The purpose of this study is to investigate the anti-proliferative mechanism by Trichosanthes kirilowii (TCK) in MCF-7 human breast carcinoma cell. In this study, we used human breast cancer cell line, Michigan cancer foundation-7 cells (MCF-7 cells). They were co-incubated with 30~200 ${\mu}g$...
The purpose of this study is to investigate the anti-proliferative mechanism by Trichosanthes kirilowii (TCK) in MCF-7 human breast carcinoma cell. In this study, we used human breast cancer cell line, Michigan cancer foundation-7 cells (MCF-7 cells). They were co-incubated with 30~200 ${\mu}g$/ml TCK for 48 hours, and cell viability was measured by Water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) assay. After MCF-7 cells were exposed to 60 ${\mu}g$/ml of TCK for 0, 3, 6, 12, 24, 48 hours, We performed flow analysis cytometry sorting(FACS) and western blot analysis. We investigated the effect of dose-dependent cell growth inhibition by TCK, which could be proved by WST-1 assay. Also, flow cytometry analysis showed that TCK increased percentage of subG1 phase and G2/M phase cell cycle. In addition, TCK induced apoptosis through the expression of caspase-9, -3 and poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) activation. Moreover, we showed that ATM-dependent G2/M phase arrest by DNA damage and phosphorylation of chk2, cdc25C, cdc2(Tyr15). Taken together, these results suggest that by G2/M phase arrest through DNA damage and inducing of apoptosis through intrinsic pathway, TCK may have potential tumor suppressor in breast cancer.
The purpose of this study is to investigate the anti-proliferative mechanism by Trichosanthes kirilowii (TCK) in MCF-7 human breast carcinoma cell. In this study, we used human breast cancer cell line, Michigan cancer foundation-7 cells (MCF-7 cells). They were co-incubated with 30~200 ${\mu}g$/ml TCK for 48 hours, and cell viability was measured by Water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) assay. After MCF-7 cells were exposed to 60 ${\mu}g$/ml of TCK for 0, 3, 6, 12, 24, 48 hours, We performed flow analysis cytometry sorting(FACS) and western blot analysis. We investigated the effect of dose-dependent cell growth inhibition by TCK, which could be proved by WST-1 assay. Also, flow cytometry analysis showed that TCK increased percentage of subG1 phase and G2/M phase cell cycle. In addition, TCK induced apoptosis through the expression of caspase-9, -3 and poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) activation. Moreover, we showed that ATM-dependent G2/M phase arrest by DNA damage and phosphorylation of chk2, cdc25C, cdc2(Tyr15). Taken together, these results suggest that by G2/M phase arrest through DNA damage and inducing of apoptosis through intrinsic pathway, TCK may have potential tumor suppressor in breast cancer.
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문제 정의
본 실험은 MCF-7 인체 유방암 세포주에서 천화분의 항암효과 및 기전을 확인하고자 수행하였으며, 세포증식억제 확인을 위해 WST-1 assay를 시행하였고, FACS 및 western blot analysis를 이용하여 세포사멸, 세포주기변화 및 cell cycle 관련 인자와 caspase의 활성을 확인하였다.
본 연구에서는 인체 유방암 세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 세포증식억제 및 기전, 혈관신생억제에 대한 효과를 알아보았다. 이에 세포증식억제와 관련된 apoptosis의 유발과 경로, 세포 주기의 변화 및 세포주기조절에 관련된 인자들의 단백질 변화 여부를 조사하였다.
이에 본 연구에서는 천화분의 에탄올 추출물을 MCF-7 human breast carcinoma cell에 처리하여 microscope, WST-1 assay, FACS, western blot analysis를 통해 관찰한 결과 세포 억제에 대한 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구에서는 인체 유방암 세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 세포증식억제 및 기전, 혈관신생억제에 대한 효과를 알아보았다. 이에 세포증식억제와 관련된 apoptosis의 유발과 경로, 세포 주기의 변화 및 세포주기조절에 관련된 인자들의 단백질 변화 여부를 조사하였다.
제안 방법
다음날 100 ㎕의 천화분을 각각의 농도(0 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖)에 맞게 넣어준 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 48시간 후 WST-1 solution을 10 ㎕씩 각각의 well에 넣고 2시간동안 배양한 후 물에 녹아져 나온 formazan (water-soluble formazan)을 ELISA reader 기기(Molecular devices, VersaMax microplate reader, USA)로 440 ㎚ 필터에서 값을 측정하였다.
