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문제 정의
- 또한 고등식물의 사멸을 유도하는 elicitor는 식물세포내의 pH를 감소시키고 Ca++, K+ 등의 농도를 낮추어 새포내 신호전달체계를 교란시켜 사멸시키는 과정은 잘 알려져 있다 [19, 21]. 본 연구에서는 미세조류 중의 하나인 C. polykrikoides에 알긴산 올리고 유도체를 처리하고 세포내 pH 변화를 조사하여, 미세조류 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 간접적인 영향을 분석하였다. 연구결과 세포내 pH는 약 0.
- 이에 따라 본 연구에서는 적조생물의 사멸에 탁월한 작용을 하며 환경오염을 최소화할 수 있는 물질에 대해 연구하고자 했고, 해조류 추출물에 의한 적조생물의 사멸에 관한 연구를 하였다. 또한 해조류 추출물의 작용기작을 연구함으로써 적조방제에 관한 연구뿐만 아니라 해양 생태학 및 생리학적 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 0.5 L 삼구 플라스크에 고분자 알긴산 10 g을 첨가하고 2 N HCl 내에서 80℃에서 반응시키면서 1시간 단위로 시료를 채취하여 미세조류에 처리하였으며 가장 효율이 좋은 시간대의 시료를 다음 반응에 사용하였다. HCl 반응물에 1% H₂O₂를 첨가하여 80℃에서 반응시키면서 가수분해된 저분자 알긴산은 시간별로 채취하여 pH를 8 로 조절하고 이를 생물체에 처리하여 항생기능의 존재 유무를 확인하였다.
- 다시마로부터 고분자의 알긴산을 추출하고, 이를 미세조류의 사멸에 사용하기 위하여 HCl과 H₂O₂를 차례로 처리하여 가수분해시켰다. 2 N HCl에 의해 추출된 추출물을 시간별로 채취하고 pH를 조정한 후 0.05%의 알긴 산을 Akashiwo sanguinea와 Cochlodinium polykrikoides 에 처리하여 항미세조류 기능을 관찰하였다 [표 1, 2]. 고분자 알긴산을 2 N HCl에서 반응시켰을 때 3시간 이후는 항미세조류 기능이 증가하는 것으로 나타났고, 4시간 이후에는 효율이 거의 변화가 없었다 [표 1].
- 알긴산 올리고 유도체가 보유하고 있는 항생기능에 대한 작용기작을 설명하기 위하여 1) 알긴산 올리고 유도체에 의한 세포 내‧외의 삼투압 변화 및 이를 통한 세포의 팽창 및 수축, 2) 알긴산 올리고 유도체에 의한 세포내 신호전달체계 (signal transduction pathway)의 교란에 의한 탈수 및 사멸 등 알긴산 올리고 유도체에 의한 직접적인 작용과 간접적인 작용으로 구분하여 조사하였다.
- 5 L 삼구 플라스크에 고분자 알긴산 10 g을 첨가하고 2 N HCl 내에서 80℃에서 반응시키면서 1시간 단위로 시료를 채취하여 미세조류에 처리하였으며 가장 효율이 좋은 시간대의 시료를 다음 반응에 사용하였다. HCl 반응물에 1% H₂O₂를 첨가하여 80℃에서 반응시키면서 가수분해된 저분자 알긴산은 시간별로 채취하여 pH를 8 로 조절하고 이를 생물체에 처리하여 항생기능의 존재 유무를 확인하였다.
- 45 μM)를 이용하여 걸렀다. 걸러진 미세조류는 2 mL의 냉각 증류수로 두 번 세척 한 후 10 mL의 scintillation cocktail을 첨가하고 미세조류 내에 존재하는 방사능의 양을 측정하였다. pHi는 아래의 공식에 의해 계산되었다.
- 다시마로부터 고분자의 알긴산을 추출하고, 이를 미세조류의 사멸에 사용하기 위하여 HCl과 H₂O₂를 차례로 처리하여 가수분해시켰다. 2 N HCl에 의해 추출된 추출물을 시간별로 채취하고 pH를 조정한 후 0.
