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문제 정의
- Exo- 및 endo-fucoidanase는 척추동물의 간췌장[8,16,22], 해양세균[2,5,9,13-14,24-28,30,33] 및 진균[21,32]이 생산하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 저분자량의 fucoidan 생산을 목적으로 해양으로부터 fucoidan을 분해하는 해양세균을 분리하고 분류학적 특성과 함께 효소의 특성을 보고하고자 한다.
제안 방법
- API 20NE (biomerieux), Microlog GN2 plate (Biolog)은 제조사에서 제공된 지침서에 의거하여 생화학적 특성 및 기질 이용도를 분석하였다. 16S rRNA gene 염기서열 분석은 Kwon 등[15]의 방법에 따라 총 DNA를 추출한 후 universal primer (27f, 1492r)를 이용한 PCR을 수행하여 얻어진 산물을 대상으로 염기서열을 결정하였다.
- Fucoidan 분해세균의 분리를 위해, 해수시료를 멸균해수로 희석하여 fucoidan-agar medium (FA; 0.4% (w/v) fucoidan(Ecklonia cava), 10 g Bacto-peptone, 1 g yeast extract, 1 mM ferrous solution, 1.6 mg ammonium nitrate, 8 mM disodium phosphate, 1 l aged seawater, 1.5% agar)에 평판도말하여 25℃에서 5일간 배양하였다. 성장된 집락들은 동일배지를 이용하여 순수배양한 후 fucoidan-liquid medium (FL)에 접종하여 25℃에서 2일간 150 rpm에서 진탕배양하였다.
- Fucoidanase 활성을 위한 온도는 1% fucoidan이 첨가된 0.1 M citric acid–sodium citric buffer (pH 6.0) 1 ml과 조효소액 0.1 ml을 첨가하여 30, 35, 40, 45, 50, 55℃에서 10분간 반응하였다.
- Fucoisanase 활성은 배양액을 원심분리(12,000× g, 10 min)한 후 상등액을 대상으로 상기에 기술된 방법에 따라 측정하였다.
- SB 1493균주로부터 생산된 fucoidanase 활성에 미치는 온도, pH에 대한 특성은 최적조건으로 2일간 배양한 후 원심분리한 상층액을 0.2 um pore size의 여과지로 여과한 여과액을 조효소액으로 하여 조사하였다. Fucoidanase 활성을 위한 온도는 1% fucoidan이 첨가된 0.
- 1 ml을 첨가하여 50℃에서 10분간 반응하였으며 이후 상기 기술된 방법에 의해 환원당을 정량하여 상대적 활성으로 표현하였다. SB 1493균주의 조효소액을 대상으로 시간에 따른 효소활성과 TLC를 이용한 분해산물을 분석하였다. 반응조건은 1% (w/v) fucoidan이 첨가된 0.
- 배양 온도는 25, 30, 35℃에서 진탕배양(150 rpm)하였다. pH에 따른 성장조사를 위한 FL배지는 1 N NaOH와 1 N HCl을 이용하여 pH 4~9로 조정하였으며 NaCl 농도에 따른 성장조사를 위한 FL배지는 숙성해수대신 증류수로 대치하였고 0~20% (w/v) NaCl로 조정하여 전배양액을 접종 후 25℃, 150 rpm에서 진탕배양하였다. 성장은 흡광광도계를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 1 ml을 첨가하여 30, 35, 40, 45, 50, 55℃에서 10분간 반응하였다. pH에 따른 조효소액의 활성은 pH 4, 5, 6 (0.1 mM acetate buffer), pH 7 (0.1 M phosphate buffer), pH 8과 9 (0.1 M Tris-HCl buffer)로 조정된 완충용액에 1% (w/v) fucoidan을 용해한 기질용액 1 ml과 조효소액 0.1 ml을 첨가하여 50℃에서 10분간 반응하였으며 이후 상기 기술된 방법에 의해 환원당을 정량하여 상대적 활성으로 표현하였다. SB 1493균주의 조효소액을 대상으로 시간에 따른 효소활성과 TLC를 이용한 분해산물을 분석하였다.
- SB 1493균주의 조효소액을 대상으로 시간에 따른 효소활성과 TLC를 이용한 분해산물을 분석하였다. 반응조건은 1% (w/v) fucoidan이 첨가된 0.1 M Tris-HCl buffer 용액 4 ml과 조효소액 1 ml를 첨가한 후 50℃에서 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24시간 반응한 후 효소활성을 측정하였다. 반응액을 대상으로 한 산물의 확인을 위한 TLC분석은 Ryu 등[22]의 방법에 따라 silica gel plate에 시료를 점적한 후 전개용매(n-buthanol:acetic acid:H2O=2:1:1)로 전개하였다.
