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문제 정의
- 다양한 기능을 가진 토착미생물을 분리·동정 후 퇴비화에 적용하여 우수한 기능성을 가진 발효퇴비를 제조하고자 하였다.
- 이와 같이 기능성을 가진 미생물을 활용한다면 난분해성 부산물의 퇴비화가 가능하고 또는 가축분으로 인한 환경오염을 감소시킬 수 있는 계기가 될 것이다. 따라서 본 연구에서는 퇴비화를 기능적으로 촉진시키거나 또는 다기능적인 역할을 할 수 있는 토착미생물을 활용하여 현재의 퇴비화 속도보다 향상되고 기능성이 뛰어난 발효퇴비를 제조하고자 하였다.
제안 방법
- , 2010). Auxin 생산시험은 세균을 stationary phase까지 배양한 다음 배양액을 10,000 g에서 원심분리하여 균주를 침강시킨 후 상등액을 5 mL를 Salkowski reagent 10 ml에 반응시킨 후 30분간 방치한 다음 535 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Frankenberger and Bruner, 1983). HPLC 분석은 revers-phase에서 수행하였고, 분석 여건은 검출기 254 nm, 컬럼 Hypersil- ODS (C18), 이동상 CH3OH/H2O (60:40, acidified to pH 3.
- Auxin 생산시험은 세균을 stationary phase까지 배양한 다음 배양액을 10,000 g에서 원심분리하여 균주를 침강시킨 후 상등액을 5 mL를 Salkowski reagent 10 ml에 반응시킨 후 30분간 방치한 다음 535 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Frankenberger and Bruner, 1983). HPLC 분석은 revers-phase에서 수행하였고, 분석 여건은 검출기 254 nm, 컬럼 Hypersil- ODS (C18), 이동상 CH3OH/H2O (60:40, acidified to pH 3.5 with H3PO4), 유량속도는 1 mL min-1이었다. 효소액의 식물 생육촉진 효과로는 분리균주가 생산하는 효소를 콩에 처리하고 콩의 생육촉진 효과를 검정하기 위하여 표면 살균하고 petri-dish에 각 10개의 종자를 치상하였다.
- Protease 분비능은 2% skim milk를 첨가한 NA배지에 균주를 접종하여 35℃에서 48시간 배양하고 집락 주위의 clear zone을 관찰하였다 (Kunitz, 1947). Lipase 분비능은 1% tributyrin을 첨가한 NA배지에 균주를 접종하고 35℃에서 48시간 배양한 후 균 주위의 clear zone을 관찰하였다 (Oh et al., 2010). Auxin 생산시험은 세균을 stationary phase까지 배양한 다음 배양액을 10,000 g에서 원심분리하여 균주를 침강시킨 후 상등액을 5 mL를 Salkowski reagent 10 ml에 반응시킨 후 30분간 방치한 다음 535 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Frankenberger and Bruner, 1983).
- coli numbering 1492-1510; 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′) primer를 사용하였다 (Lane, 1991). Temperature cycling은 GenAmpTM PCR System 9700 (Applied Biosystem)을 이용하여 predenaturation 과정을 94℃에서 3분간 수행하고, denature (94℃, 30초), annealing (50℃, 30초), elongation (72℃, 40초) 반응을 총 30회 반복하고 post-elongation (72℃, 10분)을 수행하였다. 유전자 서열분석용 primer는 800R, 518F 및 1055F를 사용하며, 염기서열 분석은 capillary 방식의 ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem)을 사용하였다.
- 균주의 동정 분리균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 bacteria에 특이적으로 부착하는 27F (E.
- 이때 미리 배양해둔 분리균을 원심분리하여 상층액을 적당히 희석하여 petri-dish에 접종한 다음 25℃ 암실에서 18시간 방치한 다음 6시간마다 발아율을 측정하였다. 그리고 포트시험에서는 살균된 콩 종자를 트레이에서 키워 이식시킨 후 분리미생물을 1x106 CFU mL-1 이상이 되도록 접종하여 유리온실 내에서 75%의 습도, 온도 25℃를 유지 시켜주었으며, 흐린 날은 나트륨등을 켜주었다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 처리하였고, 균주 접종 후 30일째에 대두를 수확하여 생육특성을 조사하였다.
