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문제 정의
- 1988), 제10형 콜라겐 역시 연골의 중요한 구성분 중의 하나이다. 따라서본 연구에서 실크 피브로인 단백질이 제2형 콜라겐과 제 10형 콜라겐의 발현량을 증가시킬 수 있다는 것은 실크단백질이 연골재생에 효과적인 소재로서의 이용 가능성을 제시해 준다. 향후 연골재생과 관련된 실크 단백질의 효과를 좀 더 체계적으로 연구하고자 한다.
- 실크단백질은 생체적합성이 뛰어나며, 우수한 기계적 강도를 가지고 있는 천연 고분자 물질로서 최근 생체재료로 사용하기위한 연구가 세계적으로 많이 이루어지고 있다. 본 연구는 실크단백질이 연골재생에 효과가 있는지를 확인하기위하여 수행되었다. 우리는 연골세포를 코뼈로부터 분리하고, 3종류의 배지 (DMEM, DMEM/F12, RPMI)와 서로 다른 농도의 ascorbic acid를 사용하여 최적 배양조건을 확립하였다.
제안 방법
- PCR반응은 PCR기기(PCR thermal cycler, Takara, Japan)를 이용하여 94℃에서 4분 predenaturation 후, 94℃에서 60초 동안 denaturation, 50℃에서 60초 동안 annealing, 72℃에서 60 초 동안 extension 반응을 35 cycle 반복 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 최종 extension하였다. PCR반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다. 얻어진 이미지는 Image J program을 이용하여 분석하였다.
- 제2형 콜라겐(sense, 5’-TGGTCTT GGTG GAAACTTTGC TGC-3’; antisense, 5’-AGGTTCA CCAGGTTCACCAGGATT-3’), 제10형 콜라겐(sense, 5’- TACCACGTGCATGTGAAAGGGACT-3’; antisense, 5’-TGA AGCCTGATCCAGGTAGCCTTT-3’), GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase; sense, 5’-AGCCGCATCT TCTTTTGCGTC-3’; antisense, 5’-TCATATTTGGCAGGTT TTTCT-3’). PCR반응은 PCR기기(PCR thermal cycler, Takara, Japan)를 이용하여 94℃에서 4분 predenaturation 후, 94℃에서 60초 동안 denaturation, 50℃에서 60초 동안 annealing, 72℃에서 60 초 동안 extension 반응을 35 cycle 반복 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 최종 extension하였다. PCR반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다.
- 유전자의 발현수준을 분석하기 위하여 배양한 세포로부터 전체 RNA를 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 분리하였다. cDNA 합성과 PCR은 amfiRivert 1-step RT-PCR kit (GenDEPOT, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR을 위한 프라이머는 다음과 같다.
- 제2형 콜라겐의 발현량을 조사하기위하여 실크 용액은 멸균한 것 (autoclaved silk)과 멸균하지 않은 것(non-autoclaved silk) 을 시료로 사용하여 3차원 배양하고 14일 후 세포를 회수하여 RNA를 얻었다. cDNA를 합성하고 GAPDH와 제 2형 콜라겐의 PCR을 수행하여 GAPDH의 발현량에 상대 적인 제2형 콜라겐의 발현량을 계산였다. 그 결과 대조군에 비해 2.
- 그 결과 DMEM배지에서 10% FBS와 200 µM의 ascorbic acid 가 첨가된 조건에서 가장 잘 증식하였으나 ascorbic acid 의 농도가 100 µM나 200 µM 사이의 유의차가 없었으므로, 100 µM ascorbic acid와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 최적 배양조건으로 선정하였다(Fig. 2).
- 누에고치로부터 세리신을 제거하고 피브로인만을 얻기 위하여 누에고치에 마그세이유 비누를 넣고 끓여 정련하였다. 실크피브로인 수용액을 얻기위하여, 정련하여 실크세리신이 제거된 정련솜을 염화칼슘-에탄올 수용액(염화 칼슘 : 에탄올 : 물 = 1 : 2 : 8 몰비율)으로 80℃에서 용해시키고 부직포와 탈지면을 이용하여 거른 뒤 염을 제거하기 위하여 셀룰로오스 투석막(MWCO = 12,000~14,000)으로 3일동안 증류수에 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조하였다.
