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문제 정의
- 본 연구에서는 Ultra nattokinase®을 1일 60 kg성인 최대 섭취용량인 66.7 mg 기준으로 4주간 경구투여에 의한 동물 모델 적용에 의해 혈행개선 효능 관한 연구를 진행 하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA)을 처리하여 5분간 경동맥에 올려놓아 혈전이 생기도록 혈관을 손상시켰다. 5분 동안 경동맥에 손상을 준 후, whatman paper를 제거하였으며, 손상 후 probe를 혈관에 재위치 하여, 혈류를 측정하였다 [13,14].
- 0 mL의 plasma를 분주하였다. ACL 기기 (ACL-100, Instrumentation Laboratory, Spain)를 사용하여, normal control plasma와 PT, aPPT reagent (Instrumentation Laboratory, Spain)를 이용하여 control clotting time을 측정 하였다. Sample plasma와 PT 또는 aPPT reagent를 반응시켜 PT (prothrombin time)와 aPPT (activated partial thromboplastin time) clotting time을 측정 하였다.
- Control group에는 maltodextrin 0.74 mg/kg (n = 16), nattokinase group은 Ultra nattokinase® 1.11 mg/kg (n = 16)을 4주 동안 식이 하였다 (Table 1).
- Nattokinase의 fibrin 분해 활성을 확인하기 위한 in vitro실험은 Jang 등 [15]과 Astrup 등 [16]의 방법을 변형하여 확인하였다. 100 mm dish에 50 unit/mL의 thrombin (Hyphen biomed, Neuville sur-oise, France)을 200 uL 떨어트린 후, 0.
- 5 mL tube로 옮긴 후 12,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 PRP와 PPP로 분리시킨다. PPP만 회수하여 1.5 mL tube에 옮기고 Aggregometer (Whole blood aggregometer, Chronolog, Havertown, PA, USA)를 이용하여 platelet aggregation assay를 진행 하였다. PPP는 platelet aggregation assay의 negative control로 사용하였다.
- PPP는 platelet aggregation assay의 negative control로 사용하였다. PRP는 test sample로 ADP (Chrono-log, Havertown, PA, USA) 10 uL를 넣어서 platelet aggregation 정도를 확인하였다.
- ACL 기기 (ACL-100, Instrumentation Laboratory, Spain)를 사용하여, normal control plasma와 PT, aPPT reagent (Instrumentation Laboratory, Spain)를 이용하여 control clotting time을 측정 하였다. Sample plasma와 PT 또는 aPPT reagent를 반응시켜 PT (prothrombin time)와 aPPT (activated partial thromboplastin time) clotting time을 측정 하였다.
- Thrombin과 fibrinogen solution이 섞이게 흔들어 준 후 plate를 30분간 실온에 1시간 방치 후 plate가 굳어 fibrin plate가 만들어진 것을 확인하고 tPA (Actylase®, Boeringer Ingelheim Pharma GmbH & Co, Germany), Ultra nattokinase®를 농도별로 20 uL를 plate에 떨어트려 37℃에 4시간 정치시킨 후 plate에서의 fibrin의 용해능을 확인 하였다.
- Ultra nattokinase®가 blood coagulation cascade에 미치는 영향을 확인하기 위해서 PT, aPPT를 측정하였다.
- Ultra nattokinase®가 tPA 처럼 fibrin을 lysis 시키는지 확인하기 위하여, tPA 2 unit/mL와 성인 평균 섭취 기준 66.7 mg/day를 기준으로 Ultra nattokinase®를 0.5 % fibrin plate에 처리하여 fibrinolytic activity를 확인하였다.
- Ultra nattokinase®가 생체내 혈전 생성을 억제하는지 확인하기 위하여 arterial thrombosis model을 제작하여 혈관의 폐색 시간을 측정 하였다.