- 분리배지로는 방선균은 starch-casein 한천배지 (Kuster and williams, 1966), 효모균은 YM배지 (yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5g, dextrose 10%)를, 유산균배지로는 MRS (Latobacillus MRS broth, Difco)로 사용하여 분리하였다. 내열성 Bacillus균의 분리배지는 PBY (1.0% polypeptone, 0.5% beef extract, 0.2% NaCl, 0.05% yeast extract) 배지를 기본으로 설탕을 첨가하였으며, 일반적인 분리배지는 LB배지 (tryptone 10%, yeast extract 5%, sodium chloride 10%)를 사용하였다. 배양 온도는 22-55℃에서 24시간 동안 BOD 배양기에서 배양하였다.
- 토양미생물의 분리 토착미생물의 분리는 2010년 2-12월까지 전국 6개 도의 17개 시‧ 군에서 513점의 토양시료를 채취하여 확보하였다 (Table 1). 또한 천연배지인 고두밥과 미강 및 비지에 흑설탕을 1:1로 섞어 망사에 넣은 다음 대나무와 낙엽수림 밑에서 부엽토로 덮어 7일간 방치한 후 세균, 방선균, 유산균을 추가로 분리하였다. 분리배지로는 방선균은 starch-casein 한천배지 (Kuster and williams, 1966), 효모균은 YM배지 (yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5g, dextrose 10%)를, 유산균배지로는 MRS (Latobacillus MRS broth, Difco)로 사용하여 분리하였다.
- 분리균주의 효소활성 분리된 균주의 활성정도를 확인하기 위해 섬유소, 키틴, 전분, 고분자, 단백질 분해효소의 분해능을 확인하였다. 실험방법으로 섬유소 분해균은 CMCase의 활성도는 DNS방법 (Miller, 1959; Lee et al.
- 또한 천연배지인 고두밥과 미강 및 비지에 흑설탕을 1:1로 섞어 망사에 넣은 다음 대나무와 낙엽수림 밑에서 부엽토로 덮어 7일간 방치한 후 세균, 방선균, 유산균을 추가로 분리하였다. 분리배지로는 방선균은 starch-casein 한천배지 (Kuster and williams, 1966), 효모균은 YM배지 (yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5g, dextrose 10%)를, 유산균배지로는 MRS (Latobacillus MRS broth, Difco)로 사용하여 분리하였다. 내열성 Bacillus균의 분리배지는 PBY (1.
- )로 분석하였다. 분석조건으로는 검출기는 FFAP, 컬럼의 온도와 유출량은 각각 10-150℃와 45 ml min-1였고, 이동상은 N2가스로 분석하였다.
- 그리고 포트시험에서는 살균된 콩 종자를 트레이에서 키워 이식시킨 후 분리미생물을 1x106 CFU mL-1 이상이 되도록 접종하여 유리온실 내에서 75%의 습도, 온도 25℃를 유지 시켜주었으며, 흐린 날은 나트륨등을 켜주었다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 처리하였고, 균주 접종 후 30일째에 대두를 수확하여 생육특성을 조사하였다.
- 식물보호제 분해 및 중금속 경감시험 분리된 균주를 함유한 퇴비를 토양 및 축사에 넣고 농약의 분해정도 및 중금속의 경감정도를 조사하였다. 사용된 농약은 Procymidone, Fluquinconazole, Isoprothiolane이였으며, 가스크로마토그래프 (GC, 2010 plus, Sumadzu)를 이용하여 분석하였다.
- 암모니아 가스와 휘발성 지방산 함량변화 퇴비화 과정내 암모니아 (NH3)와 황화수소 (H2S) 악취가스의 농도를 측정하기 위하여 1차 발효가 끝날 것으로 예상되는 30일 이후에 미생물제제를 처리하고 10일 간격으로 시료를 채취하였다. 암모니아와 황화수소 가스는 시료 200 g에 1 L 부피의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 24시간 발효시킨 후, 실온에서 30일 동안 보관하면서 Gas analyser (GA2000, Geotechnical instruments, UK)와 Gastec (Gastec, Japan)으로 측정하였다.
