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문제 정의
- 본 연구는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)의 생식세포 및 pluteus 유생을 이용하여 중금속인 납(lead, Pb) 과 아연 (zinc, Zn)의 독성을 조사였다. H.
- 본 연구는 유용 수산생물로써 조간대 암반 지역에 서식하는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)의 수정률 및 정상 배아 발생률을 이용하여 납과 아연이 생태계에 위해성을 나타내는 농도의 평가 및 시험생물로서의 가치를 평가하고자 한다.
제안 방법
- pulcherrimus 배우자 및 배아에 미치는 Pb과 Zn의 독성은 각각 31, 63, 125, 250, 500 ppb 및 16, 31, 63, 125, 250 ppb의 농도에서 조사하였다. 0.5 M KCl 용액을 이용하여 방란 및 방정을 유도하였고, 수정률 및 정상 배아발생률의 조사는 수정 후 각각 10분 및 64시간째 관찰하여 시행하였다. Pb 노출 시 수정률은 대조군과 비교하여 유의적인 변화가 없었다.
- 5 M KCl 용액1 mL을 체강내로 주입시킨 후, 여과 및 멸균한 자연해수가 담긴 100 mL 용량의 비이커에 넣고 생식공이 충분히 잠기게 하였다. 30분 동안 방정, 방란을 유도시켜 얻은 배우자를 정자용액은 1회, 난자용액은 3회 세정하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)의 생식세포 및 pluteus 유생을 이용하여 중금속인 납(lead, Pb) 과 아연 (zinc, Zn)의 독성을 조사였다. H. pulcherrimus 배우자 및 배아에 미치는 Pb과 Zn의 독성은 각각 31, 63, 125, 250, 500 ppb 및 16, 31, 63, 125, 250 ppb의 농도에서 조사하였다. 0.
- H. pulcherrimus의 배 발생률에 Pb (0, 31, 63, 125, 250, 500 ppb)과 Zn (0, 16, 31, 63, 125, 250 ppb)이 미치는 영향을 살펴보았다. Pb을 처리하였을 경우 수정 후 64시간째인 pluteus 유생기의 정상 배아 발생률은 대조군이 93.
- 실험동물의 수정 및 배아 발생률에 미치는 Pb과 Zn의 영향을 살펴보기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 1 ppm 농도로 조성한 stock solution을 준비한 후, 희석하여 사용하였다. Pb 및 Zn 노출에 의한 H. pulcherrimus의 수정률 및 배아 발생률을 조사하기 위한 실험 농도는 각각 Pb (0, 31, 63, 125, 250, 500 ppb), Zn (0, 16, 31, 63, 125, 250ppb)로 설정하였다.
- 1). 발생률은 pluteus 유생기인 수정 후 64시간째 정상 및 비정상 발생으로 나누어 관찰하였다(Pagono et al. 1985a, b) (Fig. 1).
- 방정 유도를 통해서 얻은 정자는 각각의 Pb 및 Zn 실험 농도에 30분간 노출시킨 후, 방란 유도를 통해 얻은 정상 난자와 인공수정을 시켰다. 수정 10분 경과 후 수정막의 형성 유∙무로 수정률을 관찰하였다(Fig.
- 방정 유도를 통해서 얻은 정자는 각각의 Pb 및 Zn 실험 농도에 30분간 노출시킨 후, 방란 유도를 통해 얻은 정상 난자와 인공수정을 시켰다. 수정 10분 경과 후 수정막의 형성 유∙무로 수정률을 관찰하였다(Fig. 1). 발생률은 pluteus 유생기인 수정 후 64시간째 정상 및 비정상 발생으로 나누어 관찰하였다(Pagono et al.
- Louis, MO) 제품을 사용하였다. 실험동물의 수정 및 배아 발생률에 미치는 Pb과 Zn의 영향을 살펴보기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 1 ppm 농도로 조성한 stock solution을 준비한 후, 희석하여 사용하였다. Pb 및 Zn 노출에 의한 H.
