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문제 정의
- 갈근의 주요 성분인 puerarin과 daidzein이 신경보호 효과가 있으며 갈근 추출물이 뇌 내 norepinephrine과 dopamine농도를 증가시킨다는 이전의 연구는 갈근 추출물이 중풍으로 인한 뇌세포 사멸로부터 신경세포를 보호하며 감각 운동 실조를 개선할 가능성이 있음을 시사한다. 본 연구에서는 이러한 가능성을 객관적으로 검증하기 위하여 중대뇌동맥 폐쇄 모델을 이용하여 국소 뇌허혈 유발한 후 갈근을 투여하고 뇌경색 비율을 측정하여 신경보호 효과를 확인하였으며 rotarod test와 balance beam test를 수행하여 감각운동 실조를 개선하는지를 평가하였다.
제안 방법
- 사육실 내의 온도는 22.0±2.0℃, 습도는 55±5%로 유지하였고 낮과 밤의 주기는 각각 12시간으로 하였다.
- 모든 수술과정은 이소플루란을 2%로 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였으며, 체온이 37±0.5℃ 이하로 떨어지지 않도록 체온 유지장치를 이용하였다.
- 갈근 100g을 세절하여 70% EtOH을 용매로 수욕상에서 3시간 추출하였다. 추출액은 여과하였으며 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 위와 같은 방법으로 다시 2회 더 반복하여 총 24.
- 국소뇌허혈 모델은 Zea longa 등의 방법28)을 응용하여 사용하였다. 먼저, 12 mm의 4-0 나이론 봉합사(Dafilon, Malaysia)를 실리콘(Xantopren, Bayer Dental, Germany)으로 코팅하여 지름이 0.
- 20 mm가 되게 제작하여 실험에 사용하였다. 생쥐를 70% N2O와 30% O2가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인익돌근구개동맥을 전기소작한 뒤, 외경동맥을 자르고 probe를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 10 mm정도 삽입한 후 실로 고정하였다.
- 생쥐를 70% N2O와 30% O2가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인익돌근구개동맥을 전기소작한 뒤, 외경동맥을 자르고 probe를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 10 mm정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복시켰다.
- 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복시켰다. 유발 90분 후 같은 방법으로 재마취하여 probe를 후퇴시켜 재관류시켰다. 재관류 직전에 시료를 한번 경구투여 하였으며, 대조군은 같은 부피의 20% DMSO를 경구 투여하였다.
- 유발 90분 후 같은 방법으로 재마취하여 probe를 후퇴시켜 재관류시켰다. 재관류 직전에 시료를 한번 경구투여 하였으며, 대조군은 같은 부피의 20% DMSO를 경구 투여하였다. 모든 수술과정은 이소플루란을 2%로 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였으며, 체온이 37±0.
- 5℃ 이하로 떨어지지 않도록 체온 유지장치를 이용하였다. 실험군은 중대뇌동맥을 폐쇄하여 뇌허혈을 유발한 대조군, 뇌허혈 유발 후 갈근 추출물을 경구 투여한 갈근군, 혈관내 봉합사 삽입과정을 제외한 모든 수술과정을 시행한 Sham군으로 구분하였으며, 각 실험군은 5 마리씩으로 구성하였다.
- 뇌허혈 유발 24시간 후에 경추탈골 시키고, 2분 이내에 뇌를 적출한 후 mouse brain matrix를 이용하여 2 mm 두께로 4개의 절편으로 나누었다. 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)가 들어 있는 16 well plate에 조직을 충분히 담그고 37℃에서 30분 동안 염색하였다.
- 염색된 4개의 조직을 디지털 카메라로 촬영한 후 이미지 분석프로그램인 옵티마스 6.5 (Optimas 6.5, Bioscan)를 이용하여 뇌경색 면적을 측정하였다. 뇌경색 비율(%)을 아래 수학식으로 계산하였다.