FACS 결과를 바탕으로 천화분에 의한 MCF-7 세포의 감소는 G2/M phase arrest가 apoptosis를 유발하여 감소된다는 사실을 알 수 있었으며, 이를 확인하기 위해 apoptosis 및 G2/M phase 관련 인자들을 western blot analysis를 통해 살펴보았다.
flow analysis cytometry sorting (FACS)를 통해 세포사멸을 보기 위해 4×105의 세포를 60 ㎜ culture plate에 배양하고, 다음날 60 ㎍/㎖의 천화분을 처리한 후 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 3 ㎖의 95% ethanol(0.5% Tween-20 첨가)에 세포를 고정시켰다.
/well로 6 well씩 8개의 群으로 깔아놓은 후 세포가 하루 동안 plate 바닥에 붙도록 배양한다. 다음날 100 ㎕의 천화분을 각각의 농도(0 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖)에 맞게 넣어준 후 배양기에서 48시간 동안 배양한다. 48시간 후 WST-1 solution을 10 ㎕씩 각각의 well에 넣고 2시간동안 배양한 후 물에 녹아져 나온 formazan (water-soluble formazan)을 ELISA reader 기기(Molecular devices, VersaMax microplate reader, USA)로 440 ㎚ 필터에서 값을 측정하였다.
먼저 세포에 천화분을 농도별로 처리한 후 세포 모양에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다. 그 결과 천화분의 농도가 증가할수록 세포의 밀도도 낮아지며, apoptosis의 전형적인 모양인 apoptotic body를 세포 표면에 형성하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
먼저 천화분이 MCF-7 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 WST-1 assay와 microscope 관찰을 하였다. 그 결과 천화 분을 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되는 것을 WST-1 assay로 확인하였고, 농도가 증가할수록 세포의 부착력 상실이 늘어나고 apoptotic body가 나타나는 것을 현미경으로 확인하였는데, 이는 세포질의 응축으로 인해 세포의 부착력을 상실한 것으로, 세포질의 응축변화는 천화분 처리 후 1시간 만에도 눈으로 확인되었다.
48시간동안 샘플이 다 모아질 때까지 나머지 샘플은 -20℃에서 보관하였다. 샘플을 다 모은 후 에탄올에 고정시켜둔 세포는 차가운 PBS로 두 번 washing한 후 暗상태에서 10 ㎎/㎖ propidium iodide(이하 PI)로 염색하여 FACStar flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)와 ModFit LT V 2.0 software를이용하여 분석하였다.
1% Tween-20)로 상온에서 1시간 동안 blocking한 후, 여러 가지 1차항체를 4℃에서 over night(O/N)으로 반응시킨 후, PBST로 washing후 HRP-conjugated 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 역시 PBST를 사용하여 washing과정을 거친 다음에 Electrochemiluminescence detection system (AmershamPharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 이용하여 X -ray film으로 결과를 확인하였다.
이러한 차이를 수치로 나타내기 위해서 FACS 실험을 통한 PI 염색방법을 이용해 apoptosis 수치를 나타내는 subG1의 양의 변화를 확인해보았다. PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Western blot analysis 결과, MCF-7 cell에 천화분(60 ㎍/ml) 처리 후 caspase-8은 변화가 없었으나, caspase-9는 12시간 후부터 활성이 미미하게 증가하는 것을 확인하였으며, caspase-3의 활성은 24시간, 48시간 후에 높게 나타나는 것을 확인하였다. 직접적인 세포사멸의 marker인 PARP의 활성도 확인하였다(Fig. 5).
대상 데이터
WST-1 assay kit는 Roche에서 구입하였으며, Propidium Iodide 염색 시약은 Sigma-Aldrich (Michigan, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다.
본 실험에서 사용한 약재인 천화분은 대표적 한약공급업체인 옴니허브(Korea)에서 구입하였으며, 100 g 정량 후 1 ℓ의 80% 에탄올에 30분 동안 sonication하였다. 3 mm 여과지 (Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물은 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결 건조하여(Freezedryer, Matsushita, Japan) 얻은 분말을 3차 증류수에 200 ㎎/㎖로 녹인 후 stock으로 사용하였다.