- 이에 따라 본 연구에서는 적조생물의 사멸에 탁월한 작용을 하며 환경오염을 최소화할 수 있는 물질에 대해 연구하고자 했고, 해조류 추출물에 의한 적조생물의 사멸에 관한 연구를 하였다. 또한 해조류 추출물의 작용기작을 연구함으로써 적조방제에 관한 연구뿐만 아니라 해양 생태학 및 생리학적 연구를 수행하였다.
- 미세조류 현탁액을 시험관으로 옮기고, 200 rpm, 25℃으로 세팅된 교반배양기에서 1 μL의 [14C]DMO (about 105 cpm)와 8 μL의 cold DMO 첨가하였다.
- 미세조류의 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 농도 영향을 살펴보고자, 표시된 농도의 알긴산 올리고 유도체를 A. sanguinea와 C. polykrikoides에 처리하였다. 0.
- 삼투압 변화로 인한 세포사멸 유도를 관찰하기 위하여 만니톨 (mannitol)을 삼투압조절제로 사용하였고, 만니톨을 0.05-1.0%까지 처리한 후 시간별로 식물플랑크톤의 사멸을 관찰하였다.
- 세포 내 ‧ 외의 pH 변화 측정은 Lee 등 (1999)의 방법을 따라 수행하였다 [18]. 세포외 pH (pHe) 변화는 pH electrode (ATI Orion 420A, USA)를 이용하여 지정된 시간에 측정하였다. 세포내 pH (pHi)는 Kurkdjian 등 (1978) 의 방법을 일부 수정하여 진행하였다 [19].
- )를 미세하게 분쇄한 후 NaHCO₃ 용액으로 다시마에 함유되어 있는 알긴산을 분리하였다. 이를 메탄올을 이용하여 분말결정화한 후 동결건조하여 고분자 알긴산 분말을 얻었다.
- 직접적으로 알긴산 올리고 유도체가 세포 내‧외의 삼투압을 변화시켜 세포의 파쇄를 이루었는지를 관찰하기 위해, 일반적으로 세포배양시에 삼투압조절제로 사용되는 만니톨 (mannitol)을 대조구로 하여 실험하였다. 알긴산 올리고 유도체 처리농도의 약 10배인 0.
- 추출된 저분자 알긴산 올리고 유도체 0.05%를 A.sanguinea와 C. polykrikoides에 처리하여 세포사멸을 관찰하였다 [그림 2, 3]. A.
- 추출물내의 분자량 측정은 Usov et al (1995) 방법을 수정하여 사용하였다 [17]. 0.
대상 데이터
- Spectrophotometer를 이용하여 450과 400 nm를 측정하였고, 물을 blank로 사용하였다. 450과 400 nm의 흡광도 차이가 알긴산 농도이고 표준물질로는 sodium alginate를 사용하였다.
- 1 mL을 첨가한 후 실온에서 10분간 방치하였다. Spectrophotometer를 이용하여 450과 400 nm를 측정하였고, 물을 blank로 사용하였다. 450과 400 nm의 흡광도 차이가 알긴산 농도이고 표준물질로는 sodium alginate를 사용하였다.
- 자연건조한 다시마 (Laminaria spp.)를 미세하게 분쇄한 후 NaHCO₃ 용액으로 다시마에 함유되어 있는 알긴산을 분리하였다. 이를 메탄올을 이용하여 분말결정화한 후 동결건조하여 고분자 알긴산 분말을 얻었다.
이론/모형
- 분리된 알긴산의 분자량 분포 조사를 위하여 Brookfield 점도계를 사용하여 100 rpm으로 측정하였고, 최초 사용된 알긴산의 순도를 확인하기 위한 총 uronic acid 함량 측정은 Haug와 Larsen (1962)의 표준 가수분해 방법에 의해 실시하였다 [16]. 분자량 분포도 분석은 gel permeation 크로마토그래피 분석시스템 (JASCO, Model LC-90, Jasco Co.