- 운동 기능의 조정, 감각운동 조화와 자발운동을 관찰하기 위해 Rogers 등29)과 Zhang 등30)의 방법을 응용하여 뇌허혈 유발 후 23시간에 실시하였다. rotarod의 회전봉이 0에서 60rpm까지 5분간 회전하는 가속회전법을 사용하였고, 뇌허혈이 유발된 생쥐를 봉의 가운데에 균형을 잡아 놓은 후, 회전을 시작한 시간부터 생쥐가 떨어질 때까지의 시간(latency time) 을 측정하여 평가하였다.
- 의 방법을 응용하여 뇌허혈 유발 후 23시간에 실시하였다. rotarod의 회전봉이 0에서 60rpm까지 5분간 회전하는 가속회전법을 사용하였고, 뇌허혈이 유발된 생쥐를 봉의 가운데에 균형을 잡아 놓은 후, 회전을 시작한 시간부터 생쥐가 떨어질 때까지의 시간(latency time) 을 측정하여 평가하였다. 각 생쥐마다 5회 실시하여 최고치와 최저치를 제외한 중간 3개 값의 평균을 수치로 사용하였다.
- 을 응용하여 뇌허혈 유발 후 23시간에 실시하였다. 먼저 너비 3 cm, 길이 150 cm의 나무로 된 봉을 바닥에서 약 50 cm 높이에 걸쳐 놓고, 생쥐를 봉의 중심에 균형을 잡게 놓은 후 30초간 생쥐의 행동을 보고 3명의 관찰자가 그 점수를 매겼으며 점수의 평가기준은 다음과 같다. 0점; 봉에서 균형을 유지할 수 없는 상태, 1점; 30초간 균형을 잡고 봉의 길이 방향으로 몸을 트는 상태, 3점; 2점에 몸을 튼 상태에서 봉의 길이 방향으로 걷되 스텝의 50% 이상이 미끄러지는 상태, 4점; 3점에서 50% 이하로 미끄러지는 상태, 5점; 4점에서 1스텝 정도 미끄러지는 상태, 6점; 5점에서 미끄러지는 스텝이 없이 자유롭게 걷는 상태로 정하여 실시하였다.
- 0점; 봉에서 균형을 유지할 수 없는 상태, 1점; 30초간 균형을 잡고 봉의 길이 방향으로 몸을 트는 상태, 3점; 2점에 몸을 튼 상태에서 봉의 길이 방향으로 걷되 스텝의 50% 이상이 미끄러지는 상태, 4점; 3점에서 50% 이하로 미끄러지는 상태, 5점; 4점에서 1스텝 정도 미끄러지는 상태, 6점; 5점에서 미끄러지는 스텝이 없이 자유롭게 걷는 상태로 정하여 실시하였다. 생쥐마다 매 3회 실시하여 평균값을 데이터로 사용하였다.
- 갈근 추출물이 중대뇌동맥 폐쇄 모델에서 신경보호효과와 감각 운동기능의 회복 효과가 있는지를 알아보기 위해서 뇌경색 비율을 관찰하고 rotarod test와 balance beam test를 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 실험동물은 ㈜샘타코(한국)에서 구입한 체중 29-31g ICR 수컷 생쥐를 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 일주일간 실험 환경에 적응시켰으며, 실험 12시간 전에 절식시켜 실험에 사용하였다. 사육실 내의 온도는 22.
- 실험에 사용된 갈근(Pueraria lobata)은 경북 영천에서 채취한 것을 경희대학교 한의과대학 김호철 교수의 동정을 받아 (Voucher No.12082702) 사용하였다.
- 을 응용하여 사용하였다. 먼저, 12 mm의 4-0 나이론 봉합사(Dafilon, Malaysia)를 실리콘(Xantopren, Bayer Dental, Germany)으로 코팅하여 지름이 0.20 mm가 되게 제작하여 실험에 사용하였다. 생쥐를 70% N2O와 30% O2가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 분리하였다.
