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문제 정의
- 본 실험은 MCF-7 인체 유방암 세포주에서 천화분의 항암효과 및 기전을 확인하고자 수행하였으며, 세포증식억제 확인을 위해 WST-1 assay를 시행하였고, FACS 및 western blot analysis를 이용하여 세포사멸, 세포주기변화 및 cell cycle 관련 인자와 caspase의 활성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 인체 유방암 세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 세포증식억제 및 기전, 혈관신생억제에 대한 효과를 알아보았다. 이에 세포증식억제와 관련된 apoptosis의 유발과 경로, 세포 주기의 변화 및 세포주기조절에 관련된 인자들의 단백질 변화 여부를 조사하였다.
- 이에 본 연구에서는 천화분의 에탄올 추출물을 MCF-7 human breast carcinoma cell에 처리하여 microscope, WST-1 assay, FACS, western blot analysis를 통해 관찰한 결과 세포 억제에 대한 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 인체 유방암 세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 세포증식억제 및 기전, 혈관신생억제에 대한 효과를 알아보았다. 이에 세포증식억제와 관련된 apoptosis의 유발과 경로, 세포 주기의 변화 및 세포주기조절에 관련된 인자들의 단백질 변화 여부를 조사하였다.
제안 방법
- 다음날 100 ㎕의 천화분을 각각의 농도(0 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖)에 맞게 넣어준 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 48시간 후 WST-1 solution을 10 ㎕씩 각각의 well에 넣고 2시간동안 배양한 후 물에 녹아져 나온 formazan (water-soluble formazan)을 ELISA reader 기기(Molecular devices, VersaMax microplate reader, USA)로 440 ㎚ 필터에서 값을 측정하였다.
- FACS 결과를 바탕으로 천화분에 의한 MCF-7 세포의 감소는 G2/M phase arrest가 apoptosis를 유발하여 감소된다는 사실을 알 수 있었으며, 이를 확인하기 위해 apoptosis 및 G2/M phase 관련 인자들을 western blot analysis를 통해 살펴보았다.
- flow analysis cytometry sorting (FACS)를 통해 세포사멸을 보기 위해 4×105의 세포를 60 ㎜ culture plate에 배양하고, 다음날 60 ㎍/㎖의 천화분을 처리한 후 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 3 ㎖의 95% ethanol(0.5% Tween-20 첨가)에 세포를 고정시켰다.
- /well로 6 well씩 8개의 群으로 깔아놓은 후 세포가 하루 동안 plate 바닥에 붙도록 배양한다. 다음날 100 ㎕의 천화분을 각각의 농도(0 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖)에 맞게 넣어준 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 48시간 후 WST-1 solution을 10 ㎕씩 각각의 well에 넣고 2시간동안 배양한 후 물에 녹아져 나온 formazan (water-soluble formazan)을 ELISA reader 기기(Molecular devices, VersaMax microplate reader, USA)로 440 ㎚ 필터에서 값을 측정하였다.
- 먼저 세포에 천화분을 농도별로 처리한 후 세포 모양에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다. 그 결과 천화분의 농도가 증가할수록 세포의 밀도도 낮아지며, apoptosis의 전형적인 모양인 apoptotic body를 세포 표면에 형성하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 먼저 천화분이 MCF-7 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 WST-1 assay와 microscope 관찰을 하였다. 그 결과 천화 분을 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되는 것을 WST-1 assay로 확인하였고, 농도가 증가할수록 세포의 부착력 상실이 늘어나고 apoptotic body가 나타나는 것을 현미경으로 확인하였는데, 이는 세포질의 응축으로 인해 세포의 부착력을 상실한 것으로, 세포질의 응축변화는 천화분 처리 후 1시간 만에도 눈으로 확인되었다.
- 48시간동안 샘플이 다 모아질 때까지 나머지 샘플은 -20℃에서 보관하였다. 샘플을 다 모은 후 에탄올에 고정시켜둔 세포는 차가운 PBS로 두 번 washing한 후 暗상태에서 10 ㎎/㎖ propidium iodide(이하 PI)로 염색하여 FACStar flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)와 ModFit LT V 2.0 software를이용하여 분석하였다.
