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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 양마에서 분리한 flavonoid계의 일종인 kaempferol과 그 배당체인 α-rhamnoisorobin, afzelin, kaempferitrin의 parameter를 중심으로 항주름 및 항균 연구를 수행함으로써 kaempferol과 그들의 rhamnoside 구조에 따른 생리활성의 상관관계 분석을 통해 기능성 식품, 의약품, 화장품 소재로의 응용가능성을 연구하였다.
- 본 시험을 통해 시험물질이 섬유아세포 내 콜라게나제 생성 억제 정도를 공시료액과 비교하고자 하였다. HDF-N cell을 24 well plate에 1 × 104 cells/well 농도로 분주한 다음 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다.
- 본 연구에서는 양마로부터 분리한 플라보노이드 종류인 시료 4종 (kaempferol, α-rhamnoisorobin, afzelin, kaempferitrin)을 대상으로 항염증 효능을 평가함으로서 kaempferol과 그들의 rhamnoside의 구조적 활성 상관관계를 조사하였다.
- 자연노화 및 광노화로 인하여 주름이 생성되는 여러 기전 중에 본 시험은 콜라겐 분해효소인 MMP-1 (Matrix metalloproteinases)의 활성 정도를 immuno ELISA assay를 이용하여 측정함으로서 시료의 주름개선효능을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- HDF-N cell을 24 well plate에 1 × 104 cells/well 농도로 분주한 다음 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 이후 배지를 버리고 DPBS로 세척한 다음, DPBS 200 ㎕를 첨가하여 UV-A 5 J/㎠를 조사하였다. 시료를 적당한 농도로 배지에 희석한 후 세포에 처리하여 세포 배양 조건에서 48시간 배양하였다.
- 시료의 procollagen 합성능을 알아보기 위해 앞서 진행한 세포독성시험을 통해 독성을 보이지 않는 농도를 설정하여 평가하였다. Procollagen 양은 총 단백질 양으로 보정하여 계산하였다.
- 1에서 보는 바와 같다. 각 시료는 DMSO에 용해시켰으며 실험 시 농도는 WST-1 assay를 통하여 예비실험을 진행한 후 세포독성을 나타내지 않는 농도를 선택하였다. 실험 물질은 시험 항목에 맞는 세포주에 따라 세포 배양 배지에 희석하여 사용하였으며, 예비시험 후, 효력을 나타내는 농도를 찾아 3개를 선정 항염증 효능을 확인하였다.
- 실험 물질은 시험 항목에 맞는 세포주에 따라 세포 배양 배지에 희석하여 사용하였으며, 예비시험 후, 효력을 나타내는 농도를 찾아 3개를 선정 항염증 효능을 확인하였다. 각 실험의 양성대조군 역시 세포주에 따른 세포 배양 배지로 희석하여 처리하였다.
- 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후, 1N NaOH로 lysis 시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 procollagen 합성 양을 구하였다. 각각의 Procollagen양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다.
- 검액의 독성을 확인하기 위해, HaCaT cell과 HDF-N cell 에서의 세포독성을 측정하였다. HaCaT cell은 96 well plate에 well 당 5 × 104 cell의 농도로, HDF-N cell은 96 well plate에 well 당 6 × 103 cell의 농도로 분주한 다음 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다.
- 검액의 세포 증식능을 확인하기 위해, HaCaT cell과 HDFN cell에서의 세포증식능을 측정하였다.
- 4 × 104 cells/well로 분주하고 세포배양 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 24시간 세포의 기아상태를 유지하며 이 후 시험 물질을 세포 배양 배지인 FBM (media supplement 제외)에 희석하여 농도별로 세포에 처리한 후 24시간 배양하였다. 양성대조군은 TGF-β를 사용하였으며, 농도는 10 ng/㎖로 처리하였다 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen typeI c-peptide (PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen양을 측정하였다.