- S) 악취가스의 농도를 측정하기 위하여 1차 발효가 끝날 것으로 예상되는 30일 이후에 미생물제제를 처리하고 10일 간격으로 시료를 채취하였다. 암모니아와 황화수소 가스는 시료 200 g에 1 L 부피의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 24시간 발효시킨 후, 실온에서 30일 동안 보관하면서 Gas analyser (GA2000, Geotechnical instruments, UK)와 Gastec (Gastec, Japan)으로 측정하였다. 휘발성 지방산은 퇴비를 5 L짜리 배양병에 담고 가스채취용 마개를 닫는 후 12-36시간 방치한 다음 propionic acid과 butyric acid의 함량을 가스크로마토그라피 (GC, 2010plus, Sumadzu Co.
- 효소액의 식물 생육촉진 효과로는 분리균주가 생산하는 효소를 콩에 처리하고 콩의 생육촉진 효과를 검정하기 위하여 표면 살균하고 petri-dish에 각 10개의 종자를 치상하였다. 이때 미리 배양해둔 분리균을 원심분리하여 상층액을 적당히 희석하여 petri-dish에 접종한 다음 25℃ 암실에서 18시간 방치한 다음 6시간마다 발아율을 측정하였다. 그리고 포트시험에서는 살균된 콩 종자를 트레이에서 키워 이식시킨 후 분리미생물을 1x106 CFU mL-1 이상이 되도록 접종하여 유리온실 내에서 75%의 습도, 온도 25℃를 유지 시켜주었으며, 흐린 날은 나트륨등을 켜주었다.
- 0×106 CFU mL-1 이상으로 제조하여 사용하였다. 처리구는 미생물 특성별 및 효소생성량을 기준으로 3개의 처리구를 디자인하였다. B1처리구의 미생물의 종류는 B.
- , 1993). 키틴 분해균은 colloidal chitin을 기질로 하여 assay를 수행하였으며, 표준물질은 N-acetyl-D-glucosamine (NAG, Sigma A8625)를 이용하여 측정하였다 (Kim et al., 2010). 효소의 활성도 1 unit는 colloidal chitin을 기질로 하여 최적온도 조건 하에서 1분 동안에 1 umol의 NAG에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
- 퇴비의 제조 돈분 (SM), 계분 (PM), 폐버섯배지 (MW)를 각각 45, 15, 30%의 비율로 혼합하고, 섬유소, 전분, 단백질, 지방 분해능이 우수한 미생물을 분리된 미생물이 함유된 생균제 10%를 첨가하여 퇴비화를 유도하였다. 생균제는 비지, 미강, 당밀이 함유된 배양배지로 미생물의 함량은 1.
- 채취된 공시퇴비 시료의 화학성 분석은 농촌진흥청 표준분석법(NIAST, 2000)에 준하여 실시하였으며, 시험전과 후의 분석시료는 음건한 다음 2 mm체를 통과시켜 유기물과 전질소 분석하였다. 퇴비화 과정 중에 퇴비의 부숙을 촉진하는 미생물들의 밀도를 조사하기 위해 채취한 시료는 바로 멸균용 비닐용기에 넣어 냉장 보관하에서 실험실로 가져왔으며, 희석평판법을 사용하여 당일 내로 해당 배지에 도말하였다. 이때 사용된 배지종류로는 호기성 세균의 분리배지인 yeast glucose 한천배지 (James, 1958), 방선균은 starch-casein 한천배지 (Kuster and williams, 1966), 사상균은 streptomycin 이 함유된 rose bengal 한천배지 (Martin, 1950)에 도말하였고, 배양조건은 세균과 방선균은 28℃, 사상균은 25℃에서 배양 후 계수하였다.
- 퇴비화 동안의 미생물 밀도 변화와 활성분석 1차 퇴비화가 진행된 후 30일째에 2차 퇴비화를 유도하기 위하여 분리된 활성미생물들을 접종하였다. 그 결과 Table 5에서 보는 바와 같이 접종 후 10일째 미생물의 수가 대조구보다 증가하였고, 20일에서는 대조구보다 세균은 32%, 방선균은 54% 정도 미생물의 수가 늘어난 것으로 조사되었다.
- 퇴비화 동안의 온도변화와 활성균주 처리 돈분, 계분, 폐버섯배지를 넣고 두엄형태로 쌓아 50일까지 두엄의 온도를 실시간으로 측정한 결과 Fig. 3에 보는바와 같이 1차 발효가 일어나는 20일까지의 온도가 65-76℃정도여서 선발된 균주를 접종한다면 정상적인 생육이 어려울 수 있어 1차 발효가 끝나는 시점에 분리 균주를 접종하여 2차 발효를 20일간 유도하였다. 2차 발효가 끝난 퇴비는 물리적으로 부드럽고 냄새가 나지 않는 장점을 지니고 있어 전체적으로 분리균을 접종하지 않는 대조구에 비하여 발효퇴비의 품질이 양호하였다.
