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문제 정의
- 본 연구에서는 신규 천연항생물질을 개발하고자 토양으로부터 항균활성을 보이는 세균을 탐색하고, 순수분리하여 각 분리균주들에 대해 분자계통분류학적, 생리화학적, 표현형적 특성을 분석하였고, 세균과 진균을 포함한 병원성 미생물들을 대상으로 분리균주들의 항균활성에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 16S rRNA 유전자는 universal primer (27F; 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′, 1492R; 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)를 이용하여 PCR을 수행하였다(Lane, 1991; Turner et al., 1999).
- BHI soft agar에 포함된 검정대상 미생물이 충분히 자란 것을 확인한 이후에 생장억제대의 최대 지름을 측정하였다. 그 결과 세균주는 그람 양성 세균인 Bacillus subtilis 및 Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, 그람 음성 세균인 Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등에 대해 항균 스펙트럼을 보였다(Table 3).
- Ringer 용액에 검정대상 미생물이 OD600=0.5의 농도로 보관된 현탁액 100 μl이 접종된 BHI soft agar 배지 5 ml을 배양이 끝난 ISP-2 한천배지 위에 각각 쏟아 굳힌 후 다시 24시간 배양하여 생장억제대 유무를 관찰하였다.
- 염기서열 결정은 ㈜SolGent에 의뢰하여 수행하였다. 결정된 각 염기서열은 EzTaxon-e server (http://eztaxone.ezbiocloud.net)의 16S rRNA gene 염기서열 정보를 이용하여 동정하였다(Kim et al., 2012).
- 또한 API 20NE Kit (bioMérieux Co., France)와 API ZYM Kit (bioMérieux Co.)를 사용하여 추가적인 생리학적 특성 분석을 실시하였다.
- 분리한 방선균주들의 콜로니 형태, 포자형성 여부, 포자체와 기질균사체의 색상 등 배양학적 특성과 그람 염색, pH 및 NaCl 요구성, 생장온도 범위, 포자형성 등 생리·생화학적 특성을 분석하였다.
- 선별된 균주의 분자계통분류학적 분석을 위하여 각 분리 균주를 10 ml ISP-2 액체 배지에서 진탕배양(200 rpm, 3 days, 30℃) 하였다. 배양액을 원심분리(2,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 상층액을 제거하고 침강된 균체만을 얻었다.
- 세 균주의 gDNA로부터 PCR을 통해 약 1.5 kb의 16S rRNA gene 단편을 증폭한 뒤에 그 염기서열을 결정하여 각 균주의 분자계통학적 유연관계를 조사하였다. 그 결과 세 균주의 16S rRNA gene 염기서열은 Streptomyces 속에 속하는 것으로 나타났다.
- 전처리한 토양 시료를 ISP-2 한천배지에 도말하여 2주간 배양한 결과 단일콜로니들이 형성되었다. 이 중 기균사를 형성하는 방선균의 특징을 나타내는 콜로니 3개를 선택하여 분리, 계대하였으며, 이들을 각각 SW-14, SW-15, SW-16으로 명명하였다.
- 채취한 토양 시료로부터 포자비형성 세균을 사멸시키기 위하여 채취한 토양 시료를 37℃에서 1일간 건조시킨 뒤, 토양 1 g을 Ringer 용액(NaCl 2.25 g, KCl 0.105 g, CaCl2 0.12 g, NaHCO3 0.05 g/L)을 이용하여 희석하였다.
- 배양액을 원심분리(2,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 상층액을 제거하고 침강된 균체만을 얻었다. 침강된 균체로부터 세균용 Genomic DNA Prep Kit (SolGent, Korea)를 사용하여 각 균주의 DNA를 획득하였다.
- 토양시료로부터 광범위한 항생작용을 보이는 방선균 3개 균주를 분리하여 그 특성을 조사하였다. 분리주의 16S rRNA 유전자 염기서열 비교 분석을 통해 3개 분리주는 모두 Streptomyces 속에 속하고, S.
