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문제 정의
- 또한, 간세포에서 과산화수소와 같은 산화적 스트레스에 대한 작약의 간세포 보호 효능에 대한 연구가 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 작약 열추출물의 활성산소에 대한 간세포 보호 효능의 메카니즘을 조사하기 위하여, 마우스의 일차 간세포를 이용하여 과산화수소에 대한 작약 열추출물의 간세포 보호 효능을 확인하였고 이러한 간세포 보호 효능에 HO-1과 HSP72와 같은 유전자가 관여한다는 사실을 규명하였다.
- 이와 같이 작약의 간 손상에 대한 보호 효과가 여러 연구를 통하여 보고되고 있으나, 간 보호 효과에 대한 항산화 효능 이외의 메카니즘은 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 흰쥐에서 분리한 간세포를 이용하여 활성산소인 과산화수소에 대한 작약의 간 보호 효능의 기작을 연구하고자 하였고, 그 결과, HO-1와 HSP72 유전자의 관련성에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 또한 HSP72는 샤페론 단백질의 일종으로, 병리적, 환경적, 그리고 대사적 스트레스에 대하여 단백질의 3차원 구조를 유지시켜주는 기능을 수행함으로써 스트레스에 대한 세포의 손상을 최소화하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 11,12). 본 연구에서는 과산화수소로 인한 간독성에서 작약 열추출물의 간보호 효능에 이들 유전자의 관련성을 확인하였다. 마우스 일차 간세포에 작약 열추출물을 1 시간 동안 전 처리 한 후, 과산화수소를 4 시간동안 처리하였다.
- 본 연구에서는 작약에서 추출한 열수 추출물의 간 보호 효능에 대하여 조사하기 위하여, 마우스의 일차 간세포를 이용하여 실험하였다. 그 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 경우, 활성산소의 활성이 현저히 감소되었고, 항산화제인 CAT의 발현이 증가되었다.
제안 방법
- 300 μg/ml의 농도에서 가장 높은 생장률을 확인하였고, 따라서 이후 실험에서는 300 μg/ml의 작약 열추출물로 실험을 진행하였다.
- ALT, AST 및 LDH의 측정은 세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 측정하였다. ALT, AST의 활성은 ChemiLab ALT and AST assay kits (IVD Lab Co.
- HO-1 및 HSP72에 대한 siRNA (Bioneer)를 마우스 일차 간세포에 HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen)을 이용하여 transfection 시켰다.
- Berry와 Friend의 방법을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. ICR 마우스에 졸레틸과 럼푼을 복강 내로 주사하여 마취한 후 개복하였으며, 간문맥에 24 guage catheter를 삽관하여 Krebs-Ringer-HEPES 완충용액으로 관류시키고 collagenase (sigma, USA)로 구성된 소화용액을 순환 시켰다. 간막을 벗겨 간세포가 유리시킨 후 nylon mesh를 사용하여 여과하였다.
- Total RNA를 easy-spin™ Total RNA Extraction Kit (intron)을 이용하여 분리한 후, Qiagen Omniscript RT kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- ICR 마우스에 졸레틸과 럼푼을 복강 내로 주사하여 마취한 후 개복하였으며, 간문맥에 24 guage catheter를 삽관하여 Krebs-Ringer-HEPES 완충용액으로 관류시키고 collagenase (sigma, USA)로 구성된 소화용액을 순환 시켰다. 간막을 벗겨 간세포가 유리시킨 후 nylon mesh를 사용하여 여과하였다. 여과액은 400 rpm에서 3분간 원심분리 한 후 상등액을 버리고 침전된 간세포를 BSA (sigma, USA)가 포함된 완충용액에 현탁 시켜 다시 원심 분리하였다.