데이터처리
- 데이터는 mean±SEM으로 나타내었으며, 대조군과 실험군의 평균차이는 Student t-test로 검정하여 p<0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- rotarod의 회전봉이 0에서 60rpm까지 5분간 회전하는 가속회전법을 사용하였고, 뇌허혈이 유발된 생쥐를 봉의 가운데에 균형을 잡아 놓은 후, 회전을 시작한 시간부터 생쥐가 떨어질 때까지의 시간(latency time) 을 측정하여 평가하였다. 각 생쥐마다 5회 실시하여 최고치와 최저치를 제외한 중간 3개 값의 평균을 수치로 사용하였다.
- Values are mean±SEM for 5 mice. Data obtained were analyzed by Student t-test.
이론/모형
- 뒷발의 운동기능을 측정함과 동시에 균형감각, 전정기능 등을 관찰하기 위하여 Soblosky 등의 방법31)을 응용하여 뇌허혈 유발 후 23시간에 실시하였다. 먼저 너비 3 cm, 길이 150 cm의 나무로 된 봉을 바닥에서 약 50 cm 높이에 걸쳐 놓고, 생쥐를 봉의 중심에 균형을 잡게 놓은 후 30초간 생쥐의 행동을 보고 3명의 관찰자가 그 점수를 매겼으며 점수의 평가기준은 다음과 같다.
성능/효과
- 뇌경색 비율은 20% DMSO를 투여한 대조군에서 35.46±2.11%로 관찰되었고, 갈근 추출물 300 mg/kg를 경구투여한 군에서 25.7±3.99%로 관찰되었다.
- 국소뇌허혈 동물모델인 중대뇌동맥 폐쇄 모델을 이용하여 갈근 추출물의 신경보호 효과와 감각운동 기능에 끼치는 영향에 대하여 평가한 결과 갈근 추출물은 허혈성 뇌손상으로부터 뇌경색 비율을 유의하게 감소시켰으며 감각운동 기능의 지표인 유지시간(latency time)을 연장시켰다.
- 갈근 추출물은 중대뇌동맥 폐쇄 모델에서 재관류 직전 300mg/kg의 농도로 1회 경구 투여하였을 때 27.3%의 유의한 신경보호 효과를 나타내었다. 10~20분간 허혈을 유발시키면 중심부에서 신경세포들이 산발적으로 죽으며, 1시간 유발 시 중심부에 경색이 형성된다.
- 때문에 초기에 신경보호제를 투여하여 뇌경색 주변부 영역의 세포사멸을 막는 것이 중요하다. 중대뇌동맥 폐쇄 24시간 후에 뇌조직을 관찰하였을 때 재관류 직전 갈근을 투여한 경우 대뇌피질과 선조체의 세포사멸이 현저하게 억제되었다. 이러한 결과는 갈근 추출물이 신경보호제로 작용하여 세포자연사로부터 뇌경색 주변부 영역의 신경세포를 보호한 것을 의미한다.
- 갈근 추출물은 중풍 유발 23시간 이후 측정한 rotarod test에서 감각운동 기능의 지표인 유지시간(latency time)을 대조군에 비해 유의하게 연장시켰다. 중대뇌동맥 폐쇄 모델에서 뇌허혈이 유발된 쥐는 감각운동 기능의 중추가 손상되어 운동기능 조정(motor coordination), 감각운동 조화(sensory motor integration), 자발 운동(spontaneous locomotion) 기능이 저하된다35).
- 1. 갈근 추출물을 300 mg/kg의 용량으로 유발 90분 후 경구 투여한 결과 대조군에 비하여 뇌경색 비율을 27.3% 감소시켜 유의한 뇌신경 보호효과를 보였다.
- 2. 갈근 추출물은 Rotarod test에서 감각운동기능 실조에 대한 유의한 보호효과가 관찰되었지만 balance beam test에서는 유의한 차이를 보이지 않았다.
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