실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM 배지 및 fetal bovine serum (FBS)과 antibiotic- antimycotic은 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
WST-1 assay kit는 Roche에서 구입하였으며, Propidium Iodide 염색 시약은 Sigma-Aldrich (Michigan, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 antibody인 ATM, phospho-ATM, phospho-chk2, phospho-cdc25C, phospho-cdc2 (Thy15), cyclin B 는 cell signaling technology (MA, USA)에서 구입하였으며, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-8, procaspase-3, cleavedcaspase-3, actin, poly-(ADP-ribose) polymerase(이하 PARP)는 santa cruz biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM 배지 및 fetal bovine serum (FBS)과 antibiotic- antimycotic은 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
인간 유방암 세포주 MCF-7은 한국세포주은행을 통해 구입하였으며, DMEM 배지에 10% (v/v) 혈청과 1% 항생제를 넣어 5% CO2가 든 37℃ humidified incubator에서 배양한다. 각 실험에 사용된 세포는 70% 정도의 밀도로 준비하였다.
데이터처리
실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± S.E.(표준오차)로 요약하였으며, Student t-test method로 분석하여 p-value가 0.05미만일 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
Cells were treated with 30∼200 ㎍/ml TCK for 48 hours, and cell viability was measured by WST-1 assay.
성능/효과
FACS 결과, 천화분(60 ㎍/ml)을 처리한 지 48시간째 약 20% 가량 subG1 값이 높아지는 것을 확인하였으며, 이로써 천화분에 의해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(Fig. 3).
FACS를 이용하여 MCF-7 세포에 천화분(60 ㎍/ml)을 처리한 후, cell cycle의 변화를 관찰한 결과, G2/M phase arrest가 일어나는 것을 확인하였다. G2/M phase arrest는 천화분 처리 12시간째에 약 60%, 24시간째에 약 50%가량 증가하였다(Fig.
이러한 차이를 수치로 나타내기 위해서 FACS 실험을 통한 PI 염색방법을 이용해 apoptosis 수치를 나타내는 subG1의 양의 변화를 확인해보았다. PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포주기의 변화를 관찰한 결과 G2/M phase arrest가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 그 정도가 12시간째에 약 60%가량 증가하였고, 24시간째에는 50%가량을 유지하는 것으로 봐서 시간이 지나면서 효과가 떨어지는 것을 짐작케 하였다.
WST-1 assay 결과 천화분을 MCF-7 세포에 48시간 동안 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포증식이 감소하였다.
WST-1 assay 결과, MCF-7 세포에 30∼200 ㎍/ml의 천화분을 처리한 후 48시간 후에 농도 의존적으로 세포생존율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
먼저 천화분이 MCF-7 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 WST-1 assay와 microscope 관찰을 하였다. 그 결과 천화 분을 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되는 것을 WST-1 assay로 확인하였고, 농도가 증가할수록 세포의 부착력 상실이 늘어나고 apoptotic body가 나타나는 것을 현미경으로 확인하였는데, 이는 세포질의 응축으로 인해 세포의 부착력을 상실한 것으로, 세포질의 응축변화는 천화분 처리 후 1시간 만에도 눈으로 확인되었다.
먼저 세포에 천화분을 농도별로 처리한 후 세포 모양에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다. 그 결과 천화분의 농도가 증가할수록 세포의 밀도도 낮아지며, apoptosis의 전형적인 모양인 apoptotic body를 세포 표면에 형성하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).
이에 먼저 caspase-3과 PARP의 발현 및 활성 정도를 확인하였는데 천화분에 의해 이 두 단백질의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 천화분에 의한 apoptosis의 활성이 intrinsic pathway를 통한 것인지 또는 extrinsic pathway를 통한 것인지 알아보기 위해 caspase-8과 caspase-9의 활성을 관찰한 결과 caspase-9의 활성은 증가한 반면 caspase-8은 변하지 않는 것으로 보아 천화분이 intrinsic pathway를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
또한 ATM, chk2 인산화 level을 천화분이 조절한다는 결과를 바탕으로, DNA damage에 의해 G2/M phase arrest를 유발시킨다는 사실을 확인할 수 있었으며, 이는 결국 cdc25C 인산화와 cdc2/cyclin B의 interaction에 의해 세포주기를 arrest시킨다고 할 수 있겠다.
PI 염색결과 천화분 처리 48시간 후에 subG1이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포주기의 변화를 관찰한 결과 G2/M phase arrest가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 그 정도가 12시간째에 약 60%가량 증가하였고, 24시간째에는 50%가량을 유지하는 것으로 봐서 시간이 지나면서 효과가 떨어지는 것을 짐작케 하였다.