- 과산화 수소에 의한 세포사멸을 작약 열추출물을 전 처리하였을 경우 억제되는지 확인하기 위하여 DNA fragmention을 진행하였다. 작약 열추출물을 1 시간 전 처리 한 후 1 mM의 과산화수소를 24 시간동안 처리한 후 genomic DNA를 확보하고 전기영동한 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 샘플의 DNA fragmenation이 과산화수소 단독처리한 경우에 비해 현저히 감소되어 있음을 확인하였다(Fig.
- 과산화수소에 의한 세포 독성이 작약의 전 처리에 의해 감소되는지 MTT assay 방법으로 세포생장률을 확인하였다. 작약 열추출물을 1 시간동안 마우스의 일차 간세포에 전 처리 한 후 1 mM의 과산화수소를 24 시간동안 처리하였다.
- 작약 열추출물을 전 처리 하였을 경우, 과산화수소로 유발되는 간세포의 독성이 감소되는지 확인하였다. 마우스의 일차 간세포에 작약 열추출물을 1 시간동안 전 처리하고 과산화수소를 4 시간동안 처리한 후 세포 배양액을 수거하여 간세포 독성 및 세포독성의 지표인 ALT, AST 및 LDH의 량을 조사하였다(Fig. 3). 그 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 샘플군에서 과산화수소로 인한 ALT, AST 및 LDH의 발생량이 감소됨을 알 수 있었고, 이러한 결과는 작약 열추출물이 과산화수소로 인해 발생하는 간세포 독성을 감소시킴을 나타낸다.
- 세포에 2‘,7’-Dichlorofluorescein diacetate (DCF) (Invitrogen) 용액을 첨가하여 30 분간 처리하였다.
- 세포에 PRO-PREP™ Protein Extraction Solution (intron)을 처리하여 단백질을 확보하고, 12% SDS-PAGE를 진행하였다.
- 세포에 2‘,7’-Dichlorofluorescein diacetate (DCF) (Invitrogen) 용액을 첨가하여 30 분간 처리하였다. 이후, 트립신으로 세포를 원심분리기를 사용하여 분리한 뒤, PBS 300㎕에 현탁한 세포를 이용하여 FACS analysis (BD Immunocytometry Systems)를 실시하였다.
- 과산화수소에 의한 세포 독성이 작약의 전 처리에 의해 감소되는지 MTT assay 방법으로 세포생장률을 확인하였다. 작약 열추출물을 1 시간동안 마우스의 일차 간세포에 전 처리 한 후 1 mM의 과산화수소를 24 시간동안 처리하였다. Fig.
- 작약 열추출물을 1 시간동안 전 처리 한 후 세포에 과산화수소를 1 mM로 처리하고 24 시간 배양 후 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (promega)를 이용하여 genomic DNA를 확보하여 1% agarose gel에서 전기영동 하였다.
- HO-1 및 HSP72 siRNA를 세포에 transfection 시킨 후 24 시간동안 배양하였다. 작약 열추출물을 1 시간동안 전처리하고 1 mM 과산화수소를 24 시간동안 처리한 후 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, HO-1 및 HSP72에 대한 siRNA를 처리한 샘플군이 siRNA를 처리하지 않은 샘플군에 비해 세포생장률이 현저히 감소되었다.
- 작약 열추출물을 1시간동안 전처리 한 후 세포에 과산화수소를 1 mM로 처리하고 24 시간 배양 후 MTT 시약을 첨가하여 30 분 배양하였다. 배양액을 제거한 후 배양접시의 각 well에 DMSO를 150 ㎕씩 첨가하여 10 분정도 흔들어 준 뒤 ELISA reader를 이용하여 wave length 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
- 작약 열추출물을 전 처리 하였을 경우, 과산화수소로 유발되는 간세포의 독성이 감소되는지 확인하였다. 마우스의 일차 간세포에 작약 열추출물을 1 시간동안 전 처리하고 과산화수소를 4 시간동안 처리한 후 세포 배양액을 수거하여 간세포 독성 및 세포독성의 지표인 ALT, AST 및 LDH의 량을 조사하였다(Fig.