- 분리균주의 성장조건과 효소활성을 조사하기 위해 균주는 FL배지에 접종하여 25℃에서 1일간 전배양한 후 신선한 배지에 0.1% (v/v)를 접종하였다. 배양 온도는 25, 30, 35℃에서 진탕배양(150 rpm)하였다.
- 반응액을 대상으로 한 산물의 확인을 위한 TLC분석은 Ryu 등[22]의 방법에 따라 silica gel plate에 시료를 점적한 후 전개용매(n-buthanol:acetic acid:H2O=2:1:1)로 전개하였다. 전개한 plate는 전개용매를 건조시킨 후 20% (v/v) H2SO4-methanol 용액으로 분무하여 150℃에서 10분간 건조한 후 나타나는 band를 비교하였다.
- 16S rRNA gene 염기서열 분석은 Kwon 등[15]의 방법에 따라 총 DNA를 추출한 후 universal primer (27f, 1492r)를 이용한 PCR을 수행하여 얻어진 산물을 대상으로 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [1]에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT version 3.2 (http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit/index.php?ver=3.1)운영 프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b [29]에 의한 alignment를 수행하였다. 계통분석은 PHYLIP package [7]를 이용한 neighbour-joining [23]와 maximum-likelihood [7]방법에 의해 수행하였다.
대상 데이터
- 1 ml을 첨가하여 50℃에서 10분간 반응하였다. 환원당 정량을 위한 표준물질은 fucose (Sigma, USA)를 이용하였다. 효소의 활성은 1분에 1 uM의 fucose를 생산하는 효소의 양을 1 unit (IU)로 정하였다.
이론/모형
- API 20NE (biomerieux), Microlog GN2 plate (Biolog)은 제조사에서 제공된 지침서에 의거하여 생화학적 특성 및 기질 이용도를 분석하였다. 16S rRNA gene 염기서열 분석은 Kwon 등[15]의 방법에 따라 총 DNA를 추출한 후 universal primer (27f, 1492r)를 이용한 PCR을 수행하여 얻어진 산물을 대상으로 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [1]에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT version 3.
- Neighbourjoining tree topology는 1000 resampling에 기초한 bootstrap 분석에 의해 평가되었다. DNA-DNA hybridization실험은 Kaneko 등[11]의 방법에 의해 수행하였다.
- 계통분석은 PHYLIP package [7]를 이용한 neighbour-joining [23]와 maximum-likelihood [7]방법에 의해 수행하였다. Neighbourjoining tree topology는 1000 resampling에 기초한 bootstrap 분석에 의해 평가되었다. DNA-DNA hybridization실험은 Kaneko 등[11]의 방법에 의해 수행하였다.
- 64b [29]에 의한 alignment를 수행하였다. 계통분석은 PHYLIP package [7]를 이용한 neighbour-joining [23]와 maximum-likelihood [7]방법에 의해 수행하였다. Neighbourjoining tree topology는 1000 resampling에 기초한 bootstrap 분석에 의해 평가되었다.
- 효소의 활성은 1분에 1 uM의 fucose를 생산하는 효소의 양을 1 unit (IU)로 정하였다. 단백질의 정량은 Bradford 방법[3]에 의해 분석하였다.
- 1 M Tris-HCl buffer 용액 4 ml과 조효소액 1 ml를 첨가한 후 50℃에서 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24시간 반응한 후 효소활성을 측정하였다. 반응액을 대상으로 한 산물의 확인을 위한 TLC분석은 Ryu 등[22]의 방법에 따라 silica gel plate에 시료를 점적한 후 전개용매(n-buthanol:acetic acid:H2O=2:1:1)로 전개하였다. 전개한 plate는 전개용매를 건조시킨 후 20% (v/v) H2SO4-methanol 용액으로 분무하여 150℃에서 10분간 건조한 후 나타나는 band를 비교하였다.
- 성장된 집락들은 동일배지를 이용하여 순수배양한 후 fucoidan-liquid medium (FL)에 접종하여 25℃에서 2일간 150 rpm에서 진탕배양하였다. 원심분리(10,000x g, 10 min)한 배양액의 fucoidanase 활성은 Wu 등[32]의 방법에 의거하여 반응한 후 dinitrosalicylic acid 방법[17]에 의해 전환된 환원당을 정량하였다. 1% (w/v) fucoidan이 첨가된 0.