- 실험은 농도별로 3회 반복 실시하였으며 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여 고정된 배아 수에 대한 정상적인 배아 수의 백분율을 산출하였다. 이들 결과를 이용하여 수정 및 배아 발생률에 대한 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50)와 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)를 probit 통계법을 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- H. pulcherrimus는 암, 수 각 6개체로, 크기는 직경 3.5 cm 이상을 사용하였으며, 표면의 원생동물 및 이물질을 제거하기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 표면을 세척한 후, 실험에 이용하였다. 배양액으로 사용된 해수는 membrane filter (pore size 0.
- 시험생물로서 성게는 세계 전역의 바다에 서식하며 산란기가 길고 생식세포인 정자, 난자를 쉽게 얻을 수 있으며 실험실에서 배아 발생을 관찰하기 용이한 장점으로 인해 생태독성학적 연구에도 활발하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서는 우리나라 조간대 암반지역에 서식하며 실험실에서 인공 배란, 방정 및 수정을 유도할 수 있으며 배아 배양에 용이한 H. pulcherrimus를 시험종으로 선정하였다.
- 본 연구는 2012년도 국립수산과학원 경상과제연구비 지원으로 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태위해 평가센터에서 수행하였다.
- 실험에 사용된 H. pulcherrimus는 2011년 3월에 전라북도 부안군 변산면 격포리 인근 해역의 조간대 암반지역에서 채집하여 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생물배양실에서 1~2주간 순치 후 실험에 이용하였다. 해양생물배양실의 수조환경은 자연채광 상태의 유수식으로 9±1°C의 수온을 유지하였다.
- 실험에 사용한 중금속 Pb (Lead Nitrate)과 Zn (Zinc Oxide)은 Sigma (St. Louis, MO) 제품을 사용하였다. 실험동물의 수정 및 배아 발생률에 미치는 Pb과 Zn의 영향을 살펴보기 위하여 멸균된 해수를 이용하여 1 ppm 농도로 조성한 stock solution을 준비한 후, 희석하여 사용하였다.
- 5°C를 유지하였다. 인공수정(artificial insemination)시 적정한 정자 접종을 위하여 정자는 2,000~2,500배 희석하였으며, 멸균 해수 배양액 1 mL에 수정란 1,500~2,000개를 준비해 Table 1의 조건으로 배양하였다.
데이터처리
- All the points showed a statistically significant difference from the control group according to Student’s t-test (*p<0.05, **p<0.01).
- Pb와 Zn이 H. pulcherrimus의 수정 및 배아 발생률에 미치는 영향에 대한 실험결과를 바탕으로, probit 통계법을 이용해 EC50과 EC50에 95% Cl를 산출하였고, Dunnett’s test를 이용하여 NOEC와 LOEC 값을 산출하였다.
- 대조군과 실험군과의 유의성 검정은 Student’s t-test로 비교하였으며, p가 0.05 이하인 것만 유의한 것으로 하였다.
- 또한, 무영향농도(No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소영향농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)는 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.
- 실험은 농도별로 3회 반복 실시하였으며 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여 고정된 배아 수에 대한 정상적인 배아 수의 백분율을 산출하였다. 이들 결과를 이용하여 수정 및 배아 발생률에 대한 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50)와 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)를 probit 통계법을 이용하여 분석하였다. 또한, 무영향농도(No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소영향농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)는 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- H. pulcherrimus 정자를 중금속인 Pb (0, 31, 63, 125, 250, 500 ppb)과 Zn (0, 16, 31, 63, 125, 250 ppb)에 30분간 노출 및 정상 난자와 10분간 수정시킨 후 수정률을 관찰한 결과 Pb 처리 시 수정률은 처리 농도에 유의적인 영향을 받지 않았다(Fig. 2). 그러나 Zn을 처리했을 경우 대조군이 97.
- Zn을 노출시켰을 경우 수정률과 정상 배아발생률은 농도가 높을수록 농도의존적인 유의적 감소를 나타냈다. H. pulcherrimus의 정상 배아 발생에 대한 독성치는 각각 Pb (반수 영향농도(EC50) 45.13 ppb, 95% Cl 40.12~50.05 ppb), Zn (반수영향농도(EC50) 19.82 ppb, 95% Cl 18.26~21.31 ppb) 로 나타났다. 또한 Pb과 Zn의 무영향농도(NOEC)는 각각 <31.
