[논문]VHS (viral hemorrhagic septicemia)의 원인병원체인 VHSV (genotype IVa)에 대한 단클론 항체 개발

공경희; 오명주; 장민석; 김춘섭; 김위식

doi:10.7847/jfp.2019.32.2.059

VHS (viral hemorrhagic septicemia)의 원인병원체인 VHSV (genotype IVa)에 대한 단클론 항체 개발
Development of monoclonal antibodies against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV, genotype IVa), the causative agent of VHS 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.32 no.2, 2019년, pp.59 - 67

공경희 (전남대학교 수산생명의학과) , 오명주 (전남대학교 수산생명의학과) , 장민석 (국립수산과학원 남해수산연구소) , 김춘섭 ((주)엔바이로젠) , 김위식 (전남대학교 수산생명의학과)

초록
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본 연구에서는 넙치(Paralichthys olivaceus)로부터 분리한 바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV, genotype IVa)에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 개발하였다. VHSV에 대한 항체를 생산하는 총 5개의 hybridoma clone을 생산하였다. 4개의 MAbs (2C10, 18H4, 23H6, 30B7)는 glycoprotein을 인식하였고, MAb 15E10은 nucleocapsid protein을 인식하였다. 5개의 MAbs는 western blot 상에서 VHSV에 감염된 세포와 넙치시료에 반응하였으나, 정상 세포와 넙치시료에는 반응하지 않았다. 또한 ELISA상에서 VHSV에만 반응하였고 6종의 어류바이러스(IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV, NNV)에는 반응하지 않았다. 이상의 결과, 본 연구에서 제작된 MAbs는 VHSV에만 특이적으로 반응하는 것이 확인되어 VHSV를 검사하는데 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

We developed and subsequently characterized mouse antibodies (MAbs) against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV, genotype IVa), the causative agent of VHS. Five hybridoma clones secreting MAbs against VHSV were established. The MAbs recognized the glycoprotein (MAbs 2C10, 18H4, 23H6, and 30B7) and nucleocapsid protein (15E10) of VHSV by western blot analysis. All five MAbs reacted with VHSV-infected cells and tissue homogenates of VHSV-infected olive flounder (Paralichthys olivaceus) by western blot analysis. Whereas, no reactivity was observed in normal cells and tissue homogenates of normal olive flounder. Moreover, these MAbs reacted with VHSV, but did not react with other fish viruses (infectious hematopoietic necrosis virus, hirame rhabdovirus, spring viraemia of carp virus, infectious pancreatic necrosis virus, marine birnavirus, and nervous necrosis virus) by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). These results indicate that the MAbs are specific to VHSV and can be of value in VHSV detection.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. SDS-PAGE analysis of purified VHSV.
그림 Fig. 2. Western blot analysis using purified VHSV (a), VHSV-infected FHM cells (b), and tissue homogenates of VHSV-infected olive flounder (c).
그림 Fig. 3. Western blot analysis using infected cells with 7 fish viruses and normal cells.
그림 Fig. 4. ELISA using seven fish viruses (VHSV, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV, and NNV) and five monoclonal antibodies (2C10, 15E10, 18H4, 23H6, 30B7).

AI 본문요약
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문제 정의

신속 진단키트는 간단하게 구성되어 있고 크기가 작아 쉽게 휴대할 수 있으며, 측정 장비가 요구되지 않고 현장에서 누구나 쉽게 빠른 시간 내에 (10분 이내) 질병을 진단 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 현장검사용 VHS 신속 진단키트 개발을 위한 기초연구로서 VHSV에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 생산하고자 한다.

제안 방법

ELISA는 7종의 바이러스(VHSV, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV, NNV) 상층액을 증류수로 320배 희석하여 96 well ELISA plats (Greiner bio-one, Germany)에 각각 50 μl씩 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다. T-PBS (0.
(2017)의 방법에 따라 실시하였다. VHSV를 대량으로 배양하기 위하여 75 cm² tissue culture flask (Nunc, Denmark)에 fathead minnow cell line (FHM)을 단층으로 배양 후 바이러스를 접종하여 15℃에서 10일간 배양하면서 cytopathic effect를 관찰하였다. 세포의 90% 이상이 용해되면 세포 배양액을 취해 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 세포 잔여물을 제거한 후 상층액을 분리하였다.
VHSV에 감염된 세포에 대한 항체의 반응을 확인하기 위해, 3개의 VHSV 분리주(FYeosu05, FWando05, Jeju14: genotype Ⅳa에 속함) (Kim et al., 2009; Jang, 2019)에 감염된 FHM 세포와 정상 FHM 세포를 사용하여 western blot을 실시하였다. VHSV에 감염된 세포는 VHSV를 FHM/24 well에 접종한 후 3일째 배양액을 제거하고 Hank's balanced salt solution (HBSS)로 세포를 3회 수세한 후, SDS-sam-ple buffer 1 ml를 첨가하여 세포를 lysis 시킨 후100℃에서 3분간 열처리하여 western blot을 실시하였다.

