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문제 정의
- 농약 이화학시험 기관의 수행능력 평가체계 확립을 위한 사례연구(case study)로 농촌진흥청의 협조로 숙련도시험을 수행하였다. 숙련도시험에 참여한 33개 기관의 분석 결과는 우선 Grubbs test에 의하여 95% 신뢰구간에서 이상값을 확인한 후 z값 산출시 제외시켰다.
- 본 연구에서는 국내 농약이화학시험 분석기관의 수행능력 평가를 위한 숙련도 시험을 농약제품에 대한 분석법 검증 절차를 거쳐 안정성 및 균질성을 확보한 미지시료를 배포하여 실시하였으며, 숙련도시험에 참여한 분석기관으로부터 제출된 해당제품에 대한 결과값을 적절한 통계적 방법에 따라 평가하여 제안된 숙련도시험 지침서(안)의 국내 농약 이화학시험 분석기관의 적용가능성을 확인하고자 한다.
가설 설정
- b)Relative standard deviation.
제안 방법
- 균질성은 숙련도시험을 위하여 조제한 시료를 5반복으로 채취한 각각의 시료를 2반복으로 시험을 수행하여 총 10개의 시험결과로부터 우선 Cochran’s test를 수행하여 이상치(outlier)를 확인한 후 F-검정에 의한 분석시료들의 허용편차 기준값을 산출하고 시료들의 분석결과 편차가 기준값 이내인 것을 확인하였다(Thompson, 2000; Thompson et al., 2006, IAEA, 2009).
- 농약 이화학시험 분석법 검증 절차(안)에 따른 분석법 검증을 통하여 시험농약 2종에 대한 특이성, 선택성, 직선성, 정밀성 및 정확성 확인 시험을 수행하였다. 분석법 검증을 위한 emamectin benzoate 및 lufenuron 저장표준용액은 각각 1,000 mg/L 및 2,000 mg/L 농도로 methanol에 용해시킨 내부표준물질 0.
- 숙련도시험을 위한 시료는 emamectin benzoate 2.15% 유제 및 lufenuron 5% 유제를 methanol로 각각 0.53% 및 2.0%로 희석하여 조제한 후, 농약공정 분석법에 따라 주성분을 기준으로 분석용 시료용액을 조제하였다. 제품시료의 안정성은 실온에서 시료 조제 직후 0일차 시료(Control) 및 조제 후 14일이 경과한 시료(Experimental)를 5반복으로 시험을 수행하였다.
- 시험약제 2종에 대한 분석법 검증 및 숙련도시험 수행을 위한 기기분석은 Agilent 1200 series HPLC-DAD로 수행하였다(Table 2).
- 0%로 희석하여 조제한 후, 농약공정 분석법에 따라 주성분을 기준으로 분석용 시료용액을 조제하였다. 제품시료의 안정성은 실온에서 시료 조제 직후 0일차 시료(Control) 및 조제 후 14일이 경과한 시료(Experimental)를 5반복으로 시험을 수행하였다. 안정성은 시험결과로부터 초기농도와의 차이(식 2)가 오차범위 10% 기준값(0.
- 38% DNAP 용액을 이용하여 조제하였다. 특이성 및 선택성시험은 저장표준용액을 각각의 내부표준물질 용액으로 희석하여 조제한 emamectin benzoate는 750 mg/L, lufenuron은 300 mg/L 표준용액과 농약공정분석법과 동일하게 주성분 함량을 기준으로 조제한 emamectin benzoate 750 mg/L, lufenuron 333 mg/L 제품시료 용액의 기기분석 크로마토그램의 signal 및 spectrum을 확인하였다. 표준검량선의 직선성은 각각의 저장표준용액을 단계별로 희석하여 농약공정분석법상의 제품시료 중 분석물질 이론농도의 ± 20% 범위로 emamectin benzoate 표준용액은 650, 700, 750, 800, 850 mg/L 농도로, lufenuron은 200, 250, 300, 350, 400 mg/L 농도로 조제한 후 기기분석 크로마토그램의 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적비를 기준으로 표준검량선을 작성하여 확인하였다.
