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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기존에 크로마틴 면역침강법 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) [12,13]를 수정하여 새롭게 앱타머의 목적 단백질을 검출하는 방법을 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 질병 진단을 위해 앱타머를 활용함에 있어 앱타머의 목적 단백질이 되는 바이오마커를 직접 검출하는 방법을 고안하였다. 단백질 검출을 위한 항체 사용 대신 앱타머로 목적 단백질을 분리하였고, 목적 단백질이 결합하는 DNA 혹은 RNA 시퀀스를 찾는 것이 아니라 목적 단백질 자체를 질량분석기를 통해 검출하는 형태로 기존에 사용되던 크로마틴 면역침강법을 수정하였다.
제안 방법
- 95℃에서 5분간 20 μL의 10 mM ABC 용액으로 용출한 후 용출 용액을 모아 56℃에서 30분간 10 mM DTT 처리를 하였다.
- 강한 세척 과정을 수행한 후에 비드에 남아 있는 단백질은 열을 가해 역가교 시킨 후 분리하여 질량분석기를 통해 분석하였다. Formaldehyde에 의한 가교 효과를 확인하기 위해 순수한 단백질만을 사용하여 결과를 비교하였다 (Fig. 2). 순수한 단백질의 경우 가교를 진행한 경우에만 목적 단백질을 검출할 수 있었다.
- 이후 앱타머 말단에 있는 비오틴을 이용하여 앱타머-단백질 결합체를 특이적으로 스트랩타아비딘이 고정되어 있는 마그네틱 비드에 고정한다. 강한 세척 과정을 수행한 후에 비드에 남아 있는 단백질은 열을 가해 역가교 시킨 후 분리하여 질량분석기를 통해 분석하였다. Formaldehyde에 의한 가교 효과를 확인하기 위해 순수한 단백질만을 사용하여 결과를 비교하였다 (Fig.
- 본 연구에서는 질병 진단을 위해 앱타머를 활용함에 있어 앱타머의 목적 단백질이 되는 바이오마커를 직접 검출하는 방법을 고안하였다. 단백질 검출을 위한 항체 사용 대신 앱타머로 목적 단백질을 분리하였고, 목적 단백질이 결합하는 DNA 혹은 RNA 시퀀스를 찾는 것이 아니라 목적 단백질 자체를 질량분석기를 통해 검출하는 형태로 기존에 사용되던 크로마틴 면역침강법을 수정하였다. 그 결과 혈청과 같은 수 mg/mL의 농도를 가지는 단백질 혼합물 속에 존재하는 목적 단백질 트롬빈을 1.
- Formaldehyde의 경우 크기가 작고 반응성이 좋기 때문에 가교제로 사용하게 되면 주변의 단백질들도 비특이적 앱타머와 결합하는 확률이 늘어날 수 있다. 따라서 이후 실험 초기에 앱타머와 목적 단백질의 용액 내 결합 시 경쟁 물질을 넣어주어 앱타머와 결합력이 좋은 목적 단백질만 가교 시에 유리하게 하는 것과 formaldehyde의 가교 반응 조건을 최적화 하였다.
- 단백질의 분석에 질량분석기를 이용한다면 질량분석기 자체의 검출한도도 문제가 될 수 있지만 본 연구에서 사용한 LTQ-Orbitrap과 같은 고감도의 질량분석기를 활용함으로써 해결할 수 있다. 실험적인 단백질의 검출 한도를 확인하기 위한 예비 실험을 수행하였다. 앞서 실험한 조건인 1.
- 앱타머를 미끼로 하여 목적 단백질을 검출하기 위해서 마이크로 마그네틱 비드를 사용하여 앱타머와 단백질의 결합체를 포획하는 방법을 시도하였다. 하지만 앞서 언급했듯이 많은 단백질이 혼합되어 있는 혈청과 같은 샘플에서 원하는 목적 단백질만을 분석하기 위해서는 비특이적으로 결합하여 분석되는 단백질들을 충분히 제거해주어야 한다.
- 또한 분석된 단백질은 마이크로 마그네틱 비드나 단백질-단백질 결합을 통해서 검출되는 것이 아닌 앱타머와의 특이적 결합력으로 인해 검출되는 것을 확인하였다. 앱타머와 목적 단백질의 반응 시 0.01% tween 20를 경쟁 물질로 사용하여 특이적 결합력을 높였으며 최종 농도 2% formaldehyde를 넣은 반응 용액을 상온에서 10분간 반응시켜 formaldehyde를 사용하지 않았을 때 분석하지 못했던 트롬빈을 혈청 내에서 분석할 수 있었다. 추후 마이크로 비드 대신 나노 파티클 같은 형태의 고정체를 사용하게 된다면 표면적을 줄이면서도 목적 단백질과의 반응 가능성을 높임으로써 비특이적 결합을 줄이고 보다 개선된 단백질 검출이 이루어질 수 있을 것으로 기대한다.
