[논문]3C (chromatin conformation capture): 크로마틴 입체 구조 연구를 위한 기법

김예운; 김애리

doi:10.5352/jls.2012.22.11.1587

3C (chromatin conformation capture): 크로마틴 입체 구조 연구를 위한 기법
3C (Chromatin Conformation Capture): A Technique to Study Chromatin Organization 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.22 no.11 = no.151, 2012년, pp.1587 - 1594

김예운 (부산대학교 자연과학대학 분자생물학과) , 김애리 (부산대학교 자연과학대학 분자생물학과)

초록
AI-Helper

3C는 진핵세포의 핵에서 크로마틴의 입체 구조/구성을 알아보는 연구 기법이다. 이 기법은 살아있는 세포를 포름알데히드로 처리하여 단백질들 사이의 결합 및 단백질과 DNA 사이의 결합을 고정시킨 후, 제한효소로 DNA를 절단하고, 그 절편들의 연결 빈도를 측정함으로써 DNA 절편 사이의 물리적 근접성을 보여준다. 이 기법을 이용하여 복합 유전자 좌위인 ${\beta}$-글로빈 좌위에서 locus control region이 전사가 활발한 유전자와 가까이 위치하고 있음이 밝혀졌으며, 이러한 결과는 크로마틴 입체 구조가 유전자 전사 조절에 관여함을 나타낸다. 또한 3C 기법은 ChIP 및 genome-wide sequencing과 결합되어 다양한 기술로 진화되었다. 본 총설은 3C의 원리 및 과정을 짚어보고, 3C 기법으로 밝혀진 ${\beta}$-글로빈 좌위의 크로마틴 입체 구조를 설명하고자 하며, 나아가 3C를 기본으로 한 다양한 응용 연구 기법도 살펴보고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

3C (chromatin conformation capture) is a technique to analyze chromatin organization in nuclei of eukaryotic cells. The procedure of 3C includes the formaldehyde treatment of cells to fix interactions between proteins and between proteins and DNA in chromatin, the digestion of fixed chromatin with restriction enzyme, and the ligation of fragmented DNA. The efficiency of DNA ligation represents proximity between DNA fragments in chromatin organization. Studies in the ${\beta}$-globin locus using 3C showed that the locus control region is in close proximity to the transcriptionally-active globin genes, indicating that chromatin organization has a role in transcriptional regulation of the genes. 3C has been advanced by combining with ChIP and genome-wide sequencing. This review presents the principle and procedure of the 3C technique, the chromatin organization of the ${\beta}$-globin locus explained by 3C, and advanced techniques based on 3C.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 총설에서는 3C 기법의 실험적 원리와 과정을 살펴보고, 이 기법을 통해 가장 많은 연구가 이루어진 β-글로빈 좌위(β-globin locus)를 모델로 3C 결과를 분석하여 크로마틴 입체 구성을 설명하고자 한다. 또한 3C 기법을 바탕으로 한 응용 기법들을 소개하고자 한다.
본 총설에서는 3C 기법의 실험적 원리와 과정을 살펴보고, 이 기법을 통해 가장 많은 연구가 이루어진 β-글로빈 좌위(β-globin locus)를 모델로 3C 결과를 분석하여 크로마틴 입체 구성을 설명하고자 한다.