- 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 12시간의 기아상태를 유지시킨 후 검액 및 새로운 배지 (media supplement 제외)를 넣고, 48시간동안 배양하였다. 또 검액 및 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 1 ㎎/㎖의 MTT용액을 각 well 당 50 ㎕씩 처리하여 2시간동안 반응 시킨 후, DMSO로 용해시켜서 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 12시간의 기아상태를 유지시킨 후 검액 및 새로운 배지(media supplement 제외)를 넣고, 24시간 배양하였다. 또 검액 및 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 supplement가 제외된 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 well당 100 ㎕씩 처리하여 1시간 반응시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 미생물 균주의 성장을 억제하는 항생물질의 최소억제농도를 측정하기 위해, 멸균된 배지에 배양된 균주를 세균은 1 × 106 cfu/㎖, 진균은 1 × 105 cfu/㎖이 되도록 각각을 접종하여 세균의 경우 35℃에서 2일간 배양하고, 진균류의 경우 25℃에서 5일간 배양하여 이를 대조군으로 하여 관찰하였다.
- 배양액을 취하여 Human total MMP-1 ELISAkit (R&D system, DY901, USA)을 사용하여 콜라게나제 양을 측정하였다.
- 배양이 끝난 대조군과 실험군의 배지 용액에 대해서 각 균주의 증식 유무를 확인하기 위하여 무균공간에서 시료를 약 300 ㎕씩 취하여 멸균된 96 well microplate에 분주하고 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 650 ㎚에서 흡광도를 측정하여 미생물의 증식을 확인하였고 대조군과 비교하여 각각의 균주에 대하여 낮은 증식도를 보인 최소 농도를 측정하여 이를 최소저해농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)로 하였다.
- 배양한 각각의 균주를 응고된 평판 배지 위에 약 100 ㎕를 가하여 평판배지에 분주하고 스프레더 (spreader)를 이용하여 균일하게 도말 하였다. 측정하고자 하는 각 추출물을 지름이 10 ㎜인 페이퍼디스크 (paper disc)에 약 60 ㎕를 흡수시킨 후 용매를 건조시키고 균주가 도말된 배지 표면상에 밀착시켜 25 ~ 35℃조건의 배양기에서 48시간 이상 배양 후 페이퍼디스크 주변에 형성된 투명환 (clear zone)의 크기를 측정하여 항균효과를 확인하였다.
- 본 실험에서 항균활성을 측정하기 위해 시료의 최종 농도는 0.01%가 되게 하여 실험을 수행하였다. 시험 방법으로 원형여과지법 (paper disc method)을 이용하였으며, 사용한 균주로는 그람양성균으로 포도상구균 (Staphylococcusaureus, ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli, ATCC 8739), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans, ATCC 10231), 사상균으로 흑국균 (Aspergillus niger, ATCC22343)을 사용하였다.
- 상기 추출물들의 항균 효과를 측정하기 위하여 최소 저해농도 (Minimum Inhibition Concentration, MIC)를 측정하여 항균활성을 조사하였다. 항균 효과를 측정하기 위하여 사용한 균주로는 그람양성균으로 포도상구균 (Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli ATCC 8739), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans ATCC 10231), 사상균으로 흑국균 (Aspergillus niger ATCC22343)을 한국생명공학연구원 생물자원센타 (KCTC, Korea)로부터 분양받아 사용하였다.
- 이후 용매 분획을 통해 비극성 성분을 제거하고 재결정법을 이용하여 고순도의 kaempferitrin (kaempferol-3,7-O-α-dirhamnoside)을 분리하였으며, 이 후 효소 또는 미생물을 이용한 가수분해를 통한 선택적인 분리 공정을 거쳐 지표수준의 고순도 α-rhamnoisorobin (kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside), afzelin (kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside) 및 kaempferol (4', 5, 7-trihydroxyflavonol)을 분리하였다. 상기의 방법으로 분리된 kaempferitrin은 HPLC, ESI-MS, FT-IR, 1H-NMR,13C-NMR 등의 기기분석을 통한 정성분석으로 화학적 구조를 밝혔다. 이후 가수분해를 통해 얻어진 3가지 화합물은 HPLC를 통해 표준물질과 비교하여 정성분석하였다.
- 시료 4종의 세포증식능을 알아보기 위해 앞서 진행한 세포독성시험을 통해 독성을 보이지 않는 농도를 설정하여 HaCaT cell과 HDF-N cell에서의 증식능을 평가하였다. 세포증식능 평가는 MTT 시약 1 ㎎/㎖을 처리한 후 DMSO에 용해시켜 570 ㎚에서 측정하였다.