- pulcherrimus의 배 발생률에 Pb (0, 31, 63, 125, 250, 500 ppb)과 Zn (0, 16, 31, 63, 125, 250 ppb)이 미치는 영향을 살펴보았다. Pb을 처리하였을 경우 수정 후 64시간째인 pluteus 유생기의 정상 배아 발생률은 대조군이 93.67%를 보였으며, 처리 농도 31, 63, 125, 250, 500 ppb 처리군에서의 정상 배아 발생률은 각각 58.53%, 34.33%, 17.62%, 3.04% 및 0.00%를 나타내었다. Pluteus 유생기의 정상 배아 발생률은 Pb 처리농도가 증가할수록 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타내었으며 500 ppb에서는 모두 치사하였다(Fig.
- 00%를 나타내었다. Pluteus 유생기의 정상 배아 발생률은 Pb 처리농도가 증가할수록 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타내었으며 500 ppb에서는 모두 치사하였다(Fig. 3). Zn을 처리했을 경우 pluteus 유 생기의 정상 배아 발생률은 대조군이 90.
- 00%를 나타내었다. Zn 농도가 증가할수록 정상 pluteus 유생은 유의적으로 급격히 감소하는 경향을 나타내었으며 Zn 농도 125 및 250 ppb 농도에서는 정상 pluteus 유생을 관찰할 수 없었다(Fig. 3).
- 2). 그러나 Zn을 처리했을 경우 대조군이 97.84%를 보였으며, Zn 농도 16, 31, 63, 125, 250 ppb 처리군에서의 수정률은 각각 85.77%, 88.22%, 84.24%, 80.97%, 51.05%를 나타내어 농도 증가에 따라 농도 의존적으로 수정률이 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 2).
- 2). 그러나 정상적인 배아 발생률은 Pb 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타내었다(Fig. 3). Zn (0, 16, 31, 63, 125, 250 ppb)을 처리한 경우 수정률은 대조군 97.
- pulcherrimus의 초기 배아발생 과정은 Pb과 Zn 등의 중금속에 높은 민감성을 보인다. 따라서 H. pulcherrimus는 해양생태계 위해 평가를 위한 시험생물로서 사용이 가능하다고 사료된다.
- 또한 Zn의 영향을 독성치로 나타낼 때 EC50는 19.82 ppb를 나타냈고, EC50에 대한 95% Cl은 18.26~21.31 ppb를 나타냈으며, NOEC는 <15.63 ppb로 나타났고, LOEC는 15.63 ppb로 나타났다.
- 따라서 이들 유해물질의 위해 정도를 파악하는 연구는 이화학적인 분석 방법과 더불어 생물 노출 실험에 따라 나타나는 여러 가지 현상을 분석하는 연구가 필수적이라 생각된다. 또한 이들 유해물질은 육상 생태계 생물보다 해양을 포함한 수생태계 생물에 직접적으로 영향을 미치는 경우가 많으므로 이러한 연구의 시험 생물종은 수생태계 생물이 적합하다.
- 배아 발생률은 Pb와 Zn 농도가 증가할수록 감소하는 농도의존성을 보였으며, 농도반응 관계식은 표준독성반응으로 잘 알려진 Sigmoid 형태를 나타냈다(Fig. 4). H.
- 본 연구 결과 Pb (31, 63, 125, 250, 500 ppb)을 노출시킨 5개 실험구 정자와 Pb을 노출시키지 않은 난자와의 인공수정 시 수정률은 대조구에서 98.26%로 나타났으며 실험구 고농도인 500 ppb에서는 95.00%로 나타나 수정률에 유의적인 영향을 미치지 않았다(Fig. 2). 그러나 정상적인 배아 발생률은 Pb 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 유의적인 감소를 나타내었다(Fig.
- 63 ppb로 나타났다. 본 연구 결과, H. pulcherrimus의 초기 배아발생 과정은 Pb과 Zn 등의 중금속에 높은 민감성을 보인다. 따라서 H.
- 따라서 환경오염에 의한 문제는 단순히 연안 생태계의 문제일 뿐만 아니라 먹이연쇄의 상위단계인 인간에게는 섭식에 따른 위험한 경우가 생길 수 있다. 본 연구결과 Pb 및 Zn이 연안 해역에 유입되어 31.25 및 15.63 ppb를 초과할 경우 연안 생태계 내에 서식하는 생물의 재생산에 유해한 영향을 미칠 것으로 판단된다. 또한 해양생태계 위해성을 평가하고자 할 때 동, 식물 플랑크톤 중심의 연구에서 유용 수산생물자원으로의 연구가 유도되는 상황에서 H.
