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문제 정의
- TGF-β에 의해 발현이 감소하는 유전자로 확인된 SGK1의 경우 많은 보고들을 통해 여러 가지 세포사멸 인자들의 활성을 억제하여 세포사멸을 억제한다는 보고가 있어[4,11,17], 본 연구에서는 SGK1의 발현 감소가 TGF-β에 의해 유도되는 세포 사멸 과정에 필수적인지 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 TGF-β에 의한 세포사멸 과정에서 중요한 기능을 담당하는 유전자를 탐색하기 위해 AML12 세포에 TGF-β를 처리하였을 때 발현이 변화되는 유전자를 microarray analysis를 통해 탐색하고자 하였다.
- 본 연구에서는 TGF-β에 의한 세포사멸 과정에서 중요한 기능을 담당하는 유전자를 탐색하기 위해 TGF-β에 의해 세포사멸이 유도되는 mouse hepatocytes AML12 세포에서 TGF-β 처리시 발현이 변화되는 유전자들을 탐색하였고, 그 결과 여러 가지 유전자들의 발현 변화를 관찰하였다.
- 앞선 실험결과 TDAG51의 발현이 TGF-β에 의해 증가함을 확인하였기 때문에 이후에는 TGF-β에 의한 세포사멸 과정에서 TDAG51의 발현이 미치는 영향을 확인하기 위해 siRNA를 이용하여 TDAG51의 발현을 억제하였을 때 TGF-β에 의해 유도되는 세포사멸이 억제되는지 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 이를 위해서 adenoviral vector를 이용하여 AML12 세포에 constitutive active (CA, T256D) mutant SGK1 혹은 kinase dead (KD, K127M) mutant SGK1을 발현시킨 후 각 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포사멸이 어떠한 영향을 받는지 확인하고자 하였다. Control로는 GFP 단백질을 발현하는 adenoviral vector를 사용하였다. Fig.
- 05% Tween20)으로 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 적당한 1차 항체와 반응시켰다. Horseradish peroxidase가 붙어있는 적당한 2차 항체와의 반응 후 enhanced chemiluminescence reagents (ECL, Amersham Bioscience)를 사용하여 각 단백질들의 발현 변화를 확인하였다.
- Hybridization은 dye-swapping과 함께 3번 반복해서 실시하였으며, data는 scatter plot smoother 'LOWESS' 방법을 사용한 intensity-dependent 방법으로 표준화하였다.
- TGF-β를 처리하지 않은 AML12 세포로부터 추출한 RNA는 reverse-transcription후 cDNA를 Cyanine3로 labeling하였으며, TGF-β를 한 시간 처리한 AML12 세포로부터 추출한 RNA는 역전사시킨 후 cDNA를 Cyanine5로 labeling하였다. Labeling을 위해서는 Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies Inc. USA)를 사용하였으며, 각각의 labeling된 cDNA들은 약 12,000개의 독립적인 mouse cDNA sequence를 가지는 Agilent Whole Mouse Genome 44K 4Plex cDNA microarray (Agilent Technologies Inc. USA)와 co-hybridization시켰다. Hybridization은 dye-swapping과 함께 3번 반복해서 실시하였으며, data는 scatter plot smoother 'LOWESS' 방법을 사용한 intensity-dependent 방법으로 표준화하였다.
- Microarray analysis는 Digital Genomics (Seoul, South Korea)에 의뢰하여 robotic operation에 의한 전자동 시스템으로 수행되었다. Total RNA는 TGF-β를 처리하지 않거나 한 시간 동안 처리한 AML12 세포로부터 RNeasy Mini Kit(QIAGEN Valencia, CA, USA)를 사용하여 제품 protocol에 따라 분리하였다.
- TGF-β를 시간 별로 처리한 AML12 세포의 lysates를 7.5-15% SDS-PAGE로 분리한 후 polyvinylidene difluoride membrane (Amersham Bioscience)으로 transfer 하였다.
- TGF-β를 처리하지 않은 AML12 세포로부터 추출한 RNA는 reverse-transcription후 cDNA를 Cyanine3로 labeling하였으며, TGF-β를 한 시간 처리한 AML12 세포로부터 추출한 RNA는 역전사시킨 후 cDNA를 Cyanine5로 labeling하였다.
