우리나라 양식 넙치에서 분리한 VHSV (KR'01-1)의 glycoprotein 아미노산 배열을 기초로 단백질 전환 구조상 유연성, 친수성 및 항원성이 높고, 표면에 노출되어 있을 가능성(surface probability)이 높다고 분석되는 3개의 peptide (Gp1, Gp2, Gp3)를 선정하였다. 정제한 바이러스 입자 및 3개의 합성 peptide에 대한 polyclonal 항체를 제작하여 항원성 분석을 실시한 결과, 합성 peptide로 제작한 모든 항혈청은 Western blotting 결과 VHSV의 구조단백질과 특이적으로 결합하는 나타났으며, 이 가운데 Gp1 및 Gp2 합성 peptide에 대한 항혈청은 양식 넙치에서 분리한 VHSV를 중화시키는 것으로 나타나, peptide-based antigen의 이용 가능성을 제시하였다.
우리나라 양식 넙치에서 분리한 VHSV (KR'01-1)의 glycoprotein 아미노산 배열을 기초로 단백질 전환 구조상 유연성, 친수성 및 항원성이 높고, 표면에 노출되어 있을 가능성(surface probability)이 높다고 분석되는 3개의 peptide (Gp1, Gp2, Gp3)를 선정하였다. 정제한 바이러스 입자 및 3개의 합성 peptide에 대한 polyclonal 항체를 제작하여 항원성 분석을 실시한 결과, 합성 peptide로 제작한 모든 항혈청은 Western blotting 결과 VHSV의 구조단백질과 특이적으로 결합하는 나타났으며, 이 가운데 Gp1 및 Gp2 합성 peptide에 대한 항혈청은 양식 넙치에서 분리한 VHSV를 중화시키는 것으로 나타나, peptide-based antigen의 이용 가능성을 제시하였다.
The amino acid sequence of glycoprotein of Korean VHSV isolate (KR'01-1) was analyzed using the DNAStar Protean system. Based on the flexibility, hydrophilicity, antigenic index and surface probability, three regions (Gp1, Gp2 and Gp3) were selected as potential antigenic determinants. Three oligope...
The amino acid sequence of glycoprotein of Korean VHSV isolate (KR'01-1) was analyzed using the DNAStar Protean system. Based on the flexibility, hydrophilicity, antigenic index and surface probability, three regions (Gp1, Gp2 and Gp3) were selected as potential antigenic determinants. Three oligopeptides containing the amino acid sequences of the three regions were synthesized and polyclonal antibodies were raised against them. The activities of the antibodies were analyzed by Western blotting and virus neutralization test. The results showed that antibodies raised against oligopeptides Gp1 and Gp2 neutralized the infectivity of VHSV, suggesting that they can be possible candidates for subunit vaccines against VHS diseases in olive flounder.
The amino acid sequence of glycoprotein of Korean VHSV isolate (KR'01-1) was analyzed using the DNAStar Protean system. Based on the flexibility, hydrophilicity, antigenic index and surface probability, three regions (Gp1, Gp2 and Gp3) were selected as potential antigenic determinants. Three oligopeptides containing the amino acid sequences of the three regions were synthesized and polyclonal antibodies were raised against them. The activities of the antibodies were analyzed by Western blotting and virus neutralization test. The results showed that antibodies raised against oligopeptides Gp1 and Gp2 neutralized the infectivity of VHSV, suggesting that they can be possible candidates for subunit vaccines against VHS diseases in olive flounder.
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문제 정의
본 연구는 우리나라 양식 넙치에 큰 피해를 주고 있는 VHSV에 대한 vaccine 개발을 위해, 효과적이고 경제적인 것으로 알려진 중화항체를 생산할 수 있는 항원 결정기(epitope)를 검색하였다. 이에 glycoprotein 의 아미노산 서열 중 몇 가지 합성 peptide를 선정하여 항원성 분석을 실시하고 항원 및 항체 이용 가능성을 검토하였다.
검색하였다. 이에 glycoprotein 의 아미노산 서열 중 몇 가지 합성 peptide를 선정하여 항원성 분석을 실시하고 항원 및 항체 이용 가능성을 검토하였다.
