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문제 정의
- 본 시험은 기생진균 Paraconiothyrium minitans S134와 P. minitans CM2 균주를 마늘 흑색썩음균핵병의 생물적 방제에 활용하기 위하여 태안의 마늘재배포장에서 흑색썩음균핵병에 대한 발생 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
- 2012년에 6월 5일에 마늘 흑색썩음균핵병 발생조사는 마늘을 캐어내어 병 발생을 조사하였으며, 상품성이 없는 병든 마늘을 제외하고 전처리구의 수량을 조사하였다.
- Glutamine synthetase(GS) 유전자의 intron 2 염기서열을 분석하기 위해 GSF1(5'-ATGGCCGAGTACATCTGG-3')과 GSR1 (5'-GAACCGTCGAAGTTCCAC-3') 프라이머(Guerber et al., 2009)가 사용되었고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 predenaturation, 94℃에서 50초 denaturation, 52℃에서 90초 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 post extension하였다.
- ITS 부위의 증폭을 위해 ITS1(5'TCC GTA GGT GAA CCT. TGC GG 3')과 ITS4(5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3') 프라이머가 사용되었고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 predenaturation, 94℃에서 50초 denaturation, 52℃에서 90초 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 post extension하였다.
- P. minitans S134 균주의 포자현탁액(5 × 106ml)을 마늘 종구를 파종직후와 다음해 2월 하순에 주당 100 ml씩 각각 관주처리하여 6월 5일에 흑색썩음균핵병 발생 억제효과를 조사하였다.
- 공시균주의 ribosomal DNA-internal transcribed spacer(ITS) 부위의 염기서열 분석을 실시하였다. P. minitans S134를 potato dextrose broth에 7일간 배양하여 동결건조하고 마쇄한 후, DNeasy kit(QIAGEN, Germany)를 사용하여 Genomic DNA를 추출하였다. ITS 부위의 증폭을 위해 ITS1(5'TCC GTA GGT GAA CCT.
- P. minitans S134와 CM2 균주를 감자포도당한천배지(PDA)에 이식 후 22℃의 항온기에서 10일간 배양한 다음, 형성된 균총을 떼어 내어서 oat meal agar(Difco) 배지를 분주하여 사각플레이트(24*24 cm)에 이식한 다음 22℃의 항온기에서 20일간 배양하여 포자현탁액을 제조하여 사용하였다.
- 공시균주의 ribosomal DNA-internal transcribed spacer(ITS) 부위의 염기서열 분석을 실시하였다. P.
- 71)와 KACC 46877(IMI134523)과의 동일균주가 아님을 증명하기 위하여 genomic DNA를 추출하기 위해 potato dextrose broth(PDB)배지에 접종하고, 25℃에서 3일간 배양하였다. 균사체는 miracloth로 수거하고 동결건조하여 마쇄한 후 DNeasy kit(QIAGEN, Germany)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. Glutamine synthetase(GS) 유전자의 intron 2 염기서열을 분석하기 위해 GSF1(5'-ATGGCCGAGTACATCTGG-3')과 GSR1 (5'-GAACCGTCGAAGTTCCAC-3') 프라이머(Guerber et al.
- 대조구로 화학약제 플로퀀코나졸수화제를 2 g/kg(마늘종구)으로 분의처리하여 파종하였다. 그리고 P. minitans S134와 CM2 균주의 2차 처리는 2012년 2월 22일에 1차 처리와 동일하게 관주처리하였다.
- minitans S134와 CM2 균주의 포자현탁액을 5 × 106ml로 제조하여 주당 100 mL씩 관주처리하였다. 대조구로 화학약제 플로퀀코나졸수화제를 2 g/kg(마늘종구)으로 분의처리하여 파종하였다. 그리고 P.
- 와 Paraconiothyrium spp. 등 다른 종들의 ITS 염기서열을 사용하여 분석하였다. 염기서열은 DNASTAR 프로그램의 sequman을 사용하여 편집하고, CLUSTAL W 분석법(Thompson et al.
- 또한 외국균주 KACC46876(CBS641.80), KACC 41241(CBS859.71)와 KACC 46877(IMI134523)과의 동일균주가 아님을 증명하기 위하여 genomic DNA를 추출하기 위해 potato dextrose broth(PDB)배지에 접종하고, 25℃에서 3일간 배양하였다. 균사체는 miracloth로 수거하고 동결건조하여 마쇄한 후 DNeasy kit(QIAGEN, Germany)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
- 마늘을 파종한 직후에 P. minitans S134와 CM2 균주의 포자현탁액을 5 × 106ml로 제조하여 주당 100 mL씩 관주처리하였다.