- 실험 과정에서 앱타머와 목적 단백질의 결합 및 최종적인 목적 단백질의 검출까지 영향을 줄 수 있는 여러 조건들이 존재한다. 우선 앱타머-목적 단백질 결합체를 포획하는 스트렙 타아비딘 마그네틱 비드의 표면을 앱타머-목적 단백질 결합체와 반응하기 전에 차단제를 처리하였다. 일반적으로 차단제로 사용하는 1% casein 용액을 스트렙타아비딘 마그네틱 비드에 상온에서 1시간 반응 후 세척하여 이용한 결과 이전보다 비특이적 결합이 줄어드는 것을 확인했으나 여전히 다른 단백질들에 의해 목적 단백질을 분석하는데 어려움이 있었다.
- 따라서 본 연구에서는 기존에 크로마틴 면역침강법 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) [12,13]를 수정하여 새롭게 앱타머의 목적 단백질을 검출하는 방법을 제시하고자 하였다. 이를 위한 모델 시스템으로 DNA 앱타머인 트롬빈 (thrombin) 앱타머를 미끼로, 트롬빈을 목적 단백질로 사용하였고 혈청 내에서 트롬빈을 검출할 수 있는 지에 대해 확인하고자 하였다 [14,15]. 반응에 필요한 실험 조건들을 최적화 하였고, 그 결과 혈청 내에 존재하는 단백질들에 의한 비특이적 결합은 줄이면서 트롬빈의 검출을 확인할 수 있었다.
- 하지만 앞서 언급했듯이 많은 단백질이 혼합되어 있는 혈청과 같은 샘플에서 원하는 목적 단백질만을 분석하기 위해서는 비특이적으로 결합하여 분석되는 단백질들을 충분히 제거해주어야 한다. 이를 위해 기존의 크로마틴 면역침강법을 수정한 새로운 분석 방법을 고안하였다 (Fig. 1). 먼저 앱타머의 5' 말단에 비오틴을 연결한 후 혈청과 섞어서 반응하였다.
- 기본적으로 앱타머와 목적 단백질이 결합하는 반응 시 비오틴과 sheared salmon sperm DNA를 넣어주지만 추가로 계면활성제를 넣어주어 실제 결합력 있는 단백질들만 앱타머 근처에서 반응할 수 있또록 하였다. 이전 비드 표면 차단 실험과 별도로 진행하였으며 사용한 계면활성제는 tween 20와 triton X-100 두 가지 종류이고 4개의 농도 조건에서 실험하였다. 트롬빈 앱타머의 SELEX 과정에서 사용한 SELEX 버퍼 용액에 최종 농도 0.
- 그 후 상온에서 흔들며 30분간 반응하였다. 최종 농도 0.05% tween 20가 포함된 트롬빈 SELEX 버퍼로 세척한 후 질량 분석을 위해 염을 제거하고 용출 용액으로 바꾸기 위해 10 mM ammonium bicarbonate (ABC) 용액으로 세척을 마무리 하였다. 95℃에서 5분간 20 μL의 10 mM ABC 용액으로 용출한 후 용출 용액을 모아 56℃에서 30분간 10 mM DTT 처리를 하였다.
- 팹타이드는 0.5% formic acid가 포함된 acetotonitrile 용매를 0.3 μL/min의 속도로 0-90%까지 농도 구배를 주어 1시간 동안 LTQ-Orbitrap 질량 분석기 (Thermo Finnigan)를 통해 분석하였다.
- 순수한 단백질의 경우 가교를 진행한 경우에만 목적 단백질을 검출할 수 있었다. 하지만 목적 단백질이 혈청 내에 섞이고 양이 줄어들 경우 가교에 의한 효과를 확인할 수 없었기 때문에 반응 조건의 최적화를 진행하였다.
- 01% tween 20를 반응 용액에 경쟁 물질로 사용하는 것이 가장 좋음을 확인하였다. 하지만 이 경우에도 여전히 비특이적인 단백질에 의해 목적 단백질인 트롬빈이 우선 검출되지 않아 이후 실험에서 formaldehyde 농도, 가교 처리한 온도 및 처리시간, 가교 후 스트렙타아비딘 마그네틱 비드와의 결합 시간, 앱타머-목적 단백질이 포획된 마그네틱 비드의 세척 조건에 관한 최적화 실험을 계속 진행하였다 (Fig. 4(a)).