- 5 with H3PO4), 유량속도는 1 mL min-1이었다. 효소액의 식물 생육촉진 효과로는 분리균주가 생산하는 효소를 콩에 처리하고 콩의 생육촉진 효과를 검정하기 위하여 표면 살균하고 petri-dish에 각 10개의 종자를 치상하였다. 이때 미리 배양해둔 분리균을 원심분리하여 상층액을 적당히 희석하여 petri-dish에 접종한 다음 25℃ 암실에서 18시간 방치한 다음 6시간마다 발아율을 측정하였다.
- 암모니아와 황화수소 가스는 시료 200 g에 1 L 부피의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 24시간 발효시킨 후, 실온에서 30일 동안 보관하면서 Gas analyser (GA2000, Geotechnical instruments, UK)와 Gastec (Gastec, Japan)으로 측정하였다. 휘발성 지방산은 퇴비를 5 L짜리 배양병에 담고 가스채취용 마개를 닫는 후 12-36시간 방치한 다음 propionic acid과 butyric acid의 함량을 가스크로마토그라피 (GC, 2010plus, Sumadzu Co.)로 분석하였다. 분석조건으로는 검출기는 FFAP, 컬럼의 온도와 유출량은 각각 10-150℃와 45 ml min-1였고, 이동상은 N2가스로 분석하였다.
대상 데이터
- 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 bacteria에 특이적으로 부착하는 27F (E. coli numbering - ; 5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1492R (E. coli numbering 1492-1510; 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′) primer를 사용하였다 (Lane, 1991).
- altitudinis (O-526) 등이 있었다. 농약 분해균으로는 B. cereus, B. tequilensis, Providencia vermicola (O-320)와 오옥신 분해균으로는 B. mariflavi (O-93), B. subtilis, B. altitudinis, B. tequilensis, B. cereus, B. licheniformis 등을 선별하였다. 이들 대부분의 균주들은 한두 개의 생리활성을 가지고 있는 것이 아니라 복합적인 활성이 존재하는 것으로 조사되었다.
- 사용된 농약은 Procymidone, Fluquinconazole, Isoprothiolane이였으며, 가스크로마토그래프 (GC, 2010 plus, Sumadzu)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 컬럼 henomenex DB5, 시료량은 1 uL, 가스는 N2 (60 mL min-1), 주입온도는 250℃ (split mode 50:1), 컬럼온도는 80-300℃ (4분), 검출기는 ECD (320℃)였다. 사용된 중금속은 비소, 카드뮴 등이 함유된 유해중금속으로, 농촌진흥청 표준분석법 (NIAST, 2000)에 준하여 실시하였다.
- 분리된 균주를 함유한 퇴비를 토양 및 축사에 넣고 농약의 분해정도 및 중금속의 경감정도를 조사하였다. 사용된 농약은 Procymidone, Fluquinconazole, Isoprothiolane이였으며, 가스크로마토그래프 (GC, 2010 plus, Sumadzu)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 컬럼 henomenex DB5, 시료량은 1 uL, 가스는 N2 (60 mL min-1), 주입온도는 250℃ (split mode 50:1), 컬럼온도는 80-300℃ (4분), 검출기는 ECD (320℃)였다.
- 생균제는 비지, 미강, 당밀이 함유된 배양배지로 미생물의 함량은 1.0×106 CFU mL-1 이상으로 제조하여 사용하였다.
- Sequencing kit는 ddNTP에 형광물질 label 방식인 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem)을 사용하였고, 반응조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분 (25 cycles)으로 하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위하여 NCBI의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 및 EzTaxon server (http:// http://147.47.212. 35:8080)을 이용하였다. 결정된 염기서열과 database에 얻어진 염기서열은 PHYDIT program (ver 3.
- 토양미생물의 분리 토착미생물의 분리는 2010년 2-12월까지 전국 6개 도의 17개 시‧ 군에서 513점의 토양시료를 채취하여 확보하였다 (Table 1). 또한 천연배지인 고두밥과 미강 및 비지에 흑설탕을 1:1로 섞어 망사에 넣은 다음 대나무와 낙엽수림 밑에서 부엽토로 덮어 7일간 방치한 후 세균, 방선균, 유산균을 추가로 분리하였다.