- TGF-β에 의한 AML12 세포의 사멸과 세포주기 분석을 위해서 TGF-β를 시간 별로 처리한 후 AML12 세포를 75% ethanol에서 냉장상태로 24시간 동안 고정하였다.
- Total RNA는 TGF-β를 처리하지 않거나 한 시간 동안 처리한 AML12 세포로부터 RNeasy Mini Kit(QIAGEN Valencia, CA, USA)를 사용하여 제품 protocol에 따라 분리하였다.
- 고정된 세포의 핵을 propidium iodide (PI, 50 μg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액으로 37℃에서 30분간 염색하고, 유세포 측정기를 이용하여 세포주기와 사멸율을 분석하였다.
- 먼저 AML12 세포에 TGF-β를 처리하였을 때 세포사멸이 일어나는지 검증하였다.
- 본 연구에서는 TGF-β에 의한 세포사멸 과정에서 중요한 기능을 담당하는 유전자를 탐색하고자 TGF-β를 1시간 동안 처리한 AML12 세포와 TGF-β를 처리하지 않은 AML12 세포로부터 RNA를 분리한 후 microarray analysis를 통해 TGF-β 에 의해 발현이 변화되는 유전자들을 탐색하였다.
-
RT–PCR 분석
분리한 RNA를 260 nm에서 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 정량 한 후 Maxime RT-PCR Premix kit (Intron, Korea)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 세포에서 분리한 total RNA 250 ng에 각각의 유전자에 특이적인 primer를 20 pmole씩 첨가한 후 RNase-free water로 전체 volume이 20 ul가 되게 하였다.
- 5-15% SDS-PAGE로 분리한 후 polyvinylidene difluoride membrane (Amersham Bioscience)으로 transfer 하였다. 비 특이적인 단백질들의 결합을 방지하기 위해 5% skim milk가 첨가된 TBST 용액(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% Tween20)으로 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 적당한 1차 항체와 반응시켰다. Horseradish peroxidase가 붙어있는 적당한 2차 항체와의 반응 후 enhanced chemiluminescence reagents (ECL, Amersham Bioscience)를 사용하여 각 단백질들의 발현 변화를 확인하였다.
- PCR은 94℃에서 45초, 72℃에서 45초로 25회 반복 반응하였다. 얻어진 PCR product를 1.5% agarose gel에서 전기영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 각 유전자들의 발현 정도를 확인하였다. 실험에 사용한 각 유전자에 특이적인 primer sequence는 Table 1에 기술하였다.
- 세포에서 분리한 total RNA 250 ng에 각각의 유전자에 특이적인 primer를 20 pmole씩 첨가한 후 RNase-free water로 전체 volume이 20 ul가 되게 하였다. 이 혼합물을 Maxime RT-PCR Premix와 섞은 후 45℃에서 30분간 reverse transcription 반응 후 94℃ 에서 5분 간 가열하여 reverse transcriptase의 활성을 없애고 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 94℃에서 45초, 72℃에서 45초로 25회 반복 반응하였다.
- 이를 위해서 adenoviral vector를 이용하여 AML12 세포에 constitutive active (CA, T256D) mutant SGK1 혹은 kinase dead (KD, K127M) mutant SGK1을 발현시킨 후 각 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포사멸이 어떠한 영향을 받는지 확인하고자 하였다.
- 일차적으로 선별된 유전자들 가운데 세포사멸과 관련이 있다는 보고가 있는 6개의 유전자들(TGF-β에 의해 발현이 증가한 유전자 PAC1, TDAG51, EGR2와 감소한 유전자 SGK1, PLK2, ALCAM)을 선택하여 각 유전자들의 발현이 TGF-β에 의해 변화되는지 RT-PCR과 Western blot analysis를 통해 검증하였다.
대상 데이터
- Constitutive active (CA, T256D) mutant SGK1과 kinase dead (KD, K127M) mutant SGK1을 발현하는 adenoviral vector와 GFP를 발현하는 adenoviral vector들은 모두 허강민 교수(충남대학교 의과대학)로부터 제공 받아 본 실험에 사용하였다[23].
- Murine hepatocytes cell line인 AML12 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였으며, insulin (5 μg/ml), transferrin (5 μg/ml), selenium (5 μg/ml), dexamethasone (40 ng/ml)과 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Invitrogen)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium and Ham’s F12 (DMEM/F12) medium을 이용하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 키웠다.