- 앱타머가 마이크로 비드와 고정된 상태에서 리간드를 만나는 것이 아니기 때문에 좀더 자유로운 상태로 반응에 참여하게 되므로 목적 단백질과의 결합이 유리할 것으로 기대하였다. 혈청 내에 앱타머와 목적 단백질의 결합체가 이후의 실험 과정에서 유지되도록 fomaldehyde를 처리하여 가교하였다. Formaldehyde에 의해 단백질의 amine기와 nuleotide의 base 부분 amine기가 공유 결합을 하게 되기 때문에 샘플 손실의 걱정 없이 좀더 강한 세척과정을 수행할 수 있게 됨으로써 비특이적 결합을 하는 다른 단백질들의 제거 효과 역시 증가하였다.
대상 데이터
- 11 cm × 129 μm 크기의 미세관에 6-7 cm 길이로 C18 비드(Vydac 218TP51)를 충진하여 펩타이드를 로딩하였고 분석에 사용하였다.
- 5' 말단에 비오틴을 고정한 트롬빈 앱타머 500 pmol을 단백질과의 반응 전에 95℃에서 2분간 가열한 후 얼음에서 식히고 앱타머를 포획할 때 사용할 스트렙타아비딘 마그네틱 비드는 사용전에 1% casein 용액으로 상온에서 1시간 동안 표면을 차단한 후 트롬빈 SELEX 버퍼로 [14] 세척하여 실험에 사용하였다.
- 5' 말단에 biotinylation 되어 있는 트롬빈 앱타머 (5'biotin-GGTTGGTGTGGTTGG=4')는 (주)바이오니아에 의뢰하여 화학적으로 합성하였다. 비오틴 (biotin), tween 20, 37% formaldehyde, dithiothreitol, iodoacetamide, 트롬빈, casein은 시그마 알드리치 코리아(주)에서 구입하였다. 실험에 사용한 혈청은 (주)제노프라에서 제공 받았다.
- 질량 분석을 위한 펩타이드 샘플을 얻기 위해 시퀀싱 등급의 트립신은 Promega 제품을 사용하였다. 스트렙타아비딘 (streptavidin)이 고정화 되어 있는 마그네틱 비드는 Invitrogen에서 구입하였다.
- 비오틴 (biotin), tween 20, 37% formaldehyde, dithiothreitol, iodoacetamide, 트롬빈, casein은 시그마 알드리치 코리아(주)에서 구입하였다. 실험에 사용한 혈청은 (주)제노프라에서 제공 받았다. 질량 분석을 위한 펩타이드 샘플을 얻기 위해 시퀀싱 등급의 트립신은 Promega 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 혈청은 (주)제노프라에서 제공 받았다. 질량 분석을 위한 펩타이드 샘플을 얻기 위해 시퀀싱 등급의 트립신은 Promega 제품을 사용하였다. 스트렙타아비딘 (streptavidin)이 고정화 되어 있는 마그네틱 비드는 Invitrogen에서 구입하였다.
데이터처리
- 3 μL/min의 속도로 0-90%까지 농도 구배를 주어 1시간 동안 LTQ-Orbitrap 질량 분석기 (Thermo Finnigan)를 통해 분석하였다. MS/MS를 통한 펩타이드의 분석은 SEQUEST를 통해 단백질 데이터베이스를 이용하여 분석하였고 MS spectra의 분석 기준은 cross-correlation score(Xcorr) 값이 +1 charged tryptic peptide의 경우 2.5 이상, +3 charged peptide의 경우에는 3.0 이상으로 삼았다.
성능/효과
- 단백질 검출을 위한 항체 사용 대신 앱타머로 목적 단백질을 분리하였고, 목적 단백질이 결합하는 DNA 혹은 RNA 시퀀스를 찾는 것이 아니라 목적 단백질 자체를 질량분석기를 통해 검출하는 형태로 기존에 사용되던 크로마틴 면역침강법을 수정하였다. 그 결과 혈청과 같은 수 mg/mL의 농도를 가지는 단백질 혼합물 속에 존재하는 목적 단백질 트롬빈을 1.5 ng까지 앱타머와의 가교를 통해 검출할 수 있었다. 또한 분석된 단백질은 마이크로 마그네틱 비드나 단백질-단백질 결합을 통해서 검출되는 것이 아닌 앱타머와의 특이적 결합력으로 인해 검출되는 것을 확인하였다.
- 5 ng까지 앱타머와의 가교를 통해 검출할 수 있었다. 또한 분석된 단백질은 마이크로 마그네틱 비드나 단백질-단백질 결합을 통해서 검출되는 것이 아닌 앱타머와의 특이적 결합력으로 인해 검출되는 것을 확인하였다. 앱타머와 목적 단백질의 반응 시 0.