- 1% Tween-20)로 상온에서 1시간 동안 blocking한 후, 여러 가지 1차항체를 4℃에서 over night(O/N)으로 반응시킨 후, PBST로 washing후 HRP-conjugated 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 역시 PBST를 사용하여 washing과정을 거친 다음에 Electrochemiluminescence detection system (AmershamPharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 이용하여 X -ray film으로 결과를 확인하였다.
- 이러한 차이를 수치로 나타내기 위해서 FACS 실험을 통한 PI 염색방법을 이용해 apoptosis 수치를 나타내는 subG1의 양의 변화를 확인해보았다. PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- Western blot analysis 결과, MCF-7 cell에 천화분(60 ㎍/ml) 처리 후 caspase-8은 변화가 없었으나, caspase-9는 12시간 후부터 활성이 미미하게 증가하는 것을 확인하였으며, caspase-3의 활성은 24시간, 48시간 후에 높게 나타나는 것을 확인하였다. 직접적인 세포사멸의 marker인 PARP의 활성도 확인하였다(Fig. 5).
대상 데이터
- WST-1 assay kit는 Roche에서 구입하였으며, Propidium Iodide 염색 시약은 Sigma-Aldrich (Michigan, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 약재인 천화분은 대표적 한약공급업체인 옴니허브(Korea)에서 구입하였으며, 100 g 정량 후 1 ℓ의 80% 에탄올에 30분 동안 sonication하였다. 3 mm 여과지 (Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물은 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결 건조하여(Freezedryer, Matsushita, Japan) 얻은 분말을 3차 증류수에 200 ㎎/㎖로 녹인 후 stock으로 사용하였다.
- 실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM 배지 및 fetal bovine serum (FBS)과 antibiotic- antimycotic은 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
- WST-1 assay kit는 Roche에서 구입하였으며, Propidium Iodide 염색 시약은 Sigma-Aldrich (Michigan, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM 배지 및 fetal bovine serum (FBS)과 antibiotic- antimycotic은 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
- 인간 유방암 세포주 MCF-7은 한국세포주은행을 통해 구입하였으며, DMEM 배지에 10% (v/v) 혈청과 1% 항생제를 넣어 5% CO2가 든 37℃ humidified incubator에서 배양한다. 각 실험에 사용된 세포는 70% 정도의 밀도로 준비하였다.
데이터처리
- 실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± S.E.(표준오차)로 요약하였으며, Student t-test method로 분석하여 p-value가 0.05미만일 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- Cells were treated with 30∼200 ㎍/ml TCK for 48 hours, and cell viability was measured by WST-1 assay.
성능/효과
- FACS 결과, 천화분(60 ㎍/ml)을 처리한 지 48시간째 약 20% 가량 subG1 값이 높아지는 것을 확인하였으며, 이로써 천화분에 의해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(Fig. 3).
- FACS를 이용하여 MCF-7 세포에 천화분(60 ㎍/ml)을 처리한 후, cell cycle의 변화를 관찰한 결과, G2/M phase arrest가 일어나는 것을 확인하였다. G2/M phase arrest는 천화분 처리 12시간째에 약 60%, 24시간째에 약 50%가량 증가하였다(Fig.
- 이러한 차이를 수치로 나타내기 위해서 FACS 실험을 통한 PI 염색방법을 이용해 apoptosis 수치를 나타내는 subG1의 양의 변화를 확인해보았다. PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포주기의 변화를 관찰한 결과 G2/M phase arrest가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 그 정도가 12시간째에 약 60%가량 증가하였고, 24시간째에는 50%가량을 유지하는 것으로 봐서 시간이 지나면서 효과가 떨어지는 것을 짐작케 하였다.
- WST-1 assay 결과 천화분을 MCF-7 세포에 48시간 동안 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포증식이 감소하였다.