성능/효과
- SB 1493균주는 그람음성, 호기성 간균으로 효소 및 기질 이용성에서 다양한 특징을 보였으며(Table 1), 특히 fucoidan 외에 전분, 한천 및 알긴산과 같은 고분자물질에 대한 분해능을 가지고 있었다. 16S rDNA염기서열을 이용한 계통학적 분석에서 SB 1493균주(JX045665)는 Pseudoalteromonas atlantica IAM 12927T (X82134), P. espejiana NCIMB2127T (X82143), P. agarivorans KMM 255T (AJ417594)과 99.85, 99.78 및 99.70%의 유사도를 나타내었으며 Fig. 4와 같이 계통도를 작성하였다. DNA-DNA hybridization을 통하여 종 수준에서 상동성을 조사한 결과 Pseudoalteromonas atlantica IAM 12927T (X82134)와79.
- 4와 같이 계통도를 작성하였다. DNA-DNA hybridization을 통하여 종 수준에서 상동성을 조사한 결과 Pseudoalteromonas atlantica IAM 12927T (X82134)와79.24% 그리고 P. espejiana NCIMB 2127T (X82143)와 71.45%의 상동성을 나타내었다(자료미제시). 또한 SB 1493균주와 cluster 를 이루고 있는 Pseudoalteromonas 종들은 16S rDNA 염기서열에 의한 유사성과 DNA-DNA 상동성이 매우 높은 그룹으로 향후 분류학적 특징의 조사가 필요할 것으로 판단된다.
- 해양으로부터 분리된 세균을 대상으로 FL 배지에서 2일간 배양한 후 fucoidanase 활성을 측정한 결과 SB 1493균주는 가장 높은 활성을 나타내었다. SB 1493균주의 생장조건에 따른 성장과 fucoidanase 활성을 검토한 결과 온도, pH 및 NaCl 요구성은 최적성장조건과 효소활성이 일치하였다(Fig. 1). 즉, 온도는 25℃, pH는 7.
- 71 mg/ml) 완만히 증가하였다. TLC 크로마토그램을 통한 분해산물의 변화를 관찰한 결과 하나의 뚜렷한 oligosaccharide (Rf 0.3)만이 관찰되었다(Fig. 3B). 이러한 결과로 SB 1493균주는 endo-type의 oligosaccharide로 가수분해된 반면 fucose는 검출되지 않았다.
- 3B). 이러한 결과로 SB 1493균주는 endo-type의 oligosaccharide로 가수분해된 반면 fucose는 검출되지 않았다.
- 2에 도식화하였다. 조효소액에서 fucoidanse 활성은 50℃ (활성영역: 45~55℃), pH 8 (활성영역: pH 7~9)로 결정되었다. 기존보고에 따르면 endo- 또는 exo-fucoidanase의 주된 보고는 Pseudoalteromonas, Alterominas, Vibrio, Sphinomonas, Fucobacteria, Gelidibacter, Vibrio속 등으로 해양 세균에서 발견되어져 왔으며[2,5,9,13-14,24-28,30,33] 특히, Pseudoalteromonas, Gelidibacter, Sphinomonas 및 Alterominas가 생산하는 효소는 endo-type으로 fucoidan으로부터 다양한 형태의 저분자량인 oligosaccharide를 생산하는 것으로 보고하였다.
- 1). 즉, 온도는 25℃, pH는 7.8 그리고 NaCl 요구성은 3%로 나타나 SB 1493균주는 fucoidan을 분해하는 전형전인 호염성의 해양 세균임을 확인할 수 있었다.
- 해양으로부터 분리된 세균을 대상으로 FL 배지에서 2일간 배양한 후 fucoidanase 활성을 측정한 결과 SB 1493균주는 가장 높은 활성을 나타내었다. SB 1493균주의 생장조건에 따른 성장과 fucoidanase 활성을 검토한 결과 온도, pH 및 NaCl 요구성은 최적성장조건과 효소활성이 일치하였다(Fig.
후속연구
- 45%의 상동성을 나타내었다(자료미제시). 또한 SB 1493균주와 cluster 를 이루고 있는 Pseudoalteromonas 종들은 16S rDNA 염기서열에 의한 유사성과 DNA-DNA 상동성이 매우 높은 그룹으로 향후 분류학적 특징의 조사가 필요할 것으로 판단된다. 이러한 결과로부터 SB 1493균주는 Pseudoalteromonas 속에 속하는 Pseudoalteromonas sp.
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