- 이를 위한 모델 시스템으로 DNA 앱타머인 트롬빈 (thrombin) 앱타머를 미끼로, 트롬빈을 목적 단백질로 사용하였고 혈청 내에서 트롬빈을 검출할 수 있는 지에 대해 확인하고자 하였다 [14,15]. 반응에 필요한 실험 조건들을 최적화 하였고, 그 결과 혈청 내에 존재하는 단백질들에 의한 비특이적 결합은 줄이면서 트롬빈의 검출을 확인할 수 있었다. 추후 이와 같은 방법을 통해 다양한 목적 단백질을 가지는 여러 개의 앱타머를 동시에 이용한 바이오마커 진단 시스템의 개발, 혹은 혈청 내에 단백질을 이용해 SELEX한 새로운 앱타머의 리간드 동정 등 다양한 형태의 진단 시스템 개발이 가능할 것으로 기대한다.
- 3). 분석 시 검출된 트롬빈의 펩타이드 시퀀스는 같았고 펩타이드의 검출 횟수로 비교하였을 때 최종 농도 0.01% tween 20를 반응 용액에 경쟁 물질로 사용하는 것이 가장 좋음을 확인하였다. 하지만 이 경우에도 여전히 비특이적인 단백질에 의해 목적 단백질인 트롬빈이 우선 검출되지 않아 이후 실험에서 formaldehyde 농도, 가교 처리한 온도 및 처리시간, 가교 후 스트렙타아비딘 마그네틱 비드와의 결합 시간, 앱타머-목적 단백질이 포획된 마그네틱 비드의 세척 조건에 관한 최적화 실험을 계속 진행하였다 (Fig.
- 앞서 실험한 조건인 1.5 μg 트롬빈을 1000배 희석하여 혈청 내에 1.5 ng의 트롬빈이 검출 가능한지 확인하였을 때 분석이 가능한 것을 확인하였다 (Fig. 5).
- 이전 비드 표면 차단 실험과 별도로 진행하였으며 사용한 계면활성제는 tween 20와 triton X-100 두 가지 종류이고 4개의 농도 조건에서 실험하였다. 트롬빈 앱타머의 SELEX 과정에서 사용한 SELEX 버퍼 용액에 최종 농도 0.001, 0.01, 0.05, 0.1%의 계면활성제를 넣어주었을 때 목적 단백질인 트롬빈을 검출할 수 있었다(Fig. 3). 분석 시 검출된 트롬빈의 펩타이드 시퀀스는 같았고 펩타이드의 검출 횟수로 비교하였을 때 최종 농도 0.
후속연구
- 하지만 목적 단백질의 양은 극소량으로 줄었고 혈청 내 다른 단백질의 양은 상대적으로 많아졌기 때문에 이를 분석하였을 때 이전 결과들에 비해 다른 비특이적 단백질들의 검출이 우선 분석되고 검출되는 횟수도 늘었다. 단백질의 검출 한도는 질병 여부와 밀접한 관련이 있기 때문에 좀더 정밀한 실험이 수행되어야 할 것이다.
- 추후 실제 환자 진단에 응용하기 위해서는 앞서 언급했던 극소량의 단백질을 검출할 수 있는지가 중요하다. 단백질의 분석에 질량분석기를 이용한다면 질량분석기 자체의 검출한도도 문제가 될 수 있지만 본 연구에서 사용한 LTQ-Orbitrap과 같은 고감도의 질량분석기를 활용함으로써 해결할 수 있다. 실험적인 단백질의 검출 한도를 확인하기 위한 예비 실험을 수행하였다.
- 본 연구에서 목적 단백질을 검출하는 방법에 있어서 전기적인 바이오마커 검출 센서나 형광 물질을 이용한 형광 이미징 등 앱타멀르 이용한 간접적 검출 방법 [8,9], 즉 목적 단백질에 의해 만들어지는 신호를 이용한 검출이 아닌, 앱타머를 미끼로 하여 직접적인 동정이 진행되면 정확한 진단을 할 수 있고, 또한 한 환자의 혈청에서부터 여러 질병에 관한 바이오마커를 검출하고자 할 때에도 각각의 미끼로부터 얻어진 바이오마커에 대한 동정이 필요하다. 따라서 본 연구에서 제안하고 있는 방법을 이용하게 되면, 검출된 단백질을 질량분선기를 통하여 분석하기 때문에 여러 단백질이 섞여 있는 조건에서도 정확하게 목적 단백질을 검출해 낼 수 있다.