- 작약 열추출물의 전 처리에 의해 증가된 HO-1과 HSP72 단백질이 과산화수소에 의한 간독성을 억제시키는지 확인하기 위하여, siRNA를 이용하여 확인하였다(Fig. 7). HO-1 및 HSP72 siRNA를 세포에 transfection 시킨 후 24 시간동안 배양하였다.
- 작약 열추출물의 활성산소 물질의 생성 억제효과를 확인하기 위하여 마우스의 일차 간세포에 열추출물을 전 처리한 후 과산화수소를 4 시간 동안 처리하였고 FACS를 이용하여 세포내 활성산소의 발생량을 측정하였다. 그 결과, 과산화수소에 의해 유발되는 활성산소는 작약 열추출물의 전 처리에 의해 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 작약 열추출물이 과산화수소에 의한 활성산소의 억제와 함께 항산화제 효소의 발현을 조절하는지 확인하기 위하여, real time PCR 방법으로 catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) 및 superoxide dismutase (SOD) 유전자 발현을 확인하였다. 마우스 일차 간세포에 작약 열추출물을 1 시간동안 전 처리후 과산화수소를 4 시간동안 처리한 후 total RNA를 분리하였다.
- 본 실험에서 사용한 작약은 영천현대약업사 (경북 영천시 완산동 925-15)에서 구입하였다. 전탕추출법 (한국, 경서추출기 cosmos-660)에 의한 시험물질 조제를 실시하였으며 16.7 리터의 생수 (화이트, 경남 산청군 삼장면 덕교리 800)에 1 시간 동안 침적시킨 다음 180 분간 열탕 추출하였고, 동결건조기 (한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하였다.
- 프라이머 (actin-F, tggaatcctgtggcatccatgaaa; actin-R, taaaacgcagctcagtaacagtccg; CAT-F, ctcggtttcccgtgcaatcag; CAT-R, gtgcagccagtaatcaccaag; SOD-F, ggacctcattttaatcctcactctaag; SOD-R, tgcccaggtctccaacatg; GPx-F, tctgcagatacctgtgaactg; GPx-R, tagtcagggtggacgtcagtg; HO-1-F, aacaagcagaacccagtct; HO-1-R, tgrcatctccagagtgttc; HSP72-F, accaacgacaagggccgcct; HSP72-R, acttgtccagcaccttcttc)를 사용하여 94℃ 10분, [94℃ (10초), 50℃ (20초), 72℃ (30초)] * 40 cycles 분의 조건으로 real time PCR (Eco™ Real-Time PCR System, Illumina)을 진행하였다.
대상 데이터
- 배양액은 10% FBS (Hyclone), 500 U/ℓ insulin (Roche, Switzerland), 2mM L-glutamine (Lonza), 15 mM HEPES (Lonza, Switzerland), 105 U/ℓ penicillin, 100 mg/ℓ streptomycin (Gibco, USA)를 포함하는 William's E media (Gibco)를 사용하였으며, 일정한 온도와 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 CO2 5%의 혼합기체를 공급하여 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 작약은 영천현대약업사 (경북 영천시 완산동 925-15)에서 구입하였다. 전탕추출법 (한국, 경서추출기 cosmos-660)에 의한 시험물질 조제를 실시하였으며 16.
- 실험에 사용된 동물은 수컷 ICR 마우스 (오리엔트 바이오, 경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1) 5주령을 사용하였으며, 일주일간 시험을 실시하는 동물실에서 순화시키고 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 사용하였다. 실험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기 (점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
이론/모형
- ALT, AST 및 LDH의 측정은 세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 측정하였다. ALT, AST의 활성은 ChemiLab ALT and AST assay kits (IVD Lab Co. Ltd. Korea)를 사용하여 제공된 시험방법에 준하여 측정하였고, LDH는 Cytotoxicity detection kit (Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용하여 Colorimetric assay 방법으로 측정하였다.
- After 24 h, cells were pretreated with PL (300 μg/ml) for 1 h and then treated with 1 mM H2O2 for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. ** represents P < 0.