- Ultra nattokinase®가 혈행개선효능이 있는지 확인하기 위해 Ultra nattokinase®를 성인 섭취량 기준 (66.7 mg/day)에 맞춰 rat에 4주간 섭취 시킨 후 arterial thrombosis model, platelet aggregation assay, blood coagulation assay 및 fibrinolytic activity test를 하였다.
- Ultra nattokinase®의 혈전억제 기작을 확인하기 위해 platelet aggregation assay를 하였다.
- 실험에 이용된 Sprague Dawley (SD) rat은 5주령의 수컷 42 (입수시)/40수 (투여시)로 하였으며 체중은 176 ± 6 g의 선별군으로 진행하였다. 검역과 순화는 일주일간 매일 1회 일반증상 관찰을 실시하였으며, 반입 및 검역과 순화기간 종료 시 체중을 측정하여 시험 실시에 적합한 건강한 동물을 선발하였다.
- 동물 사육 환경은 온도는 22~24℃, 명암주기는 12시간 Light/12 h dark로 하였으며, 조도는 150~300 lux, 습도는 30~50%, 환기 횟수는 10~15회/시간으로 하였고 사육상자와 밀도는 폴리설폰 사육상자 (260 W × 350 L × 210 H, mm)에 3마리의 평가 동물을 사육하였다 (Fig. 1).
- 가 blood coagulation cascade에 미치는 영향을 확인하기 위해서 PT, aPPT를 측정하였다. 먼저 응고 인자 Factor Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ에 영향을 받는 extrinsic pathway를 확인하기 위하여 PT를 측정 하였다. 측정 결과 control은 17 ± 0.
- 을 이용한 carotid arterial thrombosis model을 유도하였다 [13,14]. 섭취 전후의 효능 확인은 대조군에 대한 시료물질 투여군간의 혈관 폐색 차이로 검증하였다.
- 11 mg/kg (n = 16)을 4주 동안 식이 하였다 (Table 1). 시험 물질의 제조는 시료를 1차 멸균 증류수에 용해하여 Sonde를 이용하여 6일/주을 투여하였고 총 4주간 24일을 경구 투여 하였다. 동물 사육 환경은 온도는 22~24℃, 명암주기는 12시간 Light/12 h dark로 하였으며, 조도는 150~300 lux, 습도는 30~50%, 환기 횟수는 10~15회/시간으로 하였고 사육상자와 밀도는 폴리설폰 사육상자 (260 W × 350 L × 210 H, mm)에 3마리의 평가 동물을 사육하였다 (Fig.
- 시험군 분리 및 잔여 동물의 처리는 검역, 순환 기간 종료 시 체중 증가량에 이상이 없는 개체를 선별하였으며, 체중을 맞춘 후 군 분리 하였으며, 군 평균 및 표준편차를 계산하여 군간 균등하게 동물을 배치하였다. 평가 진행 전 잔여 동물 2마리는 CO2를 이용하여 안락사 하였다.
- 실험군의 마취는 Zoletille® (Virbac, France) 30 mg/kg, Rompun® (바이엘 코리아, 한국) 10 mg/kg로 혼합하여 ip (intraperitoneal) injection 하였다.
- 혈류량을 확인하기 위하여, 혈류측정 probe (Transonic Flowprobe®, Transonic systems Inc., Ithaca, NY, USA)를 노출된 경동맥 중간 부위에 위치하여, 10분간 Flowmeter (TS420, Transonic systems Inc., Ithaca, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 1). 사료는 실험동물 고형사료는 Harlan Laboratory Inc. (Indianapolis, Indiana, USA)의 18% 단백질 조성의 사료를 공급하였으며 음수는 0.1 um 필터와 유수살균기를 이용하여 여과 및 살균된 정제수를 고압증기 멸균한 후 급수하였다. 급수는 정제멸균수를 자유 섭취 하였다.
- 실험에 사용할 제품은 Ultra nattokinase® 제조 공정에 준해 여과 농축한 동결 건조물을 이용하였으며 nattokinase는 Anson법 [12]을 이용하여 효소 역가를 측정하였으며 혈전 용해 활성이 20,000 FU/g인 Ultra nattokinase® (KPX Bio-Tech Co., LTD)를 제조하였다.