- 앱타머는 쉽게 합성이 가능하고 단백질인 항체에 비해 안정하기 때문에 다양한 형태로 응용되고 있는데, 그 중 질병 진단과 관련한 바이오마커 검출에 있어 in vivo 방법과 in vitro 방법 모두 연구되고 있다. 본 연구에서 목적 단백질을 검출하는 방법에 있어서 전기적인 바이오마커 검출 센서나 형광 물질을 이용한 형광 이미징 등 앱타멀르 이용한 간접적 검출 방법 [8,9], 즉 목적 단백질에 의해 만들어지는 신호를 이용한 검출이 아닌, 앱타머를 미끼로 하여 직접적인 동정이 진행되면 정확한 진단을 할 수 있고, 또한 한 환자의 혈청에서부터 여러 질병에 관한 바이오마커를 검출하고자 할 때에도 각각의 미끼로부터 얻어진 바이오마커에 대한 동정이 필요하다. 따라서 본 연구에서 제안하고 있는 방법을 이용하게 되면, 검출된 단백질을 질량분선기를 통하여 분석하기 때문에 여러 단백질이 섞여 있는 조건에서도 정확하게 목적 단백질을 검출해 낼 수 있다.
- 추후 마이크로 비드 대신 나노 파티클 같은 형태의 고정체를 사용하게 된다면 표면적을 줄이면서도 목적 단백질과의 반응 가능성을 높임으로써 비특이적 결합을 줄이고 보다 개선된 단백질 검출이 이루어질 수 있을 것으로 기대한다. 본 연구에서는 모델 시스템으로 트롬빈을 사용하였으나 혈청 내에 존재하는 질병 바이오마커인 CEA, PSA, AFP와 같은 단백질에 대한 앱타머를 사용하여 적용한다면 단독으로 또는 복합적으로 여러 개의 바이오마커에 대한 진단 시스템으로 개발이 가능할 것이다. 이런 복합 시스템이 개발된다면 환자의 혈청만을 이용해 여러 질병에 대한 진단을 한 번에 보다 정확히 진행할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 모델 시스템으로 트롬빈을 사용하였으나 혈청 내에 존재하는 질병 바이오마커인 CEA, PSA, AFP와 같은 단백질에 대한 앱타머를 사용하여 적용한다면 단독으로 또는 복합적으로 여러 개의 바이오마커에 대한 진단 시스템으로 개발이 가능할 것이다. 이런 복합 시스템이 개발된다면 환자의 혈청만을 이용해 여러 질병에 대한 진단을 한 번에 보다 정확히 진행할 수 있을 것으로 기대된다.
- 01% tween 20를 경쟁 물질로 사용하여 특이적 결합력을 높였으며 최종 농도 2% formaldehyde를 넣은 반응 용액을 상온에서 10분간 반응시켜 formaldehyde를 사용하지 않았을 때 분석하지 못했던 트롬빈을 혈청 내에서 분석할 수 있었다. 추후 마이크로 비드 대신 나노 파티클 같은 형태의 고정체를 사용하게 된다면 표면적을 줄이면서도 목적 단백질과의 반응 가능성을 높임으로써 비특이적 결합을 줄이고 보다 개선된 단백질 검출이 이루어질 수 있을 것으로 기대한다. 본 연구에서는 모델 시스템으로 트롬빈을 사용하였으나 혈청 내에 존재하는 질병 바이오마커인 CEA, PSA, AFP와 같은 단백질에 대한 앱타머를 사용하여 적용한다면 단독으로 또는 복합적으로 여러 개의 바이오마커에 대한 진단 시스템으로 개발이 가능할 것이다.
- 추후 실제 환자 진단에 응용하기 위해서는 앞서 언급했던 극소량의 단백질을 검출할 수 있는지가 중요하다. 단백질의 분석에 질량분석기를 이용한다면 질량분석기 자체의 검출한도도 문제가 될 수 있지만 본 연구에서 사용한 LTQ-Orbitrap과 같은 고감도의 질량분석기를 활용함으로써 해결할 수 있다.
- 반응에 필요한 실험 조건들을 최적화 하였고, 그 결과 혈청 내에 존재하는 단백질들에 의한 비특이적 결합은 줄이면서 트롬빈의 검출을 확인할 수 있었다. 추후 이와 같은 방법을 통해 다양한 목적 단백질을 가지는 여러 개의 앱타머를 동시에 이용한 바이오마커 진단 시스템의 개발, 혹은 혈청 내에 단백질을 이용해 SELEX한 새로운 앱타머의 리간드 동정 등 다양한 형태의 진단 시스템 개발이 가능할 것으로 기대한다.
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