- 시료 4종에 대한 in vitro 세포독성은 HaCaT cell과 HDF-N cell에서 수행하였으며, 세포의 미토콘드리아 활성에 의존하여, 세포의 생존을 결정할 수 있는 WST-1 반응액에 의해 측정되었다. 세포 생존율은 시료를 제외한 배양배지만 처리한 값 (control)에 대한 백분율로 나타내었다.
- 시료 4종의 세포증식능을 알아보기 위해 앞서 진행한 세포독성시험을 통해 독성을 보이지 않는 농도를 설정하여 HaCaT cell과 HDF-N cell에서의 증식능을 평가하였다. 세포증식능 평가는 MTT 시약 1 ㎎/㎖을 처리한 후 DMSO에 용해시켜 570 ㎚에서 측정하였다.
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3. Procollagen 합성능 시험
시료의 procollagen 합성능을 알아보기 위해 앞서 진행한 세포독성시험을 통해 독성을 보이지 않는 농도를 설정하여 평가하였다. Procollagen 양은 총 단백질 양으로 보정하여 계산하였다.
- 각 시료는 DMSO에 용해시켰으며 실험 시 농도는 WST-1 assay를 통하여 예비실험을 진행한 후 세포독성을 나타내지 않는 농도를 선택하였다. 실험 물질은 시험 항목에 맞는 세포주에 따라 세포 배양 배지에 희석하여 사용하였으며, 예비시험 후, 효력을 나타내는 농도를 찾아 3개를 선정 항염증 효능을 확인하였다. 각 실험의 양성대조군 역시 세포주에 따른 세포 배양 배지로 희석하여 처리하였다.
- 양성대조군은 TGF-β를 사용하였으며, 농도는 10 ng/㎖로 처리하였다 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen typeI c-peptide (PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen양을 측정하였다.
- 양성대조군은 retinoic acid를 사용하였으며, 농도는 10 µM로 처리하였다.
- 상기의 방법으로 분리된 kaempferitrin은 HPLC, ESI-MS, FT-IR, 1H-NMR,13C-NMR 등의 기기분석을 통한 정성분석으로 화학적 구조를 밝혔다. 이후 가수분해를 통해 얻어진 3가지 화합물은 HPLC를 통해 표준물질과 비교하여 정성분석하였다. (Lee et al.
- 이후 용매 분획을 통해 비극성 성분을 제거하고 재결정법을 이용하여 고순도의 kaempferitrin (kaempferol-3,7-O-α-dirhamnoside)을 분리하였으며, 이 후 효소 또는 미생물을 이용한 가수분해를 통한 선택적인 분리 공정을 거쳐 지표수준의 고순도 α-rhamnoisorobin (kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside), afzelin (kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside) 및 kaempferol (4', 5, 7-trihydroxyflavonol)을 분리하였다.
- 배양한 각각의 균주를 응고된 평판 배지 위에 약 100 ㎕를 가하여 평판배지에 분주하고 스프레더 (spreader)를 이용하여 균일하게 도말 하였다. 측정하고자 하는 각 추출물을 지름이 10 ㎜인 페이퍼디스크 (paper disc)에 약 60 ㎕를 흡수시킨 후 용매를 건조시키고 균주가 도말된 배지 표면상에 밀착시켜 25 ~ 35℃조건의 배양기에서 48시간 이상 배양 후 페이퍼디스크 주변에 형성된 투명환 (clear zone)의 크기를 측정하여 항균효과를 확인하였다.
- 한편, 각각의 시료는 0.01 내지 1 중량%가 되도록 배지에 첨가하여 제조한 후 제균하여 대조군과 마찬가지로 세균은 1 × 106 cfu/㎖, 진균은 1 × 105 cfu/㎖이 되게 각각 접종하여 세균의 경우 35℃에서 2일간 배양하고, 진균류의 경우 25℃에서 5일간 배양하여 이를 실험군으로 하여 관찰하였다.
- 양성대조군은 TGF-β를 사용하였으며, 농도는 10 ng/㎖로 처리하였다 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen typeI c-peptide (PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후, 1N NaOH로 lysis 시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 procollagen 합성 양을 구하였다. 각각의 Procollagen양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용되는 검액은 kaempferol (1), α-rhamnoisorobin (2), afzelin (3), kaempferitrin (4)이며 이들의 구조식 및 분자량은 Fig. 1에서 보는 바와 같다.