- minor Jagger에 기생하는 토양분리 곰팡이 중에서 분리한균주(S134)에 대한 형태적 특성을 조사하기 위하여 분리균주를 오트밀배지(Oat meal agar)에 이식한 다음 22℃의 항온기에서 22일간 배양하였다. 배지에 형성된 균총을 관찰하고, 자실체를 분리하여 현미경으로 형태적 특성을 관찰하였다.
- 및 Paraconiothyrium spp.을 포함하여 13개의 ITS 염기서열을 비교, 분석하고, Neighbour-joining tree를 작성하였다(Fig. 2). S134 균주는 GenBank에 등록된 3개의균 기생성 C.
- TGC GG 3')과 ITS4(5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3') 프라이머가 사용되었고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 predenaturation, 94℃에서 50초 denaturation, 52℃에서 90초 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 post extension하였다. 증폭된 PCR 산물은 Gel extraction kit(Bioneer)를 사용하여 순화 후 염기서열을 분석하였다. 계통수를 작성하기 위해 P.
- 토양내의 균밀도 조사는 포장에 처리한 P. minitans S134와 CM2 균주의 포자현탁액(5 × 106ml)를 처리하고 마늘 재배기간중에 매월 1회씩 토양내에서 처리한 미생물의 변동을 알기 위하여 식물체 주변의 토양을 채취하여 토양 10 g과 0.01% agar를 90 mL 멸균수에 넣고 10분간 150 rpm으로 진탕한 다음 20분간 방치 후 상등액을 1 mL 분취하여 멸균수로 102~104 희석하여 Czapeck Dox agar(Difco.)배지에 Triton X-100 2 mL/L를 넣고 멸균하여 식힌 후 aureomycine(2 µg/mL)를 넣어 분주한 배지에 분취한 액을 페트리디쉬당 200 µg씩 3반복으로 도말한 다음 20℃에서 7~10일 배양다음에 균수를 조사하였다.
대상 데이터
- 국내에서 Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary와 S. minor Jagger에 기생하는 토양분리 곰팡이 중에서 분리한균주(S134)에 대한 형태적 특성을 조사하기 위하여 분리균주를 오트밀배지(Oat meal agar)에 이식한 다음 22℃의 항온기에서 22일간 배양하였다. 배지에 형성된 균총을 관찰하고, 자실체를 분리하여 현미경으로 형태적 특성을 관찰하였다.
- Sclerotium cepivrum은 마늘과 같은 파속작물에 발생하는 흑색썩음균핵병의 병원균이다. 기생진균 Paraconiothyrium minitans S134 균주는 마늘 흑색썩음균핵병의 생물적 방제를 위하여 선발되었다. 포장실험은 태안에서 2011년 10월부터 2012년 6월까지 실시하였다.
- 충남 태안군 태안군농업기술센터의 흑색썩음균핵병이 발생하였던 실증포장에서 마늘(품종 남도마늘)을 2011년 10월 4일에 관행방법에 따라서 처리구당 면적은 2.4 m2이며, 모든 처리는 3반복으로 파종하였다. 마늘을 파종한 직후에 P.
- 기생진균 Paraconiothyrium minitans S134 균주는 마늘 흑색썩음균핵병의 생물적 방제를 위하여 선발되었다. 포장실험은 태안에서 2011년 10월부터 2012년 6월까지 실시하였다. P.
이론/모형
- 등 다른 종들의 ITS 염기서열을 사용하여 분석하였다. 염기서열은 DNASTAR 프로그램의 sequman을 사용하여 편집하고, CLUSTAL W 분석법(Thompson et al., 1994)을 사용하여 정렬하였다. 정렬된 염기서열은 Mega 5.
- , 1994)을 사용하여 정렬하였다. 정렬된 염기서열은 Mega 5.0(Tamura et al., 2011) 프로그램을 사용하여 Neighbor-Joining(NJ)법으로 분석하였고, 분류군간 sequence distance는 Kimura2 parameter법으로 계산되었고, Bootstrap 분석이 수행되었다.
