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문제 정의
- 이 이설과정에서 작업자들은 차단방역 절차(Cho와 Kim, 2012)를 준수하여 처리하고 있으며 FMDV에 대한 안전성 검사를 농림수산검역검사본부에 의뢰하여 확인하고 있다. 그러나 매몰지 토양 및 침출수 내 FMDV 부재 검사와 가축전염병예방법에서 규정한 3년간의 발굴 금지 규정 사이에서 매몰지 토양 내 FMDV의 안정성을 확인하고자 이번 연구를 수행하였다.
- 따라서 이 논문에서는 가축 매몰지 내에서의 구제역 바이러스의 생존력을 확인하기 위해 실험적인 간이 가축 매몰 장치를 제작하고 구제역 바이러스 백신(FMDV O1 Manisa strain)과 구제역 바이러스와 같은 형태적 특징을 갖는 Coxsakievirus B1 (CVB1) strain을 돼지에 접종한 후 안락사 및 매몰한 다음 매몰 토양과 침출수 내에서의 이들 바이러스의 검출 양상을 확인하여 가축 매몰지 내에서의 매몰 기간에 따른 구제역 바이러스에 안전성에 대해 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 2.5 μl의 바이러스 RNA를 12.5 μl의 2× RT-PCR buffer, 1 μl의 25× RT-PCR enzyme mix, 각각의 primer (0.5 μM)와 probe (0.3 μM)를 넣어 전체 25 μl가 되도록 하였다.
- 25 μl의 2× SYBRⓇ Green PCR Master Mix, 0.25 μl의 MultiScribeTM Reverse Transcriptase (50 U/ml), 1 μl의 RNase inhibitor (20 U/ml), 각각 2 μl의 primer_F와 primer R, 2 μl의 template 및 RNase free water를 섞어 총 50 μl로 반응을 진행하였다.
- 25 μl의 MultiScribeTM Reverse Transcriptase (50 U/ml), 1 μl의 RNase inhibitor (20 U/ml), 각각 2 μl의 primer_F와 primer R, 2 μl의 template 및 RNase free water를 섞어 총 50 μl로 반응을 진행하였다. Real-time RT-PCR 반응은 ABI 7500Ⓡ real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하였으며 반응 조건은 50℃에서 30분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1회로 하여 40 cycle을 반응시켰다. Ct value (threshold cycle)는 형광 커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 ABI 7500Ⓡ software (Applied Biosystems.
- Real-time RT-PCR 반응은 Guan 등(2010)의 방법을 변형하였고 Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems, USA)을 이용하였다. 토양 시료에서 회수한 검체는 TaqManⓇ One-Step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 반응물을 제조하였다.
- Real-time RT-PCR의 조건 확립을 위한 바이러스 RNA는 RNeasy MINI kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 제조사에서 추천한 방법대로 추출하였으며 실험이 사용되기 전까지 −70℃에 보관하였다.
- 각 실험 기간에 따라 매몰 장치를 해체하고 부패 정도를 확인한 후 생석회 층을 기준으로 한 내부와 외부에서 토양 1 kg을 채취하고 침출수는 회수된 양을 10배 phosphate buffered saline (PBS)에 혼합한 후 상층액을 회수하여 일차 필터링한 후 초원심분리를 통해 바이러스를 수집하였다. 수집된 바이러스는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사에서 추천한 방법대로 바이러스 RNA를 추출한 다음, 실험에 이용될 때까지 −70℃에서 보관하였다.
- Real-time RT-PCR의 조건 확립을 위한 바이러스 RNA는 RNeasy MINI kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 제조사에서 추천한 방법대로 추출하였으며 실험이 사용되기 전까지 −70℃에 보관하였다. 각각의 바이러스에 대한 정량은 바이러스 RNA를 10배 연속 희석하여 real-time RT-PCR을 시행하여 standard curve를 완성하였다(Fig. 1, 2).
- 검출 한계 측정을 위해 CVB1 (1×106/ml) 및 FMDV vaccine (6PD50)에서 각각 RNA를 추출하고 10배 계단 희석하여 real-time RT-PCR을 수행하였다.
- 3과 같은데 총 50 kg의 흙을 이용하여 매몰하였고 매몰장치 하부에 침출수가 배출될 수 있게 하였고 상부에는 가스가 배출되도록 설계하였다. 또한, 상층부 사체 상부와 하부에 1 cm 두께의 생석회를 도포한 그룹과 도포하지 않은 그룹으로 구분하여 실험하였다.
- 수집된 바이러스는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사에서 추천한 방법대로 바이러스 RNA를 추출한 다음, 실험에 이용될 때까지 −70℃에서 보관하였다.