- 세포에 PRO-PREP™ Protein Extraction Solution (intron)을 처리하여 단백질을 확보하고, 12% SDS-PAGE를 진행하였다. 이들을 nitrocellulose membrane으로 transffer 한 후 actin 및 HO-1에 대한 항체 (santacruz)와 HSP72 (stressgen) 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다.
성능/효과
- 1 μg의 total RNA를 이용하여 cDNA를 제작한 후 real time PCR을 진행한 결과, GPx와 SOD 유전자는 유의성 있는 차이를 보이지 않았으나, CAT의 경우 작약 열추출물을 전 처리한 샘플군에서 현저히 증가됨을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 작약 열추출물을 1 시간동안 전처리하고 1 mM 과산화수소를 24 시간동안 처리한 후 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, HO-1 및 HSP72에 대한 siRNA를 처리한 샘플군이 siRNA를 처리하지 않은 샘플군에 비해 세포생장률이 현저히 감소되었다. 반면, negative control siRNA (NC)을 처리한 샘플군에서는 세포생장률이 감소되지 않았다.
- 작약 열추출물의 활성산소 물질의 생성 억제효과를 확인하기 위하여 마우스의 일차 간세포에 열추출물을 전 처리한 후 과산화수소를 4 시간 동안 처리하였고 FACS를 이용하여 세포내 활성산소의 발생량을 측정하였다. 그 결과, 과산화수소에 의해 유발되는 활성산소는 작약 열추출물의 전 처리에 의해 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 본 연구에서는 작약에서 추출한 열수 추출물의 간 보호 효능에 대하여 조사하기 위하여, 마우스의 일차 간세포를 이용하여 실험하였다. 그 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 경우, 활성산소의 활성이 현저히 감소되었고, 항산화제인 CAT의 발현이 증가되었다. 또한 산화스트레스에 대한 방어역할을 수행하는 것으로 알려져 있는 HO-1와 HSP72 유전자의 발현이 증가되었다.
- 3). 그 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 샘플군에서 과산화수소로 인한 ALT, AST 및 LDH의 발생량이 감소됨을 알 수 있었고, 이러한 결과는 작약 열추출물이 과산화수소로 인해 발생하는 간세포 독성을 감소시킴을 나타낸다.
- . 따라서 본 실험에서는 작약 열추출물에 의한 간세포 보호 효능에 HO-1 및 HSP72 유전자가 관여하는지 확인하기 위하여 real time PCR과 western blotting을 통하여 이들 유전자 및 단백질 발현을 확인 한 결과, 작약 열추출물의 전 처리한 샘플군에서 이들 유전자의 mRNA와 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 또한 siRNA 실험을 통하여 이들 유전자를 특징적으로 knock-down 시켰을 때 과산화수소에 의한 세포독성이 증가함을 확인하였다.
- 따라서 본 실험에서는 작약 열추출물에 의한 간세포 보호 효능에 HO-1 및 HSP72 유전자가 관여하는지 확인하기 위하여 real time PCR과 western blotting을 통하여 이들 유전자 및 단백질 발현을 확인 한 결과, 작약 열추출물의 전 처리한 샘플군에서 이들 유전자의 mRNA와 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 또한 siRNA 실험을 통하여 이들 유전자를 특징적으로 knock-down 시켰을 때 과산화수소에 의한 세포독성이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로, HO-1 및 HSP72 유전자가 과산화수소와 같은 산화적 스트레스에 대한 작약 열추출물에 의한 간세포 보호 효능에 중요한 역할을 수행하는 것을 추정할 수 있다.
- 6A). 또한 분리된 단백질을 이용하여 western blotting을 수행한 결과, 작약 열추출물 전 처리 샘플군에서 HO-1 및 HSP72 단백질이 현저히 증가됨을 관찰하였다(Fig. 6B).