제안 방법

따라서 각 DNA 절편들의 기본적인 연결 빈도는 일반적으로 분석하고자 하는 유전자 또는 좌위가 포함된 플라스미드(plasmid) DNA를 고정하지 않고 제한효소로 자른 후 다시 연결하여 대조군(control)으로 사용함으로써 보정된다. 또한 각 실험상의 연결 효율 차이는 대조군 유전자에 PCR 프라이머를 디자인하여 연결 빈도를 측정함으로써 보정한다. 따라서 측정된 연결 빈도는 특정 두 DNA 사이의 공간적 거리를 반영하며, 입체적 근접성을 보여준다.
그리고 대조군과 비교하여 실험군 시료의 연결 빈도를 결정한다. 또한 반복 실험(independent experiment)에서 생길 수 있는 제한효소 절단 효율 및 연결 효율은 대조군 프라이머를 이용하여 보정한다. 대표적인 대조군 프라이머로 ERCC3 (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 3) 유전자 내에서 고안된 것이 있으며, 이는 이 유전자가 모든 조직에서 비슷한 수준으로 발현되고 비슷한 크로마틴 입체 구조를 갖고 있을 것이라 생각되기 때문이다[10,27].
제한효소에 의해 생성된 DNA 절편들의 무작위적 연결 및 연결 선호도 그리고 PCR 프라이머 조합의 증폭 효율을 보정하기 위하여 대조군(control) DNA를 준비한다. 분석하고자 하는 좌위가 들어있는 Bacterial 또는 Yeast Artificial Chromosome (BAC or YAC) clone과 genomic DNA를 동량으로 혼합한 후, 고정하지 않은 상태에서 실험군에 사용한 것과 동일한 제한효소로 절단하고 연결효소로 연결한다[10,15,29]. 대체 방법으로 분석하고자 하는 제한효소 자리 주위의 DNA를 PCR로 합성하여 추출한 뒤, 같은 수의 DNA 가닥을 혼합하여 대조군을 만들 수도 있다.
제한효소 반응이 끝난 후, digested genomic DNA control (D)로 사용될 약간의 시료를 덜어낸다. 제한효소 자리의 절단 정도를 측정하기 위하여 덜어낸 UnD와 D control 시료에 proteinase K를 처리하고, 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 에탄올(ethanol) 침전법을 이용하여 DNA를 추출한 후, real-time PCR로 두 DNA를 비교 분석한다. 절단 정도는 분석하고자하는 제한효소 자리의 양쪽에 위치한 프라이머 조합들(Restriction site, R)과 제한효소 자리가 없는 부분의 프라이머 조합(Control, C)을 이용하여 qPCR에서 얻어진 Ct 값으로 계산한다.
한 좌위에서 여러 DNA 절편 사이의 연결 빈도를 측정하기 위하여 고정 절편(constant or anchor fragment)을 선정한 후, 이 절편의 한 쪽 프라이머와 주변 절편들의 프라이머를 각각 조합하여 PCR을 수행한다. 그리고 대조군과 비교하여 실험군 시료의 연결 빈도를 결정한다.

이론/모형

1). 정량적 분석을 위해 일반적으로 SYBR green 형광 기법을 이용한 real-time PCR 기법을 사용하며, 이때 프라이머를 제한효소에 의한 절단부위로부터 약 50 bp 근처에 고안하여 증폭된 DNA(amplicons)의 길이가 약 100 bp가 되도록 한다.

성능/효과

LCR의 HSs (hypersensitive sites)와 각 글로빈 유전자, 그리고 3’HS1 (좌위 3’ 말단의 HS)을 각각 다른 조각의 DNA로 나눌 수 있는 BglII나 HindIII와 같은 제한 효소를 이용한 3C 분석은 유전자와 LCR 부분은 물론 좌위 전체의 입체적 구성을 보여주었다.
대표적인 대조군 프라이머로 ERCC3 (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 3) 유전자 내에서 고안된 것이 있으며, 이는 이 유전자가 모든 조직에서 비슷한 수준으로 발현되고 비슷한 크로마틴 입체 구조를 갖고 있을 것이라 생각되기 때문이다[10,27]. 따라서 특정한 두 DNA 절편 사이(Two Fragments, TF)의 상대적 연결 빈도는 실험군 DNA (Ligated DNA, L)의 연결 빈도를 대조군 DNA (Control DNA, C)의 연결 빈도와 비교한 후, 그 값을 대조군 프라이머(ERCC3, ER)의 연결 빈도로 보정하여 얻어진다.
4)[1,6]. 분석하고자 하는 DNA 절편에 프라이머를 고안하여 PCR로 3C 시료를 분석하는 원래의 기법은 사용한 프라이머에 해당하는 결과만을 제공하지만, microarray나 genome-wide sequencing을 이용하면 3C 시료에서 형성된 DNA 절편들 사이의 연결을 광범위하게 분석할 수 있다. 4C(chromosome conformation capture-on-chip, circular chromosome conformation capture)는 또 한번의 제한효소(4 bp cutter) 처리와 연결 과정, 그리고 PCR을 통해 특정한 DNA 절편과 연결된 모든 절편들을 증폭시키고 그 절편들을 microarray로 분석하는 기법으로[25,31], 관심 있는 한 부분의 DNA와 물리적으로 가까이 있는 모든 DNA들에 대한 정보를 제공한다.
3C 기법은 단순한 원리와 실험 과정을 이용하여 입체 공간에서 크로마틴의 배열 상태를 보여준다. 이 기법을 통해 여러 유전자 좌위의 입체적 크로마틴 구조가 설명되었고, 이 구조들은 유전자 전사 조절에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 특히 β-글로빈 좌위들을 포함한 복합 좌위의 전사 조절을 위해 크로마틴 입체 구조가 결정적 역할을 하는 것으로 보인다.