- 토착미생물의 분리특성 및 활성 토착미생물의 분리는 전국의 6개 도, 17개 시·군에서 총 513점의 시료를 확보하여 1,837개의 토착미생물을 분리한 내역을 Table 1에 나타내었다.
데이터처리
- 각 처리 및 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 실시한 후 p<0.05 수준에서 최소유의차 검정 [least significant difference (LSD)]을 실시하였다.
- 통계처리 모든 데이터는 통계 프로그램인 CoStat software (CoHort Software, Monterey, USA)를 사용하여 변이들을 분석하였으며, 모든 처리는 3반복으로 하였다. 각 처리 및 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 실시한 후 p<0.
이론/모형
- 유전자 서열분석용 primer는 800R, 518F 및 1055F를 사용하며, 염기서열 분석은 capillary 방식의 ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem)을 사용하였다. Sequencing kit는 ddNTP에 형광물질 label 방식인 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem)을 사용하였고, 반응조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분 (25 cycles)으로 하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위하여 NCBI의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 및 EzTaxon server (http:// http://147.
- 35:8080)을 이용하였다. 결정된 염기서열과 database에 얻어진 염기서열은 PHYDIT program (ver 3.2; http:// plaza.snu.ac.kr /~jphydit/ phydit)을 이용하여 Clustal W multiple alignment로 정렬하여 계통수 제작에 이용하였다. 염기서열간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model로 사용하여 추정하며, Neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다.
- 분석조건은 컬럼 henomenex DB5, 시료량은 1 uL, 가스는 N2 (60 mL min-1), 주입온도는 250℃ (split mode 50:1), 컬럼온도는 80-300℃ (4분), 검출기는 ECD (320℃)였다. 사용된 중금속은 비소, 카드뮴 등이 함유된 유해중금속으로, 농촌진흥청 표준분석법 (NIAST, 2000)에 준하여 실시하였다.
- 분리된 균주의 활성정도를 확인하기 위해 섬유소, 키틴, 전분, 고분자, 단백질 분해효소의 분해능을 확인하였다. 실험방법으로 섬유소 분해균은 CMCase의 활성도는 DNS방법 (Miller, 1959; Lee et al., 1999)에 의하여 CMC로부터 유리된 환원당을 측정하여 분석하였다. 효소의 활성도 1.
- 염기서열간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model로 사용하여 추정하며, Neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다.
- Temperature cycling은 GenAmpTM PCR System 9700 (Applied Biosystem)을 이용하여 predenaturation 과정을 94℃에서 3분간 수행하고, denature (94℃, 30초), annealing (50℃, 30초), elongation (72℃, 40초) 반응을 총 30회 반복하고 post-elongation (72℃, 10분)을 수행하였다. 유전자 서열분석용 primer는 800R, 518F 및 1055F를 사용하며, 염기서열 분석은 capillary 방식의 ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem)을 사용하였다. Sequencing kit는 ddNTP에 형광물질 label 방식인 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem)을 사용하였고, 반응조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분 (25 cycles)으로 하였다.
- 퇴비화 과정 중 이화학 및 미생물적 성분변화 채취된 공시퇴비 시료의 화학성 분석은 농촌진흥청 표준분석법(NIAST, 2000)에 준하여 실시하였으며, 시험전과 후의 분석시료는 음건한 다음 2 mm체를 통과시켜 유기물과 전질소 분석하였다. 퇴비화 과정 중에 퇴비의 부숙을 촉진하는 미생물들의 밀도를 조사하기 위해 채취한 시료는 바로 멸균용 비닐용기에 넣어 냉장 보관하에서 실험실로 가져왔으며, 희석평판법을 사용하여 당일 내로 해당 배지에 도말하였다.
성능/효과
- 2차 발효과정 중 10일째 총 탄소, 총 질소 및 C/N율은 Table 4에서 보는 바와 같이 유의성 (p=0.05)이 없었으나 20일째 무기성분의 두드러진 변화는 총 탄소의 함량이 대조구보다 17.2-26.3% 감소하였는데 (p<0.05) 이는 섬유소, 키틴, 전분 분해 등 활성이 뛰어난 토착미생물의 왕성한 활동에 기인한 것으로 판단되었다.