대상 데이터

VHSV는 넙치로부터 분리한 FYeosu05 분리주(genotype IVa)를 사용하였다(Kim et al., 2009). 바이러스의 배양, 농축 및 정제는 Jeong et al.
다양한 종류의 어류 바이러스들에 대한 항체의 특이도를 조사하기 위해 7종의 바이러스 [VHSV (10^9.3 tissue culture infective dose (TCID)₅₀/ml), 전염성조혈기괴사증바이러스 (infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV: 10^7.3 TCID50/ml), 넙치랩도바이러스 (hirame rhabdovirus, HIRRV: 10^8.3 TCID50/ ml), 잉어봄바이러스 (spring viraemia of carp virus, SVCV: 10^7.55 TCID₅₀/ml), 전염성췌장괴사증바이러스 (infectious pancreatic necrosis virus, IPNV: 10^9.55 TCID₅₀/ml), 해양버나바이러스 (marine birnavirus, MABV: 10^9.3 TCID₅₀/ml), 신경괴사증바이러스(nervous necrosis virus, NNV: 10^8.05 TCID₅₀/ml)]에 감염된 세포와 정상세포 (epithelioma papulosum cyprini (EPC), chinook salmon embryo (CHSE-214), striped snakehead (SSN-1))를 사용하여 western blot을 실시하였다. 바이러스에 감염된 세포는 7종의 바이러스들을 FHM (VHSV), EPC (SVCV, HIRRV), CHSE-214 (IHNV, IPNV, MABV), SSN-1 (NNV) 세포/24 well에 접종한 후 3일째 배양액을 제거하고 HBSS로 세포를 3회 수세한 후, SDS-sample buffer 1 ml를 첨가하여 세포를 lysis 시킨 후 100℃에서 3분간 열처리하여 western blot을 실시하였다.

이론/모형

Hybridoma는 Jeong et al. (2017)의 방법에 따라제작하였다. 정제된 VHSV (약 100 μg)와 incom-plete freund’s adjuvant를 동량으로 섞어 BALB/c 마우스의 발바닥에 1차 면역한 후, 2주 후에 동일한 VHSV (약 100 μg)로 2차 면역하였다.
, 2009). 바이러스의 배양, 농축 및 정제는 Jeong et al. (2017)의 방법에 따라 실시하였다. VHSV를 대량으로 배양하기 위하여 75 cm² tissue culture flask (Nunc, Denmark)에 fathead minnow cell line (FHM)을 단층으로 배양 후 바이러스를 접종하여 15℃에서 10일간 배양하면서 cytopathic effect를 관찰하였다.

성능/효과

88 (genotype IVb 분리주)은 genotype IVb (일부 분리주 제외)에만 반응하였다. 위의 연구결과를 종합해 보면, 특정 genotype에 속하는 VHSV를 면역할 경우, 동일 genotype에 속하는 VHSV에만 반응하는 항체, 다양한 geno-type에 속해있는 VHSV에 반응하는 항체, 그리고 모든 genotype에 속하는 VHSV에 반응하는 항체가 생산될 수 있음이 확인되었다. 본 연구에서 제작된 MAb는 genotype IVa에 속하는 3개의 VHSV 분리주들에 대해서만 특이도를 조사했기 때문에 향후 다른 genotype의 VHSV 분리주들에 대한 특이도를 조사할 필요가 있다.

후속연구

위의 연구결과를 종합해 보면, 특정 genotype에 속하는 VHSV를 면역할 경우, 동일 genotype에 속하는 VHSV에만 반응하는 항체, 다양한 geno-type에 속해있는 VHSV에 반응하는 항체, 그리고 모든 genotype에 속하는 VHSV에 반응하는 항체가 생산될 수 있음이 확인되었다. 본 연구에서 제작된 MAb는 genotype IVa에 속하는 3개의 VHSV 분리주들에 대해서만 특이도를 조사했기 때문에 향후 다른 genotype의 VHSV 분리주들에 대한 특이도를 조사할 필요가 있다. 하지만 제작된 MAb는 3개의 국내 VHSV 분리주에 강하게 반응하므로 genotype IVa에 속하는 VHSV를 검출할 수 있는 현장검사용 VHS 신속 진단키트를 개발하는데 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서 제작된 MAb는 genotype IVa에 속하는 3개의 VHSV 분리주들에 대해서만 특이도를 조사했기 때문에 향후 다른 genotype의 VHSV 분리주들에 대한 특이도를 조사할 필요가 있다. 하지만 제작된 MAb는 3개의 국내 VHSV 분리주에 강하게 반응하므로 genotype IVa에 속하는 VHSV를 검출할 수 있는 현장검사용 VHS 신속 진단키트를 개발하는데 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	VHSV를 검사하는 방법으로 무엇이 사용되는가?	VHSV를 검사하는 방법으로는 어류주화세포를 이용한 분리배양법, 유전자를 이용한 분자생물학적 방법(reverse transcriptase polymerase chain re-action (RT-PCR), real time PCR 등), 항체를 이용한 면역학적인 방법(enzyme-linked immunosorbent as-say (ELISA), fluorescent antibody test (FAT)) 등이 사용되고 있다(OIE, 2019). 국내에서는 VHSV에 감염된 넙치를 검사하는 방법으로 RT-PCR과 어류주화세포를 사용한 분리배양법이 주로 사용되고 있다.
	VHSV는 무엇인가?	VHSV는 Rhabdoviridae 과 Novirhabdovirus 속에속하는 탄환형의 바이러스로서 6개의 gene (3’-N- P-M-G-NV-L-5’)으로 구성된 약 11.1 kbp의 neg-ative-sense RNA를 가지고 있다(Tordo et al., 2005; Egusa et al.
	VHSV에 감염된 넙치를 검사할 때 주로 사용하는 RT-PCR, 분리배양법의 장단점은 무엇인가?	국내에서는 VHSV에 감염된 넙치를 검사하는 방법으로 RT-PCR과 어류주화세포를 사용한 분리배양법이 주로 사용되고 있다. 이들 방법은 민감도와 특이도가 우수하다는 장점이 있으나, 전문적인 기술과 특수한 장비를 필요로 하므로 현장에서 사용하기에는 한계가 있다. 면역크로마토그래피법을 기반으로 하는 현장검사용 신속 진단키트는 전 세계적으로 사람 및 동물에서 발생하는 질병을 진단하는 방법으로 널리 사용되고 있다(Wong and Tse, 2008; Baron et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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