- 분리된 알긴산의 분자량 분포 조사를 위하여 Brookfield 점도계를 사용하여 100 rpm으로 측정하였고, 최초 사용된 알긴산의 순도를 확인하기 위한 총 uronic acid 함량 측정은 Haug와 Larsen (1962)의 표준 가수분해 방법에 의해 실시하였다 [16]. 분자량 분포도 분석은 gel permeation 크로마토그래피 분석시스템 (JASCO, Model LC-90, Jasco Co., 일본)을 이용하였다.
- 세포 내 ‧ 외의 pH 변화 측정은 Lee 등 (1999)의 방법을 따라 수행하였다 [18]. 세포외 pH (pHe) 변화는 pH electrode (ATI Orion 420A, USA)를 이용하여 지정된 시간에 측정하였다.
성능/효과
- 1) 다시마로부터 추출된 고분자 알긴산을 2 N HCl과 1% H₂O₂에 연속적으로 반응시켜 항미세조류 활성을 갖는 알긴산 올리고 유도체를 제조하였고, 2 N HCl과 1% H₂O₂에서 각각 4시간씩 반응시켰을 때 최적의 항미세조류 기능이 있는 반응물이 생성되었다.
- 따라서 2 N HCl에서 4시간 반응 후 다음 단계인 1% H₂O₂반응을 실시하였다. 2 N HCl에서 4시간 반응한 추출물에 1% H₂O₂를 첨가하고, 시간별로 반응물을 미세조류에 처리하여 항미세조류 기능을 알아보았는데 반응시간이 4시간 이후부터는 약 5분내에 90%의 미세조류가 사멸하는 것이 관찰되었다[표 2]. 따라서 다시마로부터 추출된 고분자 알긴 산을 2 N HCl과 1% H₂O₂에 연속적으로 반응시켰을 때 항미세조류 활성을 갖게 되었고, 2 N HCl과 1% H₂O₂에서 각각 4시간씩 반응시켰을 때 최적의 항미세조류 기능이 있는 반응물이 생성되었다.
- 2) 미세조류 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 농도별 영향을 분석하였을 때, 0.05% (w/v) 이상의 농도에서 90% 이상의 세포가 사멸하였다.
- 3) 0.05%의 알긴산 올리고 유도체를 처리하였을 때, A. sanguinea는 세포의 움직임이 크게 둔화되었고, 일부는 세포가 파쇄되었다. C.
- 4) 알긴산 올리고 유도체의 항미세조류 활성은 세포 내‧외의 pH 변화가 세포내 신호전달체계를 변화시켜 미세조류의 사멸을 유도하는 것으로 추측된다.
- 05% (w/v) 이상의 알긴산 올리고 유도체를 첨가하였을 때, 첨가하자마자 90% 이상의 세포가 사멸하였다 [그림 1]. A.sanguinea는 알긴산 올리고 유도체 농도가 증가함에따라 사멸시간이 감소하는 반면, C. polykrikoides는 0.02%까지는 사멸시간이 감소하지 않았는데 이는 건강한 시기에 사슬을 형성하는 C. polykrikoides가 사멸과정에서 사슬형태가 단일세포로 분리되는데 필요한 필요한 시간이 요구되는 것으로 판단된다.
- sanguinea는 세포의 움직임이 크게 둔화되었고, 일부는 세포가 파쇄되었다. C. polykrikoides의 움직임이 정지하고 사슬모양에서 단일세포로 분리되었으며, 원형질분리가 일어나 사멸하였다.
- sanguinea는 알긴산 올리고 유도체를 처리하자마자 세포의 움직임이 크게 둔화되었고, 일부는 세포가 터지는 현상이 관찰되었다. 동일한 농도의 알긴산 올리고 유도체를 C. polykrikoides에 처리하였을 때, C. polykrikoides의 움직임이 정지하였으며, 사슬형태가 단일세포로 분리되었고, 원형질이 축소되는 원형질분리 현상이 일어나 사멸하였다.