- 표준검량선의 직선성은 각각의 저장표준용액을 단계별로 희석하여 농약공정분석법상의 제품시료 중 분석물질 이론농도의 ± 20% 범위로 emamectin benzoate 표준용액은 650, 700, 750, 800, 850 mg/L 농도로, lufenuron은 200, 250, 300, 350, 400 mg/L 농도로 조제한 후 기기분석 크로마토그램의 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적비를 기준으로 표준검량선을 작성하여 확인하였다.
대상 데이터
- 7%, Jiangsu Flag Chemical)은 국립농업과학원에서 분양받아 배포하였다. 내부표준물질인 diallyl phthalate(DAP, %), di-n-amyl phthalate(DNAP, %) 및 기타 시약은 분석등급 이상을 사용하였으며, methanol, acetoniltrile 등의 유기용매는 HPLC 등급으로 Merck에서 구입하여 사용하였다.
- 대상농약 2종은 원예용 살충제 중 유제에서 생산 및 출하액에서 상위권을 차지하고 있는 emamectin benzoate와 lufenuron을 선정하였다. 숙련도 시험을 위한 시험약제는 emamectin benzoate 2.
- 농약 이화학시험 분석법 검증 절차(안)에 따른 분석법 검증을 통하여 시험농약 2종에 대한 특이성, 선택성, 직선성, 정밀성 및 정확성 확인 시험을 수행하였다. 분석법 검증을 위한 emamectin benzoate 및 lufenuron 저장표준용액은 각각 1,000 mg/L 및 2,000 mg/L 농도로 methanol에 용해시킨 내부표준물질 0.045% DAP 및 0.38% DNAP 용액을 이용하여 조제하였다. 특이성 및 선택성시험은 저장표준용액을 각각의 내부표준물질 용액으로 희석하여 조제한 emamectin benzoate는 750 mg/L, lufenuron은 300 mg/L 표준용액과 농약공정분석법과 동일하게 주성분 함량을 기준으로 조제한 emamectin benzoate 750 mg/L, lufenuron 333 mg/L 제품시료 용액의 기기분석 크로마토그램의 signal 및 spectrum을 확인하였다.
- 15% 유제(에이팜, 신젠타), lufenuron 5% 유제(파밤탄, 영일케미칼)를 사용하였다. 분석법 검증을 위한 표준물질은 emamectin benzoate(99.4%), lufenuron(99.7%) 분석용 표준품을 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였고, 숙련도시험을 위한 표준물질은 emamectin benzoate(90%, Qingdao KYX Chemical), lufenuron(99.7%, Jiangsu Flag Chemical)은 국립농업과학원에서 분양받아 배포하였다. 내부표준물질인 diallyl phthalate(DAP, %), di-n-amyl phthalate(DNAP, %) 및 기타 시약은 분석등급 이상을 사용하였으며, methanol, acetoniltrile 등의 유기용매는 HPLC 등급으로 Merck에서 구입하여 사용하였다.
- 숙련도 시험을 위한 대상 농약 및 제품을 선정하기 위하여 용도별 및 제형별 농약 생산 및 출하량 등을 2009년도 농약연보 자료를 검토한 결과, 용도는 생산량의 25% 및 출하량의 30% 이상을 차지하는 원예용 살충제로 선정하였으며, 제형은 45% 이상인 유제로 선정하였다(Fig. 1, Table 1).
- 대상농약 2종은 원예용 살충제 중 유제에서 생산 및 출하액에서 상위권을 차지하고 있는 emamectin benzoate와 lufenuron을 선정하였다. 숙련도 시험을 위한 시험약제는 emamectin benzoate 2.15% 유제(에이팜, 신젠타), lufenuron 5% 유제(파밤탄, 영일케미칼)를 사용하였다. 분석법 검증을 위한 표준물질은 emamectin benzoate(99.