- 연골은 다른 조직과는 달리 세포가 차지하는 비중보다는 기질이 차지하는 비중이 아주 높아 2차원 배양시에는 연골로서의 기능을 거의 수행하지 않는다. 따라서 연골세포의 3차원 배양 법을 확립하기위해 2차원배양에서 세포수를 증가시킨 다음 16,000~25,000 cells/ml 정도의 세포들을 원심분리를 이용하여 pellet을 만들었다.
- 시험을 위한 실크 용액은 멸균한 것(autoclaved silk)과 멸균하지 않은 것(non-autoclaved silk)을 시료로 사용하였다. 또한 연골세포 배양시 실크를 첨가하여 또다른 연골 마커인자인 제10형 콜라겐 유전자의 발현량을 PCR을 이용하여 분석하였다. 유전자의 발현수준을 분석하기 위하여 배양한 세포로부터 전체 RNA를 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 분리하였다.
- 그러나 연골세포 특이적인 제2형 콜라겐의 발현에 영향을 미치는 실크 단백질의 어떤 특별한 활성 인자가 멸균을 통해서 활성을 잃어버렸을 것이라 예상되어진다. 또한 제10형 콜라겐의 영향을 2차원 배양과 3차원 배양을 통하여 조사하였다. 제 2형 콜라겐과 마찬가지로 PCR을 통하여 분석하였으며, 그결과 2차원 배양에서는 대조군에 비하여 약 1.
- 본 연구에서는 실크의 연골재생 효과에 대한 가능성을 알아보기 위하여, 연골세포를 분리하고, 최적배양조건을 확립한 후 실크 피브로인을 연골 세포 배양시 첨가하여 연골분화 마커인자인 제2형 콜라겐과 제10형 콜라겐 유전자의 발현량을 조사하였다.
- 분리한 연골세포의 최적 배양조건을 확립하기위하여 세포배양접시(2차원배양)에서 연골세포의 최적 배양조건을 확립하기위하여 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium; Gibco BRL, Carlsbad, CA), DMEM/F12(DMEM/Ham’s F12 Nutrients mixture; Gibco BRL), RPMI(Gibco BRL)배지에서 10% FBS(fetal bovine serum; Gibco BRL)와 ascorbic acid(Sigma, St. Louis, MO) 0~200 µM의 농도로 첨가하여 10일 동안 연골세포의 성장과 증식정도를 관찰하였다.
- 실크 단백질 중 피브로인만을 얻기위하여 세리신을 제거하기위한 정련을 실시하였다. 정련된 실크정련솜을 염화칼슘-에탄올 수용액을 이용하여 용해시켜 실크 피브로인 단백질을 제조하였다.
- 누에고치로부터 세리신을 제거하고 피브로인만을 얻기 위하여 누에고치에 마그세이유 비누를 넣고 끓여 정련하였다. 실크피브로인 수용액을 얻기위하여, 정련하여 실크세리신이 제거된 정련솜을 염화칼슘-에탄올 수용액(염화 칼슘 : 에탄올 : 물 = 1 : 2 : 8 몰비율)으로 80℃에서 용해시키고 부직포와 탈지면을 이용하여 거른 뒤 염을 제거하기 위하여 셀룰로오스 투석막(MWCO = 12,000~14,000)으로 3일동안 증류수에 투석하여 실크 피브로인 수용액을 제조하였다.
- 여기에 연골 조직으로 분화하기위한 분화유도물질을 첨가한 분화배지를 2~3일 간격으로 교체해주며 3차원 배양 방법을 확립하였다.
- 연골세포의 분화를 유도하기위한 3차원 배양법을 확립하기 위하여 2차원 배양에서 세포수를 증가시킨 다음 16,000~25,000 cells/ml 정도의 세포들을 원심분리를 이용하여 pellet 을 만들었다. 연골 조직으로 분화하기위한 분화유도물질을 첨가한 분화배지를 2~3일 간격으로 교체해주며 3차원 배양을 실시하였다.
- 2006). 연골세포는 여러 passage에 걸쳐 배양하고 그 형태를 관찰하였다.
- Louis, MO) 0~200 µM의 농도로 첨가하여 10일 동안 연골세포의 성장과 증식정도를 관찰하였다. 연골세포의 분화를 유도하기위한 3차원 배양법을 확립하기 위하여 2차원 배양에서 세포수를 증가시킨 다음 16,000~25,000 cells/ml 정도의 세포들을 원심분리를 이용하여 pellet 을 만들었다. 연골 조직으로 분화하기위한 분화유도물질을 첨가한 분화배지를 2~3일 간격으로 교체해주며 3차원 배양을 실시하였다.