- 실험군은 실험개시 1주, 2주, 3주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주까지 사체 부패정도와 바이러스 검출 양상을 확인하였다. 시험 매몰장치는 Fig. 3과 같은데 총 50 kg의 흙을 이용하여 매몰하였고 매몰장치 하부에 침출수가 배출될 수 있게 하였고 상부에는 가스가 배출되도록 설계하였다. 또한, 상층부 사체 상부와 하부에 1 cm 두께의 생석회를 도포한 그룹과 도포하지 않은 그룹으로 구분하여 실험하였다.
- )을 각각 10 ml씩 피하 접종하여 인공적인 수포 병변을 유발한 후 매몰하였다. 실험군은 실험개시 1주, 2주, 3주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주까지 사체 부패정도와 바이러스 검출 양상을 확인하였다. 시험 매몰장치는 Fig.
- 이번 연구에서는 가축 매몰지 내에서의 FMDV의 생존력을 확인하기 위해 간이 가축 매몰 장치를 제작하고 구제역 바이러스 백신(FMDV O1 Manisa strain)과 구제역 바이러스와 같은 형태적 특징을 갖는 CVB1을 접종한 돼지를 매몰한 후 토양과 침출수 내에서의 이들 바이러스의 검출 양상을 확인하였다. 토양에서의 CVB1와 FMDV는 각각 실험개시 12주와 16주까지 지속해서 검출되었고 침출수에서는 8주까지 검출되었다.
- Real-time RT-PCR 반응은 Guan 등(2010)의 방법을 변형하였고 Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems, USA)을 이용하였다. 토양 시료에서 회수한 검체는 TaqManⓇ One-Step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 반응물을 제조하였다. 2.
- 이번 연구에서는 가축 매몰지 내에서의 FMDV의 생존력을 확인하기 위해 간이 가축 매몰 장치를 제작하고 구제역 바이러스 백신(FMDV O1 Manisa strain)과 구제역 바이러스와 같은 형태적 특징을 갖는 CVB1을 접종한 돼지를 매몰한 후 토양과 침출수 내에서의 이들 바이러스의 검출 양상을 확인하였다. 토양에서의 CVB1와 FMDV는 각각 실험개시 12주와 16주까지 지속해서 검출되었고 침출수에서는 8주까지 검출되었다. 이 결과는 가축 매몰지내 FMDV가 질병의 전파 측면의 위험성과는 달리 비교적 조기에 불활성화 되는 것을 말해주며 방역적 측면에서의 매몰지 관리에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 한편 FMDV 검출을 위한 primer 및 probe는 유전자를 증폭할 primer와 probe는 Hindson 등(2008)의 3D region의 증폭 방법을 일부 변형하여 사용하였으며 염기서열은 Table 1과 같다.
대상 데이터
- M88483을 기준으로 Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 primer_F: 5'- AGTAACACACTCCGATCAACA-3' (115∼135) 및 primer_ R: 5'-GAGCAGTCTATTGATACTCAGTCC-3' (208-185) 를 설계한 후 합성(Bioneer, Korea)하여 실험에 이용하였다.
- 구제역 바이러스는 구제역 백신인 O1 Manisa(Merial, UK)를 사용하였으며 CVB1 strain은 가톨릭대학교 미생물학과에서 분양받아 실험에 사용하였다. Real-time RT-PCR의 조건 확립을 위한 바이러스 RNA는 RNeasy MINI kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 제조사에서 추천한 방법대로 추출하였으며 실험이 사용되기 전까지 −70℃에 보관하였다.
- 시험에 사용된 돼지는 체중 10 kg으로 안락사시킨 후 CVB1 (2×1010/ml) 및 FMDV vaccine (6PD50)을 각각 10 ml씩 피하 접종하여 인공적인 수포 병변을 유발한 후 매몰하였다.
데이터처리
- Real-time RT-PCR 증폭 온도 조건은 처음 45℃에서 15분간 reverse transcription를 수행하고 95℃ 15분 동안 반응시킨 뒤 95℃ 15초, 56℃ 1분으로 45 cycles를 반복하였다. Real-time RT-PCR을 통해 얻어진 자료는 7500 software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 Ct 값으로 변환한 후 분석하였다.
이론/모형
- 0 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 primer_F: 5'- AGTAACACACTCCGATCAACA-3' (115∼135) 및 primer_ R: 5'-GAGCAGTCTATTGATACTCAGTCC-3' (208-185) 를 설계한 후 합성(Bioneer, Korea)하여 실험에 이용하였다. Real-time RT-PCR은 SYBRⓇ Green one-step RT-PCR master mix (Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. 25 μl의 2× SYBRⓇ Green PCR Master Mix, 0.
성능/효과
- Real-time RT-PCR에 의한 각각의 바이러스에 대한 검출 한계는 CVB1에서 1×101/ml, FMDV에서 10−46PD50로 확인되었다.