- 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Welgene (Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 분석을 위해 사용된 FT-IR은 Bio-Rad (FTS, USA)사의 제품을 NMR은 Varian (Mercury 400 MHz, CP-MAS, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 세포주인 HaCaT cell (Human Keratinocyte, HaCaT)과 HDF-N cell은 ATCC (USA)에서 구입하였으며, 흡광도 측정은 TECAN (Infinite M200, Switzerland)사의 제품을 사용하였으며 TARC 양을 측정하기 위해 Human TARC Immunoassay kit (R&D System, DDN00, USA)를 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Welgene (Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 분석을 위해 사용된 FT-IR은 Bio-Rad (FTS, USA)사의 제품을 NMR은 Varian (Mercury 400 MHz, CP-MAS, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 01%가 되게 하여 실험을 수행하였다. 시험 방법으로 원형여과지법 (paper disc method)을 이용하였으며, 사용한 균주로는 그람양성균으로 포도상구균 (Staphylococcusaureus, ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli, ATCC 8739), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans, ATCC 10231), 사상균으로 흑국균 (Aspergillus niger, ATCC22343)을 사용하였다.
- 실험에 사용된 양마 (Hibiscus cannabinus L.)는 전라북도 부안군에서 2010년 4월에 파종하여 2010년 7월에 (120일) 수확하였으며, 실온에서 2주간 음건하고 세절하여 실험재료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 세포주인 HaCaT cell (Human Keratinocyte, HaCaT)과 HDF-N cell은 ATCC (USA)에서 구입하였으며, 흡광도 측정은 TECAN (Infinite M200, Switzerland)사의 제품을 사용하였으며 TARC 양을 측정하기 위해 Human TARC Immunoassay kit (R&D System, DDN00, USA)를 사용하였다.
- 상기 추출물들의 항균 효과를 측정하기 위하여 최소 저해농도 (Minimum Inhibition Concentration, MIC)를 측정하여 항균활성을 조사하였다. 항균 효과를 측정하기 위하여 사용한 균주로는 그람양성균으로 포도상구균 (Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli ATCC 8739), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans ATCC 10231), 사상균으로 흑국균 (Aspergillus niger ATCC22343)을 한국생명공학연구원 생물자원센타 (KCTC, Korea)로부터 분양받아 사용하였다.
- 항염증 실험에서 사용한 세포주는 human 각질세포인 HaCaT cell (Human Keratinocyte, HaCaT)이며, 배양접시 바닥에 접종한 후 페니실린 (100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖), 10% FBS를 함유하는 Dulbecco’s Modified Eagle's Medium (DMEM)를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 mean ± SD로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test를 사용하였으며 P < 0.005의 유의확률과 양측검정을 사용하였다.
성능/효과
- α-rhamnoisorobin (2)는 kaempferol (1)과 같은 양상의 항균 효과를 보였으나 약 50% 높은 농도에서 항균효과를 나타내 kaempferol (1)에 비하여 효과가 50% 반감하는 것으로 나타났다.
- HDF-N cell에 4종의 시료를 10, 50, 100 µM 농도로 처리한 후 Human total MMP-1 ELISA kit (R&D system, DY901)로 측정한 결과 Fig. 5와 같이 1번 시료의 경우 대조 군과 대비하여 각각 81.6%, 73.1%, 59.4%로 감소하였으며, 2번 시료의 경우 역시 대조군과 대비하여 각각 70.4%, 53.5%, 41.9%로 감소하였다.
- Kaempferol과 그 배당체의 사용균주에 따른 항균활성 결과는 Table 2와 같다. Kaempferol의 경우 그람 양성균인 S. aureus과 그람 음성균인 E. coli에 대하여 5 ㎎/㎖의 농도에서 우수한 항균활성을 나타내었으나 그람 양성균인 P. aeruginosa에 대해서는 상대적으로 약한 항균활성을 나타냈으며, 효모인 C. albicans와 fungi류인 A. niger에 대해서는 상대적으로 약한 농도인 15 ㎎/㎖에서 항균활성을 나타내었다. α-rhamnoisorobin (2)는 kaempferol (1)과 같은 양상의 항균 효과를 보였으나 약 50% 높은 농도에서 항균효과를 나타내 kaempferol (1)에 비하여 효과가 50% 반감하는 것으로 나타났다.