성능/효과
- 2). S134 균주는 GenBank에 등록된 3개의균 기생성 C. minitans 균주(KACC46876, KACC 41241와 KACC 46877들과 100%의 상동성을 나타냈으며, 계통수에서도 같은 Clade에 속하였고, 100%의 bootstrap값으로 지지되었다. 그러나 Verkley 등(2004)은 분자적 연구로균 기생성 C.
- 2). S134균주는 CM2균주와 2개의 염기가 달랐으나, GenBank에 등록된 C. minitans균주들과는 염기서열이 차이가 없어 GSF1과 GSR1 프라이머를 이용하여 분석한 결과, S134균주는 KACC46876(CBS641.80)및 KACC46877(IMI134523)와 분석된 염기서열의 크기가 536bp로 동일하였고, 99.8%의 상동성을 나타내었지만, 1개의 염기에서 차이를 나타냈다(Fig. 3). S134균주는 508번째 염기가 A였으나 KACC46876(CBS641.
- minitans(W. A. Campb.) Verkley의 이명이며, 저자들의 선발균주인 S134는 ITS 염기서열을 기초로 P. minitans로 동정되었다(Fig. 2).
- 경기도 양평에서 상추 시설재배단지에서 토양에서 분리한 진균 중에서 선발된 균주(S134)에 대한 형태적 특성을 조사한 결과, Coniothyrium minitans Campbell로 동정되었다(Table 1, Fig. 1). 본 연구에서 분리하여 동정한 C.
- 5%의 흑색썩음균핵병이 발생하였다. 그러므로 P. minitans S134균주는 마늘 흑색썩음균핵병에 대한 유망한 미생물농약으로서 가능성을 나타내었다.
- 8%의 낮은 상동성을 나타내었다. 그러므로 S134균주는 기존에 보고된 균주와 동일한 균주가 아니라 국내에서 분리된 새로운 계통의 균주라는 것이 확인되었다.
- 기생성진균을 처리한 구에서 흑색썩음균핵병은 P. minitans S134균주는 6.8%, CM2균주는 8.6% 발생하였으며, 무처리구는 19.5% 발생하였다(Table 2). 병든 마늘을 제외하고 상품성이 있는 마늘의 수량을 조사한 결과, 무처리에 비하여 P.
- 4C-D). 대조약제인 플로퀸코나졸수화제 분의처리구는 0.4% 흑색썩음균핵병이 발생하여 수량은 무처리에 비하여 147% 증수되었다.
- 80)과 KACC 46877(IMI134523)은 G로 나타났다. 또한, KACC41241(CBS859.71)의 염기서열 크기는 507 bp였고, 염기서열에서도 S134균주와 47.8%의 낮은 상동성을 나타내었다. 그러므로 S134균주는 기존에 보고된 균주와 동일한 균주가 아니라 국내에서 분리된 새로운 계통의 균주라는 것이 확인되었다.
- 5C). 마늘 수확시기인 6월 5일에 포장에서 흑색썩음 균핵병은 미생물처리구와 무처리구간의 뚜렷하지 않았지만(Fig. 4A-B), 마늘을 수확하면 병든 마늘에서는 구근 표피와 줄기에 흰색의 병원균 균사 또는 균핵이 형성되어 확실히 구별이 가능하였다.(Fig.
- 5% 발생하였다(Table 2). 병든 마늘을 제외하고 상품성이 있는 마늘의 수량을 조사한 결과, 무처리에 비하여 P. minitans S134균주는 127%, CM2균주는 125%수량이 증가되었다(Fig. 4C-D). 대조약제인 플로퀸코나졸수화제 분의처리구는 0.
- minitans S134와 CM2 균주를 마늘 파종한 직후와 2월 하순에 각각 포자현탁액을 5 × 106ml로 제조하여 주당 100 mL씩 관주처리하여 마늘 재배기간 동안에 토양내의 Paraconiothyrium spp.의 균밀도를 조사한 결과, S134균주가 CM2균주보다 균밀도가 높이 유지되는 경향을 나타내어서 S134균주가 CM2균주보다 마늘 흑색썩음균핵병에 방제효과가 높았다고 사료된다(Fig. 6).
후속연구
- minitans S134 균주를 처리하는 체계처리는 흑색썩음균핵병을 보다 효과적인 방제 방법이라고 생각된다. 그러므로 선발한 기생진균 P. minitans S134 균주는 마늘 흑색썩음균핵병에 대한 생물적방제 미생물로 환경친화적인 마늘 생산이 기대된다.
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