- 연골세포의 최적배양조건을 확립하기 위하여 10% FBS 가 함유된 DMEM, DMEM/F12, RPMI 등의 3종류의 배지를 이용하여 ascorbic acid의 농도를 달리하여 10일 동안 연골세포를 배양하고 증식 정도를 관찰하였다. 그 결과 DMEM배지에서 10% FBS와 200 µM의 ascorbic acid 가 첨가된 조건에서 가장 잘 증식하였으나 ascorbic acid 의 농도가 100 µM나 200 µM 사이의 유의차가 없었으므로, 100 µM ascorbic acid와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 최적 배양조건으로 선정하였다(Fig.
- 그 결과 우리가 분리한 연골세포는 10% FBS와 100 µM ascorbic acid 가 함유된 DMEM배지에서 가장 잘 생장하였다. 연골에 대한 실크의 영향을 관찰하기위해서, 실크 피브로인 용액을 제작하고 이를 멸균한것과 멸균하지 않은 것으로 구분하여 연골세포 배양 시 첨가하여 연골분화에 대한 마커인자인 제2형 콜라겐의 발현량을 측정하였다. 멸균하지 않은 실크 피브로인 첨가시 제2형 콜라겐의 발현량이 2.
- 본 연구는 실크단백질이 연골재생에 효과가 있는지를 확인하기위하여 수행되었다. 우리는 연골세포를 코뼈로부터 분리하고, 3종류의 배지 (DMEM, DMEM/F12, RPMI)와 서로 다른 농도의 ascorbic acid를 사용하여 최적 배양조건을 확립하였다. 그 결과 우리가 분리한 연골세포는 10% FBS와 100 µM ascorbic acid 가 함유된 DMEM배지에서 가장 잘 생장하였다.
- 제조된 실크 피브로인의 농도는약 1% 정도였으며, 연골세포의 2차원 배양과 3차원 배양시 모두 첨가하여 연골세포 특이적인 제2형 콜라겐과 제 10형 콜라겐의 유전자 발현량을 조사하였다. 제2형 콜라겐의 발현량을 조사하기위하여 실크 용액은 멸균한 것 (autoclaved silk)과 멸균하지 않은 것(non-autoclaved silk) 을 시료로 사용하여 3차원 배양하고 14일 후 세포를 회수하여 RNA를 얻었다. cDNA를 합성하고 GAPDH와 제 2형 콜라겐의 PCR을 수행하여 GAPDH의 발현량에 상대 적인 제2형 콜라겐의 발현량을 계산였다.
- 제조된 실크 피브로인용액을 이용하여 3차원 연골세포 배양 시 100 µg의 농도로 첨가하여 연골의 마커인자인 제 2형 콜라겐 유전자의 발현량을 PCR을 이용하여 실크 단백질이 연골 세포에 미치는 영향을 분석하였다.
- 정련된 실크정련솜을 염화칼슘-에탄올 수용액을 이용하여 용해시켜 실크 피브로인 단백질을 제조하였다. 제조된 실크 피브로인의 농도는약 1% 정도였으며, 연골세포의 2차원 배양과 3차원 배양시 모두 첨가하여 연골세포 특이적인 제2형 콜라겐과 제 10형 콜라겐의 유전자 발현량을 조사하였다. 제2형 콜라겐의 발현량을 조사하기위하여 실크 용액은 멸균한 것 (autoclaved silk)과 멸균하지 않은 것(non-autoclaved silk) 을 시료로 사용하여 3차원 배양하고 14일 후 세포를 회수하여 RNA를 얻었다.
- 연골세포는 분리와 배양은 상피세포와 달리 매우 복잡한 과정을 거친다. 코뼈로부터 연골 세포를 분리하고 세포배양접시에서 여러 세대에 걸쳐 배양하고 그 형태를 관찰하였다(Fig. 1). 연골세포의 성장속도는 상피세포와 달리 2배 이상 늦은 성장을 보였다.