- Kobayashi (1995)는 중금속이 성게의 초기 배아 발생에 미치는 영향에 관한 연구보고에서 중금속 중 Hg가 가장 큰 독성을 보였으며, Cu>Zn>Ni>Cd의 순으로 독성치를 보고하였다. 이들 결과를 종합해보면 Zn과 Pb은 Cu보다는 독성이 약하나 Co (II)나 Cd보다 독성이 큰 것으로 생각된다.
- 따라서 중금속의 위해성은 중금속의 종류 뿐만 아니라 노출되는 시간도 중요한 요인으로 작용한다고 사료된다. 이들 연구 결과로부터 Pb 및 Zn 등의 중금속은 종류에 따라 정도의 차이는 있지만 H. pulcherrimus 초기 배아 발생에 있어서 유해한 작용을 한다는 것을 알 수 있으며, H. pulcherrimus 를 이용한 생태독성 시험법은 연안해역에 대한 생물영향을 평가하기 위하여 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- (2010)이 유럽 산 조개류 일종인 Ruditapes decussatus을 이용한 연구결과에 따르면 중금속인 구리(Cu), 수은(Hg), Zn을 정자에 30분간 노출시킨 후 인공수정 시켰을 때 Cu는 수정률에 영향을 미치지 않았으나 Hg 및 Zn은 각각 256 및 512 ppt 에서 수정율이 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과들로 보아 중금속은 종류에 따라 남성생식 세포인 정자의 활성에 영향을 미쳐 수정률의 감소를 유발시키는 것으로 사료된다. 따라서 수정률을 이용한 위해성 평가는 중금속의 종류에 따라 적용하는 것이 필요하다고 생각된다.
- 3). 이상의 결과로 보아 Pb과 Zn은 민감하게 성게 배아의 정상적인 발생과정을 저해시키는 것을 알 수 있다. Pb 및 Zn 처리 농도가 증가할수록 배아 발생률이 농도 의존적 감소하는 연구 결과는 Hydroides elegans를 이용한 연구 결과와 유사하게 나타났다(Gopalakrishnan et al.
- 이상의 결과를 바탕으로 H. pulcherrimus를 시험종으로 배아 발생률에 의한 중금속의 독성평가에서 EC50을 비교 평가 시 독성 영향은 Cu>Zn>Ni>Pb>Co(II)>Cd 순으로 나타났다.
- 2008, 2011). 이와 같은 결과를 증명하는 연구 결과로서 R. decussatus의 경우 정자에 Cu, Zn 및 Hg 을 노출하는 시간이 길어질수록 수정률이 유의적으로 감소하였으며 Zn의 경우 30분 노출 시 512 ppb에서 수정률이 유의적으로 감소하다 1시간 노출하면 보다 낮은 농도인 64 ppb부터 수정률이 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다(Fathallah et al. 2010). 따라서 중금속의 위해성은 중금속의 종류 뿐만 아니라 노출되는 시간도 중요한 요인으로 작용한다고 사료된다.
후속연구
- 63 ppb를 초과할 경우 연안 생태계 내에 서식하는 생물의 재생산에 유해한 영향을 미칠 것으로 판단된다. 또한 해양생태계 위해성을 평가하고자 할 때 동, 식물 플랑크톤 중심의 연구에서 유용 수산생물자원으로의 연구가 유도되는 상황에서 H. pulcherrimus는 발생학적인 장점과 함께 오염물질에 대한 반응이 민감한 시험 생물로 유용하게 이용될 것으로 판단된다.
- 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 시험방법의 표준화 및 유용 시험생물 종을 선정하는 연구는 매우 중요하다. 시험생물로서 성게는 세계 전역의 바다에 서식하며 산란기가 길고 생식세포인 정자, 난자를 쉽게 얻을 수 있으며 실험실에서 배아 발생을 관찰하기 용이한 장점으로 인해 생태독성학적 연구에도 활발하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서는 우리나라 조간대 암반지역에 서식하며 실험실에서 인공 배란, 방정 및 수정을 유도할 수 있으며 배아 배양에 용이한 H.
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