대상 데이터
- 선택 분리에는 항진균제인 cycloheximide와 nystatin을 50 µg/ml 농도로 첨가한 malt extract agar (ISP-2 agar; yeast extract 4.0 g, malt extract 10.0 g, glucose 4.0 g, agar 20 g/L)와 inorganic salts-starch agar [ISP-4 agar; soluble starch 10.0 g, K2HPO4 1.0 g, MgSO4 1.0 g, NaCl 1.0 g, (NH4)2SO4 2.0 g, CaCO3 2.0 g, FeSO4 0.001 g, MnCl2 0.001 g, ZnSO4 0.001 g, agar 20.0 g/L]를 사용하였다.
- 토양 시료의 채취는 정원 토양에서 이루어졌다. 시료는 지면에서 4–5 cm 깊이에서 채취하여 비닐 팩에 담은 후 냉장 보관하여 실험실로 운반하였고 4℃에서 분리할 때까지 보관하였다.
성능/효과
- Streptomyces tanashiensis LMG 20274T 균주의 16S rRNA gene 염기서열과 99.3–99.6%의 상동성을 보여 가장 분자계통학적 유사성이 높은 것으로 나타났다.
- pH 7.0–9.0와 1.0% NaCl에서 가장 높은 생장 정도를 확인할 수 있었으나, pH 4.0 이하와 NaCl 5.0% 이상의 환경에서는 생장이 관찰되지 않았다.
- 5 kb의 16S rRNA gene 단편을 증폭한 뒤에 그 염기서열을 결정하여 각 균주의 분자계통학적 유연관계를 조사하였다. 그 결과 세 균주의 16S rRNA gene 염기서열은 Streptomyces 속에 속하는 것으로 나타났다. 세 분리 균주간의 유사도는 99.
- BHI soft agar에 포함된 검정대상 미생물이 충분히 자란 것을 확인한 이후에 생장억제대의 최대 지름을 측정하였다. 그 결과 세균주는 그람 양성 세균인 Bacillus subtilis 및 Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, 그람 음성 세균인 Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등에 대해 항균 스펙트럼을 보였다(Table 3). 그리고 진균인 Candida tropicalis 및 Candida krusei에 대해서도 세 균주 모두 미약한 항균활성을보였다.
- 본 연구에서 분리된 Streptomyces 균주들은 앞서 언급된 것처럼 분류학적으로 신종을 형성할 가능성이 높아 이들로부터 신규성을 가진 항생물질을 발굴할 수 있는 가능성도 충분히 크다고 판단된다. 그리고 각 균주들이 서로 다른 항생활성을 보여주고 있다는 점과 API 결과에서도 다소간의 차이를 보인다는 점에 비추어 이들 균주들이 각각 다른 종류의 항생물질을 생산할 수 있는 가능성도 있는 것으로 보인다. 특히 SW-14의 경우 두 종의 그람 양성 세균에 대해 항균활성을 나타내지 않아 SW-15나 SW-16의 항생활성과 뚜렷이 구별되었으므로, SW-14가 분비하는 항생물질은 다른 두 균주의 물질들과는 다를 것으로 예상된다.
- 그 결과 세균주는 그람 양성 세균인 Bacillus subtilis 및 Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, 그람 음성 세균인 Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등에 대해 항균 스펙트럼을 보였다(Table 3). 그리고 진균인 Candida tropicalis 및 Candida krusei에 대해서도 세 균주 모두 미약한 항균활성을보였다. 전체적으로 세균을 대상으로 한 항균활성에 있어 세 균주간에 차이가 관찰되었다.
- 다음으로 Streptomyces rubiginosohelvolus IFO 12912T (99.2–99.5%), Streptomyces nashvillensis NBRC 13064T (99.2–99.5%)와 높은 상동성을 보였다.
- 0% 이상의 환경에서는 생장이 관찰되지 않았다. 또한 ISP-2 agar 배지에서 적갈색 색소 생산이 관찰되었으며, ISP-4 agar 배지에서 기균사 형성과 포자형성이 관찰되었다. ISP-2 agar 배지 위에서는 배양 10일차까지 세 균주 모두 포자형성이 관찰되지 않았다.