, 2010). 현재 VHS 에 대한 vaccine 연구는 killed vaccine, live vaccine, subunit vaccine 및 DNA vaccine (de Kinkelin, 1988; Lorezen and Olesen, 1997) 등 다양하게 이루어지고 있으며, 여러 연구자들이 보다 효율적인 vaccine 개발을 위한 VHSV의구조 단백질 분석에 관한 보고를 하였다
제안 방법
약술하면, 제작한 4가지 anti-VHSV rabbit Ab (KR'01-1, Gpl, Gp2, Gp3)를 FBS가 첨가되지 않은 MEM으로 2배 단계 희석한 다음 96 well plate에 50 μ1씩 넣고 102 TCIDso 50 μl-1의 농도로 희석시킨 VHSV isolates, IHNV, HIRRV를 항혈청이 첨가된 plate에 50 μ1씩 첨가하여 실온에서 1시간 동안 흔들면서 반응시켰다. 96 well plate에 단층 배양된 EPC cell linc에 well 당 100 μ1씩 접종하고 18 ℃에서 14일간 배양하면서 CPE를 관찰하였다. 항혈청의 중화역가 (ND)는 102 TCIDso well-t의 바이러스를 중화시키는 항혈청의 종말 희석 배수의 역수로부터 구하였다
2와 같다 Anti-whole VHSV (KR'01-1) Ab는시험 대상 VHSV isolates와는 특이적으로 반응하여동일한 pattern의 G, N 및 Ml 에 해당하는 protein profile 을 보였으나 (A, lane 1 ~7), IHNV나 HIRRV의 구조단백질은 인식하지 않는 것으로 나타났다(A, lane I and H). Gpl, Gp2, Gp3의 합성 peptide에 대한 Ab역시시험 대상 VHSV isolates와는 특이적으로 반응하여 G protein의 분자량과 일치하는 곳에 특이 band를 형성하였다 (B, C and D, lane 1 ~7). 이에 반해 이들 합성 peptide 항체가 IHNV나 HIRRV와 특이 결합하는 반응은 확인할 수 없었다 (Fig.
합성 (Peptron, Korea)하였다. Peptide를 합성한 후 항체 제작을 위해 필요한 carrier 단백질로서 keyhole limpet hemocyanin (KLH)을 결합시켜 항체 제작에사용하였다.
5 kg 되는 New Zealand white rabbit를 사용하여 제작하였다. 면역에 사용한 항원 단백질의 양은 순수 분리한 바이러스와 합성 peptide 를 각각 200 ㎍씩 사용하였으며 첫 번째 면역은 Freund's complete adjuvant (FCA) 와유화시킨 후 피하 주사하였고 두 번째 이후부터는 Freund's incomplete adjuvant (FIA)와 유화시킨 것으로 면역하였다 이와 같은 방법을 사용하여 2주 간격으로 3회 주사한 후 전채혈하여 혈청을 분리하고 -80 ℃에 보관하면서 실험에 사용하였다
바이러스의 구조 단백질을 분석하기 위하여 농축 정제한 바이러스를 불연속 12 % SDS-PAGE로 전기영동 하여 나타난 band를 standard marker protein (Fermentas)과 비교해 본 결과는 Fig. 1과 같다. 분자량 약 70, 41, 28, 24 kDa 부근에 major band가 관찰되었으며, 이는 각각 G, N, Ml, M2 protein의 분자량에 해당하였다 (lane 1~7).
선행 연구(Kim et al., 2003)에서 밝힌 넙치 유래 VHSV (KR'01-l)의 glycoprotein gene (GenBank Accession number, AY167587)을 기초로 추정 아미노산 서열을 분석하고, DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA) 프로그램을 이용하여 친수성 (hydrophilicity) 및 항원성 (antigenic index) 이 높고, 단백질 3차 구조상 표면에 노출되어 있을 가능성 (surface probability)0] 높다고 분석되는 3개의 peptide 를 Table 2와 같이 선정하였다. 선정한 peptide sequence# Fmoc법을 이용하여 고상법으로 주문 .
(1983)의 방법에 따랐다. 약술하면, 제작한 4가지 anti-VHSV rabbit Ab (KR'01-1, Gpl, Gp2, Gp3)를 FBS가 첨가되지 않은 MEM으로 2배 단계 희석한 다음 96 well plate에 50 μ1씩 넣고 102 TCIDso 50 μl-1의 농도로 희석시킨 VHSV isolates, IHNV, HIRRV를 항혈청이 첨가된 plate에 50 μ1씩 첨가하여 실온에서 1시간 동안 흔들면서 반응시켰다. 96 well plate에 단층 배양된 EPC cell linc에 well 당 100 μ1씩 접종하고 18 ℃에서 14일간 배양하면서 CPE를 관찰하였다.