- 05)에 관한 상관관계가 인정되었다. 2차 발효과정 후 20일째에 휘발성 지방산의 일종인 propionic acid와 butyric acid는 분리균주를 접종한 처리구에서 대조구보다 지방산의 분해가 12-18% 증가하였고, 특히 C+B2 처리구에서는 18.1%정도의 감소율을 보였다 (Table 8). 이는 오일분해, 농약분해 등과 섬유소, 단백질 분해 등의 미생물들이 다양한 효소를 분비하여 악취요인 물질을 분해했기 때문인 것으로 사료되며, 그 결과로 축사 및 두엄의 악취발생을 어느 정도 막을 수 있었다.
- 다양한 기능을 가진 토착미생물을 분리·동정 후 퇴비화에 적용하여 우수한 기능성을 가진 발효퇴비를 제조하고자 하였다. 7개의 우수 토착미생물을 주축으로 3개의 발효퇴비를 제조하여 생리활성을 조사한 결과, 대두의 발아율 증가, 섬유소, 키틴, 단백질 분해 등의 생리활성이 대조구보다 뛰어나고, 오옥신 생산량이 유의적으로 증가하였다. 퇴비중 암모니아 가스와 휘발성 지방산 함량 역시 2차 발효가 시작되는 20일까지 함량 감소가 있었고, 대두의 건물수량이 증가함을 확인하였다.
- 처리구는 미생물 특성별 및 효소생성량을 기준으로 3개의 처리구를 디자인하였다. B1처리구의 미생물의 종류는 B. subtilis (O-407), B. licheniformis (O-524), B. cereus (CE), B. amyloliquefaciens, B. mariflavi (O-93), B. altitudinis (O-526), B. tequilensis (O-101), Rhizobium leguminosarum으로 8 종, B2 처리구는 B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. amyloliquefaciens, Paenibacillus pabuli, Providencia vermicola (O-320), Saccharomyces cerevisiae, Nitrosomonas europaea으로 8종, B3 처리구는 B. subtilis, B. mariflavi, Acetobacter fabarum, Serratia quinivorans, Pichia deserticola, Saccharomyces cerevisiae, Nitrosomonas europaea으로 7종이 함유되어 있다. 퇴비화과정 중 퇴비의 배양조건은 퇴비사에서 10일 간격으로 3번 뒤집어주고 30일째에 미리 제조된 생균제를 총 양의 10%가 되게 하여 혼합한 다음 20일간 더 발효하였다.
- 특히, C+B2처리구는 Procymidone처리 10일째에 대조구보다 77%정도의 분해력이 더 큰 것으로 조사되었다. Isoprothiolane의 미생물분해력은 30일째에 C+B2 처리구에서 대조구보다 62%가 높았다. Fluquinconazole은 아졸계로서 살균이 주 목적이며, 미생물분해력은 C+B1과 C+B2가 비슷한 경향을 보였다.
- 이들 대부분의 균주들은 한두 개의 생리활성을 가지고 있는 것이 아니라 복합적인 활성이 존재하는 것으로 조사되었다. O-101과 O-407의 경우, 다른 선발균주에 비하여 섬유소분해, 전분분해 등 전반적으로 다기능적인 활성을 가진 것으로 확인되었다. 이는 Han et al.
- 1차 퇴비화가 진행된 후 30일째에 2차 퇴비화를 유도하기 위하여 분리된 활성미생물들을 접종하였다. 그 결과 Table 5에서 보는 바와 같이 접종 후 10일째 미생물의 수가 대조구보다 증가하였고, 20일에서는 대조구보다 세균은 32%, 방선균은 54% 정도 미생물의 수가 늘어난 것으로 조사되었다. 그러나 곰팡이 밀도는 상대적으로 세균과 방선균 밀도가 높아짐에 따라 상대적으로 생육이 부진한 결과를 낮았다.
- 7%가 증가하였다. 그 중에서 O-526, O-101 등의 균주가 발아율이 높았으며, 이는 분리된 균주에서 활성화합물이 생성되어 대두의 발아율에 영향을 미쳤다는 것을 알 수 있었다. 포트실험에서 대두 품종별로 분리된 균주를 접종하고 30일후 수확하여 잎과 줄기의 건조무게를 측정한 결과 Fig.