- 실험에 이용된 Sprague Dawley (SD) rat은 5주령의 수컷 42 (입수시)/40수 (투여시)로 하였으며 체중은 176 ± 6 g의 선별군으로 진행하였다.
- 시험군 분리 및 잔여 동물의 처리는 검역, 순환 기간 종료 시 체중 증가량에 이상이 없는 개체를 선별하였으며, 체중을 맞춘 후 군 분리 하였으며, 군 평균 및 표준편차를 계산하여 군간 균등하게 동물을 배치하였다. 평가 진행 전 잔여 동물 2마리는 CO2를 이용하여 안락사 하였다. 실험군의 마취는 Zoletille® (Virbac, France) 30 mg/kg, Rompun® (바이엘 코리아, 한국) 10 mg/kg로 혼합하여 ip (intraperitoneal) injection 하였다.
데이터처리
- Thrombotic occlusion time was presented as the mean ± SD and any difference was determined by one-way ANOVA (p < 0.05).
- 이 결과는 대조군인 maltodextrin 섭취군과 시험군인 Ultra nattokinase® 섭취군 간의 평균과 표준편차를 산출하여 비교하였다.
- 통계학적 방법은 일원배치 분산분석 (One-way ANOVA test)을 통하여 군간 유의성을 확인하였으며 결과는 mean ± SD (standard deviation)으로 표시 하였다.
성능/효과
- Platelet은 agonist인 thrombin, ADP, collagen 등에 의하여 자극을 받으면 활성화 되어 응집 반응이 일어나는데, control group과 Ultra nattokinase®를 4주간 섭취한 rat의 platelet aggregation 정도를 확인 한 결과, control은 46 ± 5%, Ultra nattokinase®은 48 ± 3%의 결과를 나타냈다.
- Ultra nattokinase®가 platelet aggregation 및 aPPT, PT에 영향을 미치지 않을 것을 보아 Ultra nattokinase®가 platelet 응고 과정 및 blood coagulation cascade에는 관여 하지 않고, fibrin을 직접적으로 용해시켜 혈행개선 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
- 그 결과 Ultra nattokinase®가 혈관폐색 시간을 대략 2배 정도 증가 시킨 반면, platelet aggregation 및 aPPT, PT에는 영향을 미치지 않았다.
- 그 결과, tPA와 Ultra nattokinase®는 fibrinolytic activity 반응을 보였다 (Fig. 5).
- 위 실험 결과에 의하면 Ultra nattokinase®가 fibrin을 직접적으로 분해하는 것으로 확인되었으며, 이는 Ultra nattokinase®가 fibrin을 분해하여 혈행을 개선시키는 것을 의미한다.
- 이 결과를 통하여 Ultra nattokinase®는 항혈전 효과와 피브린 용해 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었으며, Ultra nattokinase®를 섭취할 경우 fibrin clot에 의한 혈관 폐쇄가 진행 되는 것을 예방 하거나, 또는 완전한 혈관 폐쇄 진행이 되는 것을 지연 시켜 줄 것으로 예상 된다.
후속연구
- 이상의 결과를 바탕으로 Ultra nattokinase®는 의약품으로 사용되고 있는 tPA나 urokinase와 같이 혈관의 기저세포의 손상으로 인한 염증 유발 등에 대한 부작용에 대한 보고가 없고, 오랫동안 식품으로 섭취되어 왔던 장점과 생체친화적인 특성 및 전통적인 방법에 의한 손쉽고 저렴한 제조 공정에 의한 상품화의 용이성으로 인해 더욱 그 효용성과 안전성이 부각되고 있어 [4,23] 식품 및 의약품으로의 적용 가능성이 더욱 확대 될 것으로 판단되며 Ultra nattokinase®가 혈전 생성 예방이나 억제 및 제거를 위한 건강보조식품으로 활용 가능성이 높은 것으로 확인되었다.
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