3 % NaCl을 첨가하여 4 ℃에서 교반하면서 overnight 하였다. 이를 20, 000xg, 40분 동안 원심 분리하여 얻은 pellet을 소량의 TNE buffer (0.01 M Tris HC1, 0.1 M NaCl, 0.001 M EDTA)에 재현탁한 다음 15 % sucrose cushion 위에 중층하고 4 ℃, 115, 000xg에서 1시간 동안 초고속 원심 분리하여 바이러스 pellet을 얻었다 항원 제작에 사용할 VHSV isolate (KRW-1)는 바이러스 pellet을 다시 TNE buffer에 재현탁하여 20, 35, 50 % sucrose discontinuous gradient상에서 4 ℃, 80, 000xg로 1시간 30분 동안 원심 분리하여 20과 35 % 경계 지점에 형성된 바이러스 band를 수확하였다. 이를 TNE buffer 에 재현탁하여 115,000xg에서 1시간 동안 원심 분리하여 바이러스를 정제하였다.
, 1999)도 있었다. 본연구에서는 중화 항체를 생산하기 위하여 whole virus 뿐만 아니라 G protein 의 단편 구조인 합성 peptide를항체 제작에 사용하였다. 본 연구에서 제작한 polyclonal VHSV whole antisera뿐만 아니라 합성 peptide에서도중화 항체가를 확인할 수 있었으나 이것이 실제로넙치의 VHSV에 대한protection에 관여할지에 대해서는 추가적인 실험이 필요할 것이다.
1과 같다. 사용된 7 균주는 선행연구(Kim et al, 2004)의 결과, 2001년 12월부터 2004년 3월까지 경북 동해안 지역 및 경남 남해안 일원에서 체색 흑화 복부 팽만 및 탈장 등의 특징적인 질병 증상을 보이며 폐사하는 넙치에서 분리하여 양식넙치에 대한 병원성 및 genotype (American isolates, genotype I) 이 확인된 균주를 사용하였다 바이러스의 배양은 병어의 조직 마쇄 여과액을 Epithelial papilloma of carp (EPQ cell에 접종한 후 15℃에서 3 일간 배양하여 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE)를 확인하였다 세포배양액은 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco BRL)을 첨가한 Eagle's minimum essential medium (EMEM) 를 사용흐]였다 바이러스의 계대는 low multiplicity of infection (MOI, <0.01)으로 수행하였고 모든 실험에는 3회 이하로계대한 바이러스액을 사용하였다 특성 비교를 위한 참조 바이러스로는 Hong (2004)의 연구에서 사용된 Infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) 와 Hirame rhabdovirus (HIRRV)를 사용하였다
순수 분리한 VHSV (KRel-l) 및 합성 peptide (Gpl, Gp2, Gp3)에 대한 polyclonal 항체는 으F 1.5 kg 되는 New Zealand white rabbit를 사용하여 제작하였다. 면역에 사용한 항원 단백질의 양은 순수 분리한 바이러스와 합성 peptide 를 각각 200 ㎍씩 사용하였으며 첫 번째 면역은 Freund's complete adjuvant (FCA) 와유화시킨 후 피하 주사하였고 두 번째 이후부터는 Freund's incomplete adjuvant (FIA)와 유화시킨 것으로 면역하였다 이와 같은 방법을 사용하여 2주 간격으로 3회 주사한 후 전채혈하여 혈청을 분리하고 -80 ℃에 보관하면서 실험에 사용하였다
선정한 peptide sequence# Fmoc법을 이용하여 고상법으로 주문 . 합성 (Peptron, Korea)하였다. Peptide를 합성한 후 항체 제작을 위해 필요한 carrier 단백질로서 keyhole limpet hemocyanin (KLH)을 결합시켜 항체 제작에사용하였다.