- 대두 발아율과 건물수량 선발된 균주를 대상으로 식물생장촉진 효과를 조사하기 위해 대두의 발아율을 실험한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 21시간이후 물을 사용한 대조구보다 분리된 균주의 체외 효소를 이용한 처리구에서 발아율이 약 8.6-20.7%가 증가하였다. 그 중에서 O-526, O-101 등의 균주가 발아율이 높았으며, 이는 분리된 균주에서 활성화합물이 생성되어 대두의 발아율에 영향을 미쳤다는 것을 알 수 있었다.
- 몇 단계의 선별과정을 통하여 다양한 활성을 가진 50여개의 분리균을 확보하고, 이를 동정하기위해 생화학적 특성정보 확보와 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후, 염기서열의 계통 분석을 통하여 동정한 결과 Table 2에 제시된바와 같이 세균 26종, 방선균 3종, 효모 1종, 질소고정균 4종, Gammaproteo bacteria 18종 등으로 동정되었다. 동정된 미생물들은 세균류가 주류를 이루고 있었고, 동일성이 98-100%인 것으로 조사되었다. 분리된 균주를 이용하여 섬유소, 전분, 단백질, 지방을 분해하는 균주의 생리활성을 측정한 결과 Table 3에 제시된바와 같이 B.
- 퇴비중 암모니아 가스와 휘발성 지방산 함량 역시 2차 발효가 시작되는 20일까지 함량 감소가 있었고, 대두의 건물수량이 증가함을 확인하였다. 또한 식물보호제 분해시험에서도 유의적인 분해율이 있었고, 중금속 함량 역시 유의적으로 감소하였다. 따라서 토착미생물의 다 기능적 활성을 활용한 발효퇴비의 제조는 기존보다 더 향상된 발효퇴비를 농업생산 환경에 적용할 수 있을 것이다.
- 토착미생물의 분리특성 및 활성 토착미생물의 분리는 전국의 6개 도, 17개 시·군에서 총 513점의 시료를 확보하여 1,837개의 토착미생물을 분리한 내역을 Table 1에 나타내었다. 몇 단계의 선별과정을 통하여 다양한 활성을 가진 50여개의 분리균을 확보하고, 이를 동정하기위해 생화학적 특성정보 확보와 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후, 염기서열의 계통 분석을 통하여 동정한 결과 Table 2에 제시된바와 같이 세균 26종, 방선균 3종, 효모 1종, 질소고정균 4종, Gammaproteo bacteria 18종 등으로 동정되었다. 동정된 미생물들은 세균류가 주류를 이루고 있었고, 동일성이 98-100%인 것으로 조사되었다.
- 동정된 미생물들은 세균류가 주류를 이루고 있었고, 동일성이 98-100%인 것으로 조사되었다. 분리된 균주를 이용하여 섬유소, 전분, 단백질, 지방을 분해하는 균주의 생리활성을 측정한 결과 Table 3에 제시된바와 같이 B. subtilis (O-407), B. tequilensis (O-101), B. licheniformis (O-524)를 선별하였고, 키틴올리고머를 잘 분해하는 균주로는 B. licheniformis, B. subtilis, B. cereus (CE), B. tequilensis, B. altitudinis (O-526) 등이 있었다. 농약 분해균으로는 B.
- 섬유소분해 활성은 C+B1, C+B2, C+B3 모든 처리구가 대보구보다 유의성(p<0.05) 있게 차이가 있었으며, 특히 C+B3처리구가 가장 높았다.
- 식물보호제 분해 및 중금속 함량 경감 퇴비화가 끝난 발효퇴비와 농약을 혼용처리한 결과 Table 9에서 보는 바와 같이 살균제인 Procymidone의 미생물적 분해는 30일째 99%이상의 분해력을 보여 주었으나, 분리균을 사용하지 않는 대조구는 83%정도의 분해력을 보였다. 특히, C+B2처리구는 Procymidone처리 10일째에 대조구보다 77%정도의 분해력이 더 큰 것으로 조사되었다.