- 이번 연구에서의 매몰지 토양내 CVB1과 FMDV 검출은 모두 15℃ 온도 조건에서 각각 16주와 20주까지 검출되었으나 실험에 이용된 바이러스가 각각 FMDV 유사 바이러스와 백신주이기 때문에 실제 구제역 바이러스는 이보다 더 생존 가능성이 높을 수 있음을 추정할 수 있다. 그러나 이번 실험에서의 검사법이 바이러스 유전자를 증폭하는 검사임을 고려하면 바이러스가 검출되는 시기보다 짧은 기간 동안 바이러스가 감염력을 가진 상태로 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 침출수에서의 바이러스 검출은 석회층의 통과 여부가 바이러스 검출에 중요하게 작용하였다.
- 매몰 장치 토양에서의 CVB1 검출을 1주, 2주, 3주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주까지 사체 주변 내부와 생석회 바깥쪽의 외부로 구분하여 바이러스 유전자를 검출한 결과 실험 개시 1주부터 12주까지 내부에서 바이러스 유전자가 지속적으로 검출되었으며 16주부터 검출한계 이하로 감소하였다(Fig. 5). 한편 생석회 바깥쪽의 외부에서는 전 실험기간동안 바이러스 검출은 되지않았다.
- 한편, 침출수에서의 바이러스 검출은 석회층의 통과 여부가 바이러스 검출에 중요하게 작용하였다. 생석회층 외부의 토양 시료에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않아서 최적 조건으로 조성된 매몰지의경우 바이러스 누출은 우려하지 않아도 될 것으로 판단되는 반면 매몰지의 조성과정에 문제가 있으면 조성 초기 매몰지 내부의 바이러스가 누출될 가능성이 충분히 있음을 확인하였다.
- 이번 연구에서의 매몰지 토양내 CVB1과 FMDV 검출은 모두 15℃ 온도 조건에서 각각 16주와 20주까지 검출되었으나 실험에 이용된 바이러스가 각각 FMDV 유사 바이러스와 백신주이기 때문에 실제 구제역 바이러스는 이보다 더 생존 가능성이 높을 수 있음을 추정할 수 있다. 그러나 이번 실험에서의 검사법이 바이러스 유전자를 증폭하는 검사임을 고려하면 바이러스가 검출되는 시기보다 짧은 기간 동안 바이러스가 감염력을 가진 상태로 존재한다고 판단할 수 있다.
- 이상의 연구결과와 문헌 조사를 통해 가축 매몰지 내 토양에서 FMDV는 바이러스가 갖는 높은 감염력과는 달리 4개월 이후에는 거의 사멸하는 것으로 생각되며 이를 통해 가축전염병예방법에서 제시하는 3년간의 발굴 금지 기간 내에 충분히 불활화 될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 이 자료는 매몰지의 방역적 측면에서의 관리에 있어 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 침출수에서의 CVB1 검출은 20주까지의 실험 기간 동안 생석회 도포 그룹과 도보하지 않은 그룹을 구분하여 바이러스 유전자를 검출한 결과 침출수가 처음 발생한 실험 개시 3주부터 8주까지 석회 도포층에서는 음성이었으며 석회를 도포하지 않은 그룹의 침출수에서는 모두 양성의 결과를 확인하였다(Table 2).
- 한편 FMDV 검출은 CVB1의 경우와 동일 기간에 사체 주변 내부와 생석회 바깥쪽의 외부로 구분하여 바이러스 유전자를 검출한 결과 실험 개시 1주부터 16주까지 지속적으로 내부에서 바이러스 유전자가 검출되었으며 20주부터 검출한계 이하로 감소하였다(Fig. 6). 그러나 생석회 외부의 경우 전 실험기간동안 바이러스 검출은 되지않았다.
- 한편 침출수에서의 FMDV 검출 결과는 실험 개시 3주부터 8주까지 회수한 침출수 모두에서 석회 도포 층에서는 음성이었고 석회를 도포하지 않은 그룹에서는 모두 양성의 결과를 확인하였다(Table 2).
후속연구
- 이상의 연구결과와 문헌 조사를 통해 가축 매몰지 내 토양에서 FMDV는 바이러스가 갖는 높은 감염력과는 달리 4개월 이후에는 거의 사멸하는 것으로 생각되며 이를 통해 가축전염병예방법에서 제시하는 3년간의 발굴 금지 기간 내에 충분히 불활화 될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 이 자료는 매몰지의 방역적 측면에서의 관리에 있어 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 토양에서의 CVB1와 FMDV는 각각 실험개시 12주와 16주까지 지속해서 검출되었고 침출수에서는 8주까지 검출되었다. 이 결과는 가축 매몰지내 FMDV가 질병의 전파 측면의 위험성과는 달리 비교적 조기에 불활성화 되는 것을 말해주며 방역적 측면에서의 매몰지 관리에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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