- 안정성 및 균질성이 확보된 emaectin benzoate 0.53% 및 lufenuron 2.0% 유제 제품시료에 대한 숙련도 시험은 농약이화학시험기관으로 등록된 기관 중 40개 기관에 시료를 배포하여 33개 기관이 참여하였다. 숙련도시험에 의한 각 기관의 수행능력 평가는 참여기관에서 제출한 결과보고서를 근거로 하여 아래의 식에 따라 개별 참여기관의 평균 결과값(X), 기준이 되는 설정값(Xa) 및 목표표준편차(δp)를 이용하여 전환된 Z값을 평가기준에 따라 적용하였다(Table 3, Thompson, 2000).
데이터처리
- 숙련도시험에 의한 각 기관의 수행능력 평가는 참여기관에서 제출한 결과보고서를 근거로 하여 아래의 식에 따라 개별 참여기관의 평균 결과값(X), 기준이 되는 설정값(Xa) 및 목표표준편차(δp)를 이용하여 전환된 Z값을 평가기준에 따라 적용하였다(Table 3, Thompson, 2000).
- 숙련도시험에 참여한 33개 기관의 분석 결과는 우선 Grubbs test에 의하여 95% 신뢰구간에서 이상값을 확인한 후 z값 산출시 제외시켰다. 참여기관의 수행능력 평가를 위한 z값은 전체 참여기관의 측정 평균값을 기준이 되는 설정값으로 선정하고, Horwitz equation을 적용하여 산출된 목표표준편차를 기준으로 설정하여 각각의 참여기관에서 제출한 평균 결과값으로부터 산출하였다(IAEA, 2009; Thompson et al., 2006).
성능/효과
- z값에 의한 숙련도시험 평가를 수행하기 위하여 설정값은 emamectin benzoate 및 lufenuron에 대하여 각각 참여기관 측0.60% 및 2.15%, 목표표준편차는 각각 0.03 및 0.08이었으며, 참여기관들이 제출한 측정 결과값의 정확성 및 분산정도를 바탕으로 z값을 산출한 후 평가기준에 적용한 결과, emamectin benzoate는 참여기관 총 33개 중 이상값은 2개 기관(6.0%), z값이 3.0이상인 부적합은 2개 기관(6.0%) 및 z값이 2.0 < |Z| < 3.0인 검토대상은 3기관(9.0%)이었고, lufenuron은 z값이 2.0 < |Z| < 3.0인 검토대상 3개 기관(9.0%)이었다(Fig. 5.).
- 2006). 국내 농약 이화학시험 분석기관을 대상으로 수행한 숙련도 시험결과, 90% 이상의 기관들이 적합범위에 포함되었으며, 분석방법 및 크로마토그램 등의 분석결과 생산자료 및 결과계산 등에 대한 과정이 전반적으로 양호한 것으로 확인되었다.
- 표준검량선의 직선성은 각각의 저장표준용액을 단계별로 희석하여 농약공정분석법상의 제품시료 중 분석물질 이론농도의 ± 20% 범위로 emamectin benzoate 표준용액은 650, 700, 750, 800, 850 mg/L 농도로, lufenuron은 200, 250, 300, 350, 400 mg/L 농도로 조제한 후 기기분석 크로마토그램의 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적비를 기준으로 표준검량선을 작성하여 확인하였다. 분석법의 정밀성 및 정확성은 숙련도시험을 위하여 emamectin benzoate 0.53% 및 lufenuron 2% 함량으로 제품시료를 조제한 후 5반복으로 채취하여 기기분석을 수행하였으며, 정밀성은 분석결과로부터 %상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 산출한 후 아래와 같은 Horwitz equation에 적용하여 산출된 허용값 이내임을 확인하였고, 정확성은 평균 회수율 및 95% 신뢰구간을 산출하여 확인하였다(Thompson et al., 2004; CIPAC, 2011).
- 숙련도 시험을 위하여 시험약제의 제품시료에 대한 실온에서의 14일 안정성시험을 수행한 결과, emamectin benzoate 및 lufenuron 시료 조제직후인 0일과 14일 후 분석측정값의 차이가 각각 0.002 및 0.007로 오차 10%이내 범위의 기준값(0.1δp)인 0.005 및 0.021보다 적은 값으로 14일 실온안정성을 확인하였다(Table 6).