- 암모니아가스와 휘발성 지방산 함량변화 1차 발효 과정이 끝나는 30일째에 분리균주를 퇴비에 접종한 후 퇴비 종료 시점인 20일째에 악취의 정도를 측정한 결과, Table 7에서 보는바와 같이 대조구에 비하여 암모니아 가스 [NH3 gas (mg kg-1)]는 12-18%, 황화수소 [H2S gas (mg kg-1)]의 양이 19-38% 감소되었고, 미생물을 처리한 처리구에서 악취가 적어지는 것을 확인되었으며 이들과의 유의성 (p<0.05)에 관한 상관관계가 인정되었다.
- 오옥신 생산균에서는 전체적으로 분리균을 처리한 처리구에서 오옥신 활성이 유의적 (p<0.05)으로 증가하였으며, 특히 C+B1처리구가 높은 오옥신 생산량을 보여 작물의 성장을 촉진하는데 유용할 것으로 판단된다.
- 7개의 우수 토착미생물을 주축으로 3개의 발효퇴비를 제조하여 생리활성을 조사한 결과, 대두의 발아율 증가, 섬유소, 키틴, 단백질 분해 등의 생리활성이 대조구보다 뛰어나고, 오옥신 생산량이 유의적으로 증가하였다. 퇴비중 암모니아 가스와 휘발성 지방산 함량 역시 2차 발효가 시작되는 20일까지 함량 감소가 있었고, 대두의 건물수량이 증가함을 확인하였다. 또한 식물보호제 분해시험에서도 유의적인 분해율이 있었고, 중금속 함량 역시 유의적으로 감소하였다.
- 05)으로 증가하였으며, 특히 C+B1처리구가 높은 오옥신 생산량을 보여 작물의 성장을 촉진하는데 유용할 것으로 판단된다. 퇴비화가 진행되는 동안 퇴비내 생장촉진 물질이 얼마나 생산되었는지를 확인하기 위해 대두 씨앗을 petri-dish에 치상하여 발아시킨 결과 Fig. 4에 보는 바와 같이 21시간에서는 대조구보다 14-21%가 증가고, 그 중에 C+B1, C+B2, C+B3 처리구가 우수한 발아력을 보였다.
- 퇴비화가 끝난 발효퇴비와 농약을 혼용처리한 결과 Table 9에서 보는 바와 같이 살균제인 Procymidone의 미생물적 분해는 30일째 99%이상의 분해력을 보여 주었으나, 분리균을 사용하지 않는 대조구는 83%정도의 분해력을 보였다. 특히, C+B2처리구는 Procymidone처리 10일째에 대조구보다 77%정도의 분해력이 더 큰 것으로 조사되었다. Isoprothiolane의 미생물분해력은 30일째에 C+B2 처리구에서 대조구보다 62%가 높았다.
- 포트실험에서 대두 품종별로 분리된 균주를 접종하고 30일후 수확하여 잎과 줄기의 건조무게를 측정한 결과 Fig. 2에 보는 바와 같이 분리균을 접종한 지상부는 분리균을 접종하지 않는 상태의 대조구에 비하여 건물중의 증수효과가 있었고, 균주 O-524와 O-101 등은 유의한 수준이었다 (p<0.05).
후속연구
- 또한 식물보호제 분해시험에서도 유의적인 분해율이 있었고, 중금속 함량 역시 유의적으로 감소하였다. 따라서 토착미생물의 다 기능적 활성을 활용한 발효퇴비의 제조는 기존보다 더 향상된 발효퇴비를 농업생산 환경에 적용할 수 있을 것이다.
- 05)되었다. 앞으로 본 시험 결과를 바탕으로 토양별 및 작물별 포장시험을 수행하여 완전한 연구결과가 이루어져야 할 것이다.
- 05)을 나타내었다. 이는 퇴비발효 과정 중 분리균주가 다양한 물질을 분해하거나 유용한 물질을 많이 분비한 것으로 좋은 품질의 퇴비가 기대되었다. 오옥신 생산균에서는 전체적으로 분리균을 처리한 처리구에서 오옥신 활성이 유의적 (p<0.
- , 2003). 이와 같이 기능성을 가진 미생물을 활용한다면 난분해성 부산물의 퇴비화가 가능하고 또는 가축분으로 인한 환경오염을 감소시킬 수 있는 계기가 될 것이다. 따라서 본 연구에서는 퇴비화를 기능적으로 촉진시키거나 또는 다기능적인 역할을 할 수 있는 토착미생물을 활용하여 현재의 퇴비화 속도보다 향상되고 기능성이 뛰어난 발효퇴비를 제조하고자 하였다.
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