이론/모형
바이러스의 정제는 Nishizawa et al.(1991)의 방법에 준하였다 즉 IHNV, HRRV 및 각각의 VHSV isolates 를 150 cm2 T/C flask에 접종하여 대량 배양하고 세포가 90 % 이상 lysis되었을 때 -75 ℃의 초저온으로 세포를 동결하였다 이를 녹인 다음 4, 000 xg, 30분 동안 원심분리하여 세포 잔유물을 제거한 후 상징액만을 취하고 여기에 7 % polyethylene glycol (PEG-6, 000), 2.3 % NaCl을 첨가하여 4 ℃에서 교반하면서 overnight 하였다. 이를 20, 000xg, 40분 동안 원심 분리하여 얻은 pellet을 소량의 TNE buffer (0.
바이러스 중화시험은 Okamoto et al. (1983)의 방법에 따랐다. 약술하면, 제작한 4가지 anti-VHSV rabbit Ab (KR'01-1, Gpl, Gp2, Gp3)를 FBS가 첨가되지 않은 MEM으로 2배 단계 희석한 다음 96 well plate에 50 μ1씩 넣고 102 TCIDso 50 μl-1의 농도로 희석시킨 VHSV isolates, IHNV, HIRRV를 항혈청이 첨가된 plate에 50 μ1씩 첨가하여 실온에서 1시간 동안 흔들면서 반응시켰다.
, Madison, WI, USA) 프로그램을 이용하여 친수성 (hydrophilicity) 및 항원성 (antigenic index) 이 높고, 단백질 3차 구조상 표면에 노출되어 있을 가능성 (surface probability)0] 높다고 분석되는 3개의 peptide 를 Table 2와 같이 선정하였다. 선정한 peptide sequence# Fmoc법을 이용하여 고상법으로 주문 . 합성 (Peptron, Korea)하였다.
성능/효과
분자량 약 70, 41, 28, 24 kDa 부근에 major band가 관찰되었으며, 이는 각각 G, N, Ml, M2 protein의 분자량에 해당하였다 (lane 1~7). 넙치에서 분리한 virus isolates는 모두 동일한 protein pattern을 보였으나, reference virus인 HIRRV와 IHNV는 protein pattern이 상이하였다 (lane, IHNV and HIRRV).
5-25 kDa (Ml), 19 kDa (M2), 72~80 kDa (G) 그리고 157-190 kDa (L) 가량인 것으로 알려져 있다 (Lenoir and de Kinkelin, 1975; McAllister and Wangner, 1975). 본 연구에서는 넙치에서 분리되는 VHSV isolates의 구조 단백의 전기 영동상을 조사한 결과 L protein에 대해서는 12 % SDS상에서 명확한 위치를 찾기 어려웠고 G, N, Ml 및 M2는 각각 약 70, 41, 28 및 24 kDa 정도인 것으로 확인되었으며 넙치에서 분리한 VHSV isolates 간에는 차이가 없어 모두 동일한 profiles 임을 확인할 수 있었다.
제작한 polyclonal rabbit antibody의 VHSV 결합 특이성을 확인하기 위하여 western blotting을 실시한 결과는 Fig. 2와 같다 Anti-whole VHSV (KR'01-1) Ab는시험 대상 VHSV isolates와는 특이적으로 반응하여동일한 pattern의 G, N 및 Ml 에 해당하는 protein profile 을 보였으나 (A, lane 1 ~7), IHNV나 HIRRV의 구조단백질은 인식하지 않는 것으로 나타났다(A, lane I and H). Gpl, Gp2, Gp3의 합성 peptide에 대한 Ab역시시험 대상 VHSV isolates와는 특이적으로 반응하여 G protein의 분자량과 일치하는 곳에 특이 band를 형성하였다 (B, C and D, lane 1 ~7).
후속연구
본 연구에서 제작한 VHSV peptide Gpl과 Gp2에대한 항체는 western blot에서 VHSV G protein을 특이적으로 검출하는 것으로 조사되었으므로 바이러스검출용 항원 및 항체로 활용 가능성이 높으며 중화항체로서의 역할을 추가 분석할 충분한 가치가 있을 것으로 생각한다.
본연구에서는 중화 항체를 생산하기 위하여 whole virus 뿐만 아니라 G protein 의 단편 구조인 합성 peptide를항체 제작에 사용하였다. 본 연구에서 제작한 polyclonal VHSV whole antisera뿐만 아니라 합성 peptide에서도중화 항체가를 확인할 수 있었으나 이것이 실제로넙치의 VHSV에 대한protection에 관여할지에 대해서는 추가적인 실험이 필요할 것이다.
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