 축삭의 재성장을 촉진할 수 있다.
- 이는 손상 후 일정기간 경과 후에는 슈반세포에서의 재생관련 역할이 보양환오탕의 처리에 의하여 조절을 받고 있지 않음을 시사한다. 허혈에 따른 신경계세포 및 여러 종류의 비신경세포에 대한 보호효과를 나타내는 것으로 알려진 보양환오탕에 대한 후속 연구를 통하여 축삭 재성장을 촉진할 수 있는 관련 생체인자를 규명함으로서 한약에 대한 기전적 근거를 확보할 수 있을 것으로 사료된다.
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