후속연구

이러한 연구를 바탕으로 크로마틴 입체구조가 형성되는 기작, 히스톤 변형 및 뉴클레오좀 리모델링과 크로마틴 입체 구조 사이의 관계 등이 밝혀져야 할 것이며, 핵 내 공간적 위치와 크로마틴 입체 구조 형성 사이의 관계를 설명하는 것도 의미 있는 일일 것이다. 또한 다양한 조직 및 세포, 그리고 각 발생 단계에서 유전체 전체의 크로마틴 입체 구조를 분석한다면 각 세포 별로 전사 네트워크에 대한 기초 정보를 제공할 것이며, 이는 전사 조절 실패에 기인한 질병 치료 및 세포 분화 기술 개발 등의 다양한 분야에 새로운 미래를 제시할 것이다.
특히 β-글로빈 좌위들을 포함한 복합 좌위의 전사 조절을 위해 크로마틴 입체 구조가 결정적 역할을 하는 것으로 보인다. 이러한 연구를 바탕으로 크로마틴 입체구조가 형성되는 기작, 히스톤 변형 및 뉴클레오좀 리모델링과 크로마틴 입체 구조 사이의 관계 등이 밝혀져야 할 것이며, 핵 내 공간적 위치와 크로마틴 입체 구조 형성 사이의 관계를 설명하는 것도 의미 있는 일일 것이다. 또한 다양한 조직 및 세포, 그리고 각 발생 단계에서 유전체 전체의 크로마틴 입체 구조를 분석한다면 각 세포 별로 전사 네트워크에 대한 기초 정보를 제공할 것이며, 이는 전사 조절 실패에 기인한 질병 치료 및 세포 분화 기술 개발 등의 다양한 분야에 새로운 미래를 제시할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염색체에서 특정 DNA의 부분들이 갖는 공간적 거리가 염기서열 상 2차원 거리와 다를 수 있는 이유는 무엇인가?	진핵세포의 DNA는 핵 내에서 히스톤(histone)을 포함한 단백질과 결합하여 크로마틴(chromatin)의 형태로 존재한다. 핵은 3차원적 입체 공간이고 크로마틴은 유연성을 가지고 있음으로, 하나의 염색체에서 특정 DNA 부분들 사이의 공간적 거리는 염기서열 상의 2차원적 거리와 다를 수 있다. 즉 염기서열 상에서 수십 또는 수백 Kb 떨어져 있는 두 DNA 부분이 핵 내에서는 아주 가까운 위치에 놓일 수 있다는 것이다.
	진핵세포의 DNA는 핵 내에서 어떤 형태로 존재하는가?	진핵세포의 DNA는 핵 내에서 히스톤(histone)을 포함한 단백질과 결합하여 크로마틴(chromatin)의 형태로 존재한다. 핵은 3차원적 입체 공간이고 크로마틴은 유연성을 가지고 있음으로, 하나의 염색체에서 특정 DNA 부분들 사이의 공간적 거리는 염기서열 상의 2차원적 거리와 다를 수 있다.
	3C 기법은 어떻게 수행하는가?	3C는 진핵세포의 핵에서 크로마틴의 입체 구조/구성을 알아보는 연구 기법이다. 이 기법은 살아있는 세포를 포름알데히드로 처리하여 단백질들 사이의 결합 및 단백질과 DNA 사이의 결합을 고정시킨 후, 제한효소로 DNA를 절단하고, 그 절편들의 연결 빈도를 측정함으로써 DNA 절편 사이의 물리적 근접성을 보여준다. 이 기법을 이용하여 복합 유전자 좌위인 ${\beta}$-글로빈 좌위에서 locus control region이 전사가 활발한 유전자와 가까이 위치하고 있음이 밝혀졌으며, 이러한 결과는 크로마틴 입체 구조가 유전자 전사 조절에 관여함을 나타낸다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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