- 숙련도시험 배포시료의 균질성은 각각의 농약제품에서 무작위로 채취한 emamectin benzoate 및 lufenuron 시료의 분석결과에 대한 Cochran’s test를 수행하여 산출된 값은 각각 0.39 및 0.66이었으며, 95% 신뢰수준의 기준값인 0.84 이내로 이상치가 없음을 확인한 후, emamectin benzoate 및 lufenuron 시료의 분석결과 편차에 의하여 산출된 값은 각각 −0.000003 및 0.000025로, F-검정에 의하여 산출된 허용 기준값인 0.000173 및 0.001237 이내로 숙련도시험 배포시료가 충분히 균질한 것을 확인하였다(Table 7).
- 농약 이화학시험 기관의 수행능력 평가체계 확립을 위한 사례연구(case study)로 농촌진흥청의 협조로 숙련도시험을 수행하였다. 숙련도시험에 참여한 33개 기관의 분석 결과는 우선 Grubbs test에 의하여 95% 신뢰구간에서 이상값을 확인한 후 z값 산출시 제외시켰다. 참여기관의 수행능력 평가를 위한 z값은 전체 참여기관의 측정 평균값을 기준이 되는 설정값으로 선정하고, Horwitz equation을 적용하여 산출된 목표표준편차를 기준으로 설정하여 각각의 참여기관에서 제출한 평균 결과값으로부터 산출하였다(IAEA, 2009; Thompson et al.
- 전체 참여기관에서 제출한 측정값에서 Grubbs test에 의한 통계검정으로 emamectin benzoate는 2개 기관(6.0%)이 이상값으로 판정되어 제외시켰으며, lufenuron는 이상값이 없는 것으로 확인되었다. z값에 의한 숙련도시험 평가를 수행하기 위하여 설정값은 emamectin benzoate 및 lufenuron에 대하여 각각 참여기관 측0.
- 정량분석을 위한 표준검량성의 직선성은 분석물질의 이론농도의 ± 20%내에서 표준용액 5개 농도를 선정하여 각 농도별로 2반복으로 분석한 결과, emamectin benzoate 및 lufenuron에 대한 표준검량선의 회귀 방정식은 각각 Y = 1.3955x + 0.0802(R = 0.9952), Y = 1.2269x − 0.0555(R =0.9994)였으며, 이때 상관계수(R)가 0.99이상으로 직선성이 양호하였다.
- 정밀성은 제품시료의 기기분석 결과값에 대한 %상대표준편차를 도출한 후 시료 내 분석 물질의 농도를 Horwitz equation에 적용하여 산출된 허용범위와 비교한 결과, emamectin benzoate의 표준용액 및 시료의 %상대표준편차는 각각 1.17, 0.89%로 Horwitz equation에 의한 기준인 1.34, 2.95 이내였으며, lufenuron의 표준용액 및 시료의 %상대표준편차는 각각 0.01, 1.62로 허용범위인 1.34, 2.41 이내로 분석법에 대한 재현성을 확인하였다(Table 4).
- 정확성은 적용 분석법에서 측정값이 이론값인 참값에 근접한 정도를 평가하기 위하여 측정값의 평균 및 표준편차를 이용한 95% 신뢰구간을 산출하였으며, emamectin benzoate 및 lufenuron에 대한 평균%회수율은 각각 102.9% 및 97.7%로 주성분 함량이 1% 미만 시료의 허용기준인 95~105% 이내였다(Table 5).
- 특이성 및 선택성은 시험약제의 표준용액 및 제품시료에 대한 HPLC 분석 chromatogram상의 signal 및 spectrum으로부터 검출된 signal이 시험약제의 분석물질인 것을 확인하였으며, 제품시료의 불순물 등의 간섭물질로부터 시험약제의 분석물질이 선택적으로 분리되는 것을 확인하였다(Fig. 2, 3).
후속연구
- 결론적으로, 농약이화학시험 분석기관의 수행능력 향상 및 품질보증을 위한 정도관리 체계마련은 다양한 제형 및 시험약제에 대하여 지속적인 숙련도시험 사례연구를 통하여 단계적으로 숙련도 시험방법을 체계화하는 것이 선행되어야 한다.
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