- 이 방법을 이용하여 작약 열추출물의 전 처리 하였을 경우, 과산화수소로 인한 세포 생장률의 저해가 억제됨을 확인하였다. 또한, 간세포 독성의 지표로 사용하는 ALT, AST 및 LDH의 량을 측정한 결과, 작약 열추출물의 전 처리로 인하여 과산화수소에 의한 세포 독성이 현저히 감소됨을 알 수 있었다.
- 마우스 일차 간세포에 작약 열추출물을 1 시간 동안 전 처리 한 후, 과산화수소를 4 시간동안 처리하였다. 분리한 RNA에서 확보한 cDNA로 real time PCR을 진행한 결과, HO-1 및 HSP72의 유전자 발현이 작약 열추출물 샘플군에서 현저히 증가됨을 알 수 있었다(Fig. 6A). 또한 분리된 단백질을 이용하여 western blotting을 수행한 결과, 작약 열추출물 전 처리 샘플군에서 HO-1 및 HSP72 단백질이 현저히 증가됨을 관찰하였다(Fig.
- 실험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기 (점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
- MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법인데, 대사가 왕성한 세포를 확인할 수 있다. 이 방법을 이용하여 작약 열추출물의 전 처리 하였을 경우, 과산화수소로 인한 세포 생장률의 저해가 억제됨을 확인하였다. 또한, 간세포 독성의 지표로 사용하는 ALT, AST 및 LDH의 량을 측정한 결과, 작약 열추출물의 전 처리로 인하여 과산화수소에 의한 세포 독성이 현저히 감소됨을 알 수 있었다.
- 5). 이러한 결과로 작약 열추출물이 활성산소를 순화할 뿐만 아니라 마우스 일차 간세포내의 항산화 시스템을 증가시킴을 알 수 있다.
- 또한 siRNA 실험을 통하여 이들 유전자를 특징적으로 knock-down 시켰을 때 과산화수소에 의한 세포독성이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로, HO-1 및 HSP72 유전자가 과산화수소와 같은 산화적 스트레스에 대한 작약 열추출물에 의한 간세포 보호 효능에 중요한 역할을 수행하는 것을 추정할 수 있다.
- 작약 열추출물의 항산화 효능은 FACS analysis를 이용하여 확인하였는데, 과산화수소에 의한 세포내 활성산소 증가가 작약 열추출물 전 처리로 인하여 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 작약 열추출물의 활성산소 순화 효능뿐만 아니라 세포내 항산화 효소의 활성을 변화시키는지 real time PCR로 확인한 결과, GPx 및 SOD의 경우 유의성 있는 변화를 관찰하지 못하였으나, CAT의 경우, 작약 열추출물의 전 처리로 인하여 과산화수소 처리 샘플군에 비해 유의성 있는 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 t-BHP를 이용하여 간세포의 지질과산화반응 및 항산화효소 활성을 확인한 실험6)의 결과와 일치한다.
- 과산화 수소에 의한 세포사멸을 작약 열추출물을 전 처리하였을 경우 억제되는지 확인하기 위하여 DNA fragmention을 진행하였다. 작약 열추출물을 1 시간 전 처리 한 후 1 mM의 과산화수소를 24 시간동안 처리한 후 genomic DNA를 확보하고 전기영동한 결과, 작약 열추출물을 전 처리한 샘플의 DNA fragmenation이 과산화수소 단독처리한 경우에 비해 현저히 감소되어 있음을 확인하였다(Fig. 2).
- 작약 열추출물의 항산화 효능은 FACS analysis를 이용하여 확인하였는데, 과산화수소에 의한 세포내 활성산소 증가가 작약 열추출물 전 처리로 인하여 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 작약 열추출물의 활성산소 순화 효능뿐만 아니라 세포내 항산화 효소의 활성을 변화시키는지 real time PCR로 확인한 결과, GPx 및 SOD의 경우 유의성 있는 변화를 관찰하지 못하였으나, CAT의 경우, 작약 열추출물의 전 처리로 인하여 과산화수소 처리 샘플군에 비해 유의성 있는 증가를 확인하였다.
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