- WST-1 assay 결과, MCF-7 세포에 30∼200 ㎍/ml의 천화분을 처리한 후 48시간 후에 농도 의존적으로 세포생존율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 먼저 천화분이 MCF-7 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 WST-1 assay와 microscope 관찰을 하였다. 그 결과 천화 분을 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되는 것을 WST-1 assay로 확인하였고, 농도가 증가할수록 세포의 부착력 상실이 늘어나고 apoptotic body가 나타나는 것을 현미경으로 확인하였는데, 이는 세포질의 응축으로 인해 세포의 부착력을 상실한 것으로, 세포질의 응축변화는 천화분 처리 후 1시간 만에도 눈으로 확인되었다.
- 먼저 세포에 천화분을 농도별로 처리한 후 세포 모양에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다. 그 결과 천화분의 농도가 증가할수록 세포의 밀도도 낮아지며, apoptosis의 전형적인 모양인 apoptotic body를 세포 표면에 형성하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).
- 이에 먼저 caspase-3과 PARP의 발현 및 활성 정도를 확인하였는데 천화분에 의해 이 두 단백질의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 천화분에 의한 apoptosis의 활성이 intrinsic pathway를 통한 것인지 또는 extrinsic pathway를 통한 것인지 알아보기 위해 caspase-8과 caspase-9의 활성을 관찰한 결과 caspase-9의 활성은 증가한 반면 caspase-8은 변하지 않는 것으로 보아 천화분이 intrinsic pathway를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
- 또한 ATM, chk2 인산화 level을 천화분이 조절한다는 결과를 바탕으로, DNA damage에 의해 G2/M phase arrest를 유발시킨다는 사실을 확인할 수 있었으며, 이는 결국 cdc25C 인산화와 cdc2/cyclin B의 interaction에 의해 세포주기를 arrest시킨다고 할 수 있겠다.
- PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포주기의 변화를 관찰한 결과 G2/M phase arrest가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 그 정도가 12시간째에 약 60%가량 증가하였고, 24시간째에는 50%가량을 유지하는 것으로 봐서 시간이 지나면서 효과가 떨어지는 것을 짐작케 하였다.
- 이상의 결과로, 천화분을 MCF-7 세포에 처리하였을 경우 세포의 증식을 강하게 억제하는 것으로 나타났고 세포의 형태도 변화시켰다. 이러한 세포의 증식억제는 천화분이 DNA damage를 통해 G2/M phase arrest를 유발하여 결국 intrinsic pathway 를 통한 apoptosis를 유도시켜 나타나는 결과였다.
- 이러한 apoptosis pathway가 활성화되면, 최종적으로 caspase의 최하위 단계이며, 세포사멸 과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 caspase-3이 활성화 되고, 세포내에서 PARP나 retinoblastoma (Rb)와 같은 단백질들을 분해시킨다21). 이에 먼저 caspase-3과 PARP의 발현 및 활성 정도를 확인하였는데 천화분에 의해 이 두 단백질의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 천화분에 의한 apoptosis의 활성이 intrinsic pathway를 통한 것인지 또는 extrinsic pathway를 통한 것인지 알아보기 위해 caspase-8과 caspase-9의 활성을 관찰한 결과 caspase-9의 활성은 증가한 반면 caspase-8은 변하지 않는 것으로 보아 천화분이 intrinsic pathway를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
- 이와 같은 결과로 볼 때, 천화분에 의한 MCF-7 인체 유방암 세포주의 세포증식 억제기전은 DNA damage에 의해 G2/M phase arrest가 일어나고, 결국 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도시켜 세포증식이 억제된다는 것을 알 수 있었다.
- 천화분 처리후 FACS 결과 subG1 부분이 약 20%까지 증가하는 것을 확인하였으며, G2/M phase arrest가 나타났다.
후속연구
- 이러한 세포의 증식억제는 천화분이 DNA damage를 통해 G2/M phase arrest를 유발하여 결국 intrinsic pathway 를 통한 apoptosis를 유도시켜 나타나는 결과였다. 그러나 천화분이 어떤 pathway를 통해 cell cycle arrest를 시키고 세포의 활성을 억제시키는지, 뿐만 아니라 다른 유전학적 특성을 가지고 있는 인체 유방암 세포에서의 효과 및 혈관신생억제를 통한 암전이 억제에 대한 보충 연구 역시 향후 추가로 연구해 보아야 할 것이다.
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