- 2 N HCl에서 4시간 반응한 추출물에 1% H₂O₂를 첨가하고, 시간별로 반응물을 미세조류에 처리하여 항미세조류 기능을 알아보았는데 반응시간이 4시간 이후부터는 약 5분내에 90%의 미세조류가 사멸하는 것이 관찰되었다[표 2]. 따라서 다시마로부터 추출된 고분자 알긴 산을 2 N HCl과 1% H₂O₂에 연속적으로 반응시켰을 때 항미세조류 활성을 갖게 되었고, 2 N HCl과 1% H₂O₂에서 각각 4시간씩 반응시켰을 때 최적의 항미세조류 기능이 있는 반응물이 생성되었다.
- 직접적으로 알긴산 올리고 유도체가 세포 내‧외의 삼투압을 변화시켜 세포의 파쇄를 이루었는지를 관찰하기 위해, 일반적으로 세포배양시에 삼투압조절제로 사용되는 만니톨 (mannitol)을 대조구로 하여 실험하였다. 알긴산 올리고 유도체 처리농도의 약 10배인 0.5-1.0%의 만니톨을 처리하였을 때 적조생물의 사멸에는 전혀 영향을 미치지 않는 것이 관찰되어 (자료 미제시), 알긴산 올리고 유도체 처리시 단순한 삼투압 변화를 유도하여 사멸 하는 것은 아닌 것으로 추정되었다.
- polykrikoides에 알긴산 올리고 유도체를 처리하고 세포내 pH 변화를 조사하여, 미세조류 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 간접적인 영향을 분석하였다. 연구결과 세포내 pH는 약 0.3 unit 감소하고, 세포외 pH는 0.9 unit 증가하였다 [표 3]. 이러한 세포 내 ‧외의 pH 변화는 미세조류 세포의 막전위 변화를 의미하며, 세포막전위 변화가 미세조류 세포내 신호전달체계를 변화시켜 물 수송의 변화를 유도하고, 이러한 결과로 인하여 미세조류가 사멸되는 것으로 추측된다.
후속연구
- 본 연구에서 추출한 알긴산 올리고 유도체는 천연 해조류인 다시마로부터 추출한 알긴산 올리고당 유도체로서, 적조생물의 사멸에 대한 실험 결과는 이제까지 보고된 어떠한 적조사멸제에 비해 뒤떨어지지 않는 효과를 보이는 것이며, 기존의 화학적 적조사멸 방법은 이차적인 환경오염의 유발가능성으로 인하여 실제 사용하기에 문제점이 있으나, 알긴산 올리고 유도체는 천연해조류로부터 추출한 물질이고, 그 구성성분이 올리고당이므로 거의 환경오염을 일으키지 않을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 알긴산 올리고 유도체가 적조방제를 위한 황토대체물질로서 활용이 가능하며, 적조방제물질의 살포에 따른 환경오염을 경감시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다. 또한 알긴산 올리고 유도체를 어병치료제로 개발하고 박테리아, 바이러스, 균류 및 암세포에 처리하여 항박테리아, 항바이러스, 항균 및 항암 효과 가능성 및실용화 여부를 타진하는 연구를 수행하고 있으며, 이를 통한 의약품 원료로서의 가능성을 연구하고 있다.
- 또한 알긴산 올리고 유도체를 어병치료제로 개발하고 박테리아, 바이러스, 균류 및 암세포에 처리하여 항박테리아, 항바이러스, 항균 및 항암 효과 가능성 및실용화 여부를 타진하는 연구를 수행하고 있으며, 이를 통한 의약품 원료로서의 가능성을 연구하고 있다. 알긴산 올리고 유도체의 추출 및 작용기작에 관한 연구는 천연 해조류로부터의 유용자원을 추출하고, 기능성 보유에 관한 연구를 확대시킬 수 있는 기초자료로서의 가치뿐만 아니라 국내 경제, 산업, 사회적 파급효과가 클 것으로 기대된다.
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