- 그 결과 4종의 시료는 최고 농도 100 µM까지 HaCaT cell과 HDF-N cell에서 80% 이상의 세포 생존률을 보여 세포 독성은 없는 것으로 판단되었다.
- 그 결과, HaCaT cell에 대한 시료 독성은 4종 시료 모두 100 µM 농도까지 90.0% 이상의 생존율을 보였다.
- 그 결과, 대조군과 대비하여 4종의 시료는 Fig. 2와 같이 HDF-N cell의 증식을 촉진시키지 않은 것으로 보였다. 그러나 HaCaT cell에서 4종의 시료를 처리한 후 MTT로 세포증식능을 측정한 결과 Fig.
- 그 결과, 양성대조군으로 사용한 TGF-β는 10 ng/㎖을 처리하였을 경우 대조군에 비해 procollagen 합성이 189.5% 증가함을 통해 HDF-N 세포는 TGF-β에 의해서 procollagen 생합성이 촉진됨을 알 수 있었다.
- niger 순이었다. 그 다음으로 a-rhamnoisorobin (2)에서 kaempferol (1)과 같은 균종 순으로 항균력을 나타내었으며, afzelin (3)은 yeast와 fungi 종류인 C. albicans, A. niger에서는 항균력을 나타내지 않았고, Kaempferitin (4)는 모든 균종에서 항균활성을 나타내지 않았다.
- 5%로 통계 적인 유의차를 보였다. 따라서 시료 1번과 2번에서 농도 의존적으로 UV-A에 의해 유도되어지는 MMP-1이 감소하는 경향을 확인하였다. 또한, 본 시험에서 사용된 양성 대조군인 retinoic acid는 대조군과 대비하여 81.
- 또한 3번 시료를 1, 10, 100 µM 처리한 결과 procollagen 합성능이 대조군에 비하여 각각 151.1%, 163.7%, 188.5% 증가하여 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다.
- 또한 주름개선 효능 실험으로는 procollagen 생합성 실험과 MMP-1 억제실험을 진행한 결과 procollagen 생합성 실험에서는 시료 4종 모두 유의적으로 생합성을 촉진시킴으로써 주름개선에 효능을 보였으며 MMP-1 억제 실험에서는 kaempferol (1)과 α-rhamnoisorobin (2)가 농도 의존적으로 MMP-1 활성을 억제시킴으로써 주름 개선이 효능이 있는 것으로 판단되었다.
- 또한, HDF-N cell에 대한 세포독성은 4종 시료 모두 100 µM 농도까지 80.0% 이상의 생존율을 보여 세포독성을 나타내지 않았다.
- 따라서 시료 1번과 2번에서 농도 의존적으로 UV-A에 의해 유도되어지는 MMP-1이 감소하는 경향을 확인하였다. 또한, 본 시험에서 사용된 양성 대조군인 retinoic acid는 대조군과 대비하여 81.6%로 감소하였다.
- 이상의 결과를 종합해 볼때 시료 4종 중 kaempferol (1)과α-rhamnoisorobin (2)은 주름개선 및 항균에 우수한 것으로 사료되며 이는 4개 물질의 구조식과 대비하여 비교해 볼 때본 연구에서 효능을 나타내었던 kaempferol (1)과 αrhamnoisorobin (2)의 구조식에서 3번 위치에서 hydroxyl 작용기를 갖고 있었으나, 비교적 우수한 효능을 보이지 않았던 afzelin (3)과 kaempferitrin (4)은 3번 위치에서 hydroxyl 작용기를 가지고 있지 않음을 통해 3'-hydroxyl기는 주름개선 및 항균과 관련된 활성을 나타내는데 중요한 작용을 하는 것으로 사료된다 (Zuo et al., 2006).
- 즉, 1번 시료를 10, 50, 100 µM 처리하였더니 각각 93.4%, 95.7%, 128.6%로 증가하였으며, 2번 시료를 10, 50, 100 µM 처리한 결과 각각 85.4%, 118.3%, 146.6%로 증가함을 확인하였다.
- 한편, 시료를 0.1, 1, 10 µM 처리한 후 procollagen 합성능을 평가한 결과 1번 시료는 Fig. 4와 같이 대조군에 비하여 각각 150.8%, 131.0%, 124.8% 증가하였다.
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