대상 데이터
- 제조된 실크 피브로인용액을 이용하여 3차원 연골세포 배양 시 100 µg의 농도로 첨가하여 연골의 마커인자인 제 2형 콜라겐 유전자의 발현량을 PCR을 이용하여 실크 단백질이 연골 세포에 미치는 영향을 분석하였다. 시험을 위한 실크 용액은 멸균한 것(autoclaved silk)과 멸균하지 않은 것(non-autoclaved silk)을 시료로 사용하였다. 또한 연골세포 배양시 실크를 첨가하여 또다른 연골 마커인자인 제10형 콜라겐 유전자의 발현량을 PCR을 이용하여 분석하였다.
- 실크 단백질 중 피브로인만을 얻기위하여 세리신을 제거하기위한 정련을 실시하였다. 정련된 실크정련솜을 염화칼슘-에탄올 수용액을 이용하여 용해시켜 실크 피브로인 단백질을 제조하였다. 제조된 실크 피브로인의 농도는약 1% 정도였으며, 연골세포의 2차원 배양과 3차원 배양시 모두 첨가하여 연골세포 특이적인 제2형 콜라겐과 제 10형 콜라겐의 유전자 발현량을 조사하였다.
데이터처리
- PCR반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다. 얻어진 이미지는 Image J program을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 또한 연골세포 배양시 실크를 첨가하여 또다른 연골 마커인자인 제10형 콜라겐 유전자의 발현량을 PCR을 이용하여 분석하였다. 유전자의 발현수준을 분석하기 위하여 배양한 세포로부터 전체 RNA를 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 분리하였다. cDNA 합성과 PCR은 amfiRivert 1-step RT-PCR kit (GenDEPOT, USA)를 사용하여 수행하였다.
성능/효과
- cDNA를 합성하고 GAPDH와 제 2형 콜라겐의 PCR을 수행하여 GAPDH의 발현량에 상대 적인 제2형 콜라겐의 발현량을 계산였다. 그 결과 대조군에 비해 2.8배 정도 제2형 콜라겐의 발현을 증가 시켰으나, 멸균 후 연골세포에 첨가한 실크는 활성을 보이지 않 았다(Fig. 4). 멸균된 실크의 물리적 변화를 확인하기위하여 DSC와 FT-IR을 측정하였으나 특징적인 구조적 변화는 관찰되지 않았다(data not shown).
- 그 결과 우리가 분리한 연골세포는 10% FBS와 100 µM ascorbic acid 가 함유된 DMEM배지에서 가장 잘 생장하였다.
- 7배 증가하였으나, 멸균된 실크 피브로인의 첨가는 제2형 콜라겐의 발현량을 오히려 감소시켰다. 또한 실크 피브로 인은 제10형 콜라겐의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이 효과는 특히 연골세포를 3차원 배양할 때 더 컸다.
- 또한 제10형 콜라겐의 영향을 2차원 배양과 3차원 배양을 통하여 조사하였다. 제 2형 콜라겐과 마찬가지로 PCR을 통하여 분석하였으며, 그결과 2차원 배양에서는 대조군에 비하여 약 1.2배, 3차원 배양에서는 1.8배정도 그 발현량이 증가하는 것을 확인할수 있었다(Fig. 5). 제2형 콜라겐은 관절연골의 기질의 50~70%를 차지하고 있으며(Demoor et al.
- 즉 1 × 105 cell/plate로 세포 배양시, 배양접시에 세포가 가득찰 때까지 걸리는 기간이 상피세포는 3~4일 걸리는데 비해 연골세포는 10일 가까이 소요됐다(data not shown). 형태적인 변화는 4일째되어 세포가 부착되어 뻗어나기시작하였으며 7일째 군집을 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이 효과는 특히 연골세포를 3차원 배양할 때 더 컸다. 본 연구결과를 통하여 우리는 연골을 재생하는데 있어서 실크 단백질을 가능성을 보았으며, 향후 연구에서 연골재생과 실크의 관계를 좀 더 정밀하게 파악하고자 한다.
- 따라서본 연구에서 실크 피브로인 단백질이 제2형 콜라겐과 제 10형 콜라겐의 발현량을 증가시킬 수 있다는 것은 실크단백질이 연골재생에 효과적인 소재로서의 이용 가능성을 제시해 준다. 향후 연골재생과 관련된 실크 단백질의 효과를 좀 더 체계적으로 연구하고자 한다.
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