- 항균활성 검정 결과 세 균주는 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 등의 그람 양성 세균, Salmonella typhi, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등의 그람 음성 세균, 그리고 Candida tropicalis 및 Candida krusei 등의 진균류에 대해 각각 서로 다른 길항작용을 보였다. 또한 세 균주 간에는 생리학적 활성에도 차이가 나타나 각 균주가 서로 다른 항생물질을 분비할 가능성이 있음을 보여주었다.
- 토양 서식 Streptomyces의 다양성은 본 연구에서 나타난 것처럼 아직도 충분히 밝혀지지 않은 상태이며, 매년 다수의 신규 항생물질들이 보고되고 있다. 본 연구 결과 확보한 Streptomyces 속 균주들은 분류학적 신규성을 가진다는 점과 광범위한 항균활성을 가진다는 점에서 주목할 만 하다. 향후, 분리된 균주들로부터 항생물질을 분리하고 동정하며, 그 특성을 연구하고자 한다.
- , 1995) 등을 생산하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 분리된 Streptomyces 균주들은 앞서 언급된 것처럼 분류학적으로 신종을 형성할 가능성이 높아 이들로부터 신규성을 가진 항생물질을 발굴할 수 있는 가능성도 충분히 크다고 판단된다. 그리고 각 균주들이 서로 다른 항생활성을 보여주고 있다는 점과 API 결과에서도 다소간의 차이를 보인다는 점에 비추어 이들 균주들이 각각 다른 종류의 항생물질을 생산할 수 있는 가능성도 있는 것으로 보인다.
- 토양시료로부터 광범위한 항생작용을 보이는 방선균 3개 균주를 분리하여 그 특성을 조사하였다. 분리주의 16S rRNA 유전자 염기서열 비교 분석을 통해 3개 분리주는 모두 Streptomyces 속에 속하고, S. tanashiensis, S. nashivillensis 및 S. rubiginosohelvolus와 근연 관계에 있는 것으로 나타났으나 독립적인 계통을 형성하여 신종으로서의 가능성을 보여주었다. 항균활성 검정 결과 세 균주는 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 등의 그람 양성 세균, Salmonella typhi, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등의 그람 음성 세균, 그리고 Candida tropicalis 및 Candida krusei 등의 진균류에 대해 각각 서로 다른 길항작용을 보였다.
- 세 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분류학적 유연관계의 분석 결과, 항생물질 생산 종인 Streptomyces tanashiensis LMG 20274T와 99.3–99.6%의 상동성을 나타내었다.
- 세 균주의 최적 생장온도는 25–30℃이었으며, 10℃에서 45℃사이에서 생장을 관찰할 수 있었고, 45℃이상에서는 생장을 관찰할 수 없었다.
- 세 분리 균주간의 유사도는 99.93–100%로 나타났다.
- 토양으로부터 분리되어 광범위한 항균활성을 나타내는 Streptomyces 속 균주들을 선발한 결과 SW-14, SW-15, SW-16의 세 균주가 순수분리되었다. 세 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분류학적 유연관계의 분석 결과, 항생물질 생산 종인 Streptomyces tanashiensis LMG 20274T와 99.
- rubiginosohelvolus와 근연 관계에 있는 것으로 나타났으나 독립적인 계통을 형성하여 신종으로서의 가능성을 보여주었다. 항균활성 검정 결과 세 균주는 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 등의 그람 양성 세균, Salmonella typhi, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa 등의 그람 음성 세균, 그리고 Candida tropicalis 및 Candida krusei 등의 진균류에 대해 각각 서로 다른 길항작용을 보였다. 또한 세 균주 간에는 생리학적 활성에도 차이가 나타나 각 균주가 서로 다른 항생물질을 분비할 가능성이 있음을 보여주었다.
후속연구
- 본 연구 결과 확보한 Streptomyces 속 균주들은 분류학적 신규성을 가진다는 점과 광범위한 항균활성을 가진다는 점에서 주목할 만 하다. 향후, 분리된 균주들로부터 항생물질을 분리하고 동정하며, 그 특성을 연구하고자 한다.
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