- PAC1, TDAG51, EGR2, GFP에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. PARP, SGK1, PLK2, ALCAM에 대한 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였으며, Flag과 α-tubulin에 대한 항체는 Sigma로 부터 구입하였다.
- PARP, SGK1, PLK2, ALCAM에 대한 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였으며, Flag과 α-tubulin에 대한 항체는 Sigma로 부터 구입하였다.
성능/효과
- AML12 세포에 5 ng/ml의 TGF-β를 처리한 후 세포의 형태를 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 결과 24 시간 후부터 세포의 부피 감소와 더불어 세포사멸 정도가 급격히 증가하였으며, 36시간 후에는 거의 모든 세포들이 사멸됨을 볼 수 있었다(Fig. 1A).
- Fig. 4에서 볼 수 있듯이, GFP나 kinase dead form의 SGK1을 과발현시켰을 경우에는 TGF-β에 의해 세포사멸이 유도되지만 constitutive active 형태의 SGK1을 과발현시킨 AML12 세포의 경우 TGF-β에 의한 세포사멸이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
- 일차적으로 선별된 유전자들 가운데 세포사멸과 관련이 있다는 보고가 있는 6개의 유전자들(TGF-β에 의해 발현이 증가한 유전자 PAC1, TDAG51, EGR2와 감소한 유전자 SGK1, PLK2, ALCAM)을 선택하여 각 유전자들의 발현이 TGF-β에 의해 변화되는지 RT-PCR과 Western blot analysis를 통해 검증하였다. RT-PCR을 통해 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 조사한 결과 ALCAM을 제외한 5개 유전자의 발현이 microarray analysis 실험 결과와 일치함을 확인하였다(Fig. 2). 하지만 단백질 발현의 경우 TGF-β에 의해 발현이 증가한 유전자의 경우 TDAG51과 발현이 감소한 유전자인 SGK1만이 mRNA 발현과 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다(Fig.
- 그 결과 AML12 세포에서 TGF-β에 의해 932개의 유전자들의 발현이 변화됨을 확인하였고, 이 가운데 5배 이상 발현이 증가한 유전자들과 60% 이상 발현이 감소하는 유전자들을 일차적으로 선별하였다(Table 2)
- 또한 유세포분석기(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)를 사용하여 TGF-β에 의한 AML12 세포의 사멸 정도를 확인해 본 결과 세포사멸을 나타내는 Sub G1기의 세포 수가 TGF-β를 12시간 처리하였을 때 7.73%, 24시간 처리시 25.58%, 36시간 후에는 39.31%의 세포사멸이 일어남을 확인하였다(Fig. 1B).
- 이 가운데 세포사멸과 관련성이 높은 유전자들의 발현을 RT-PCR과 Western blot analysis를 통해 검증하였으며, 특히 TGF-β에 의한 serum and glucocorticoid-inducible protein kinase1 (SGK1)의 발현 감소가 TGF-β에 의해 유도되는 간세포의 사멸에 필수적임을 확인하였다.
- 이러한 결과들을 통해 TGF-β에 의해 AML12 세포의 세포사멸이 유도됨을 검증할 수 있었다.
- 이와 유사한 실험으로 세포사멸 과정에서 활성화되는 caspase 단백질에 의해 절단되는 PARP 단백질의 cleavage 를 관찰한 결과 TGF-β를 처리한 세포의 경우 24시간 이후부터 PARP 단백질의 cleavage가 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 1C).
- 하지만 TDAG51의 발현을 억제하여도 TGF-β에 의한 세포사멸에 아무런 영향을 미치지 못함을 확인하였다(data not shown).
- 하지만 단백질 발현의 경우 TGF-β에 의해 발현이 증가한 유전자의 경우 TDAG51과 발현이 감소한 유전자인 SGK1만이 mRNA 발현과 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다(Fig. 3)
후속연구
- 향후에는 어떠한 기작을 통해 TGF-β에 의해 SGK1의 발현이 감소하게 되는지 확인하고, TGF-β에 의한 세포사멸 과정에서 중요한 기능을 담당하는 여러 가지 단백질들의 활성에 미치는 SGK1의 역할을 규명하는 연구가 수행되어야 할 것이다.
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