이상의 결과로, 천화분을 MCF-7 세포에 처리하였을 경우 세포의 증식을 강하게 억제하는 것으로 나타났고 세포의 형태도 변화시켰다. 이러한 세포의 증식억제는 천화분이 DNA damage를 통해 G2/M phase arrest를 유발하여 결국 intrinsic pathway 를 통한 apoptosis를 유도시켜 나타나는 결과였다.
이러한 apoptosis pathway가 활성화되면, 최종적으로 caspase의 최하위 단계이며, 세포사멸 과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 caspase-3이 활성화 되고, 세포내에서 PARP나 retinoblastoma (Rb)와 같은 단백질들을 분해시킨다21). 이에 먼저 caspase-3과 PARP의 발현 및 활성 정도를 확인하였는데 천화분에 의해 이 두 단백질의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 천화분에 의한 apoptosis의 활성이 intrinsic pathway를 통한 것인지 또는 extrinsic pathway를 통한 것인지 알아보기 위해 caspase-8과 caspase-9의 활성을 관찰한 결과 caspase-9의 활성은 증가한 반면 caspase-8은 변하지 않는 것으로 보아 천화분이 intrinsic pathway를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과로 볼 때, 천화분에 의한 MCF-7 인체 유방암 세포주의 세포증식 억제기전은 DNA damage에 의해 G2/M phase arrest가 일어나고, 결국 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도시켜 세포증식이 억제된다는 것을 알 수 있었다.
천화분 처리후 FACS 결과 subG1 부분이 약 20%까지 증가하는 것을 확인하였으며, G2/M phase arrest가 나타났다.
후속연구
이러한 세포의 증식억제는 천화분이 DNA damage를 통해 G2/M phase arrest를 유발하여 결국 intrinsic pathway 를 통한 apoptosis를 유도시켜 나타나는 결과였다. 그러나 천화분이 어떤 pathway를 통해 cell cycle arrest를 시키고 세포의 활성을 억제시키는지, 뿐만 아니라 다른 유전학적 특성을 가지고 있는 인체 유방암 세포에서의 효과 및 혈관신생억제를 통한 암전이 억제에 대한 보충 연구 역시 향후 추가로 연구해 보아야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
천화분의 효능으로는 무엇이 있나?
천화분(Trichosanthes kirilowii, 이하 TCK)은 葫蘆科(박과,Cucurbitaceae)에 속한 다년생 攀援性草質藤本인 하늘타리 및 동속 근연식물의 괴근으로 淸熱生津, 淸肺化痰, 消腫排膿의 효능을 지닌 것으로 알려져 있으며9), 최근 천화분을 이용한 항암연구로는 암세포의 증식억제 및 세포사멸 유발, 혈관신생억제 등에 관한 일부 보고가 있다10-13).
천화분이란 무엇인가?
천화분(Trichosanthes kirilowii, 이하 TCK)은 葫蘆科(박과,Cucurbitaceae)에 속한 다년생 攀援性草質藤本인 하늘타리 및 동속 근연식물의 괴근으로 淸熱生津, 淸肺化痰, 消腫排膿의 효능을 지닌 것으로 알려져 있으며9), 최근 천화분을 이용한 항암연구로는 암세포의 증식억제 및 세포사멸 유발, 혈관신생억제 등에 관한 일부 보고가 있다10-13).
MCF-7 인체 유방암 세포주에서 천화분의 항암효과 및 기전을 확인하고자 수행하였으며, 세포증식 억제 확인을 위해 WST-1 assay를 시행하였고, FACS 및 western blot analysis를 이용하여 세포사멸, 세포주기 변화 및 cell cycle 관련 인자와 caspase의 활성을 확인해본 본 연구의 결과는 무엇인가?
WST-1 assay 결과 천화분을 MCF-7 세포에 48시간 동안 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포증식이 감소하였다.
천화분 처리후 FACS 결과 subG1 부분이 약 20%까지 증가 하는 것을 확인하였으며, G2/M phase arrest가 나타났다.
Western blot analysis를 통해 caspase-9, caspase-3 및 PARP의 활성화를 확인하였고, ATM에 의존적으로 Chk2 및 cdc25C의 인산화가 일어나는 것을 확인하였으며, 결국 cyclin B가 감소하였다.
이와 같은 결과로 볼 때, 천화분에 의한 MCF-7 인체 유방암 세포주의 세포증식 억제기전은 DNA damage에 의해 G2/M phase arrest가 일어나고, 결국 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도시켜 세포증식이 